专利名称：一种固氮菌和含有该固氮菌的生物肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种固氮菌和含有该固氮菌的生物肥料。
自1976年巴西Dobereiner实验室报道从禾本科植物根际分离得固氮螺菌(Azospirillum spp)，并测定固氮螺菌对宿主的氮素供应达2KgN-ha-1 d-1(后来的研究表明由于测定方法的问题，此数值偏高)。激起世界范围的研究热。各研究组相继从禾本科作物根际分离多种固氮菌(统称联合固氮菌)包括肠杆菌科、固氮菌科、芽孢杆菌科、假单孢菌科、螺菌科的细菌。但研究最多的还是固氮螺菌，大量的文献报导固氮螺菌的生理，生化及遗传特性并用固氮螺菌在田间做了大量的接种实验。目前国际上固氮微生物制剂商业产品中最主要的是根瘤菌。以联合固氮菌Azospirillum为主要商业产品只有法国的Azogreen TM，意大利、法国、比利时联合生产的Zea-Net TM，美国的Azo-Green墨西哥的Biofertilizonepara Maiz.这些产品商业规模都不大。1993年在乌拉圭召开以固氮螺菌的农业应用为题的国际研讨会总结了20年来用固氮螺菌的田间接种实验，由此研讨会总结的资料可反映出联合固氮菌在田间接种的概况。20年的实验表明在不同地区和气侯条件下接种联合固氮菌对农业上一些重要作物如玉米、水稻、小麦是有增产作用的，虽然很难精确估计接种实验成功的百分数，用统计学上有意义的增产率5-30％计算，实验的成功率在60-70％(有些失败的试验未报道)。但至今接种实验所用的菌株都是野生型菌株。在中国用野生型联合固氮菌研制的菌剂产品名目繁多，良莠参杂，据统计生产生物菌肥的厂家不下300家。应用菌株主要是肠杆菌科的联合固氮菌Klebsiella pneumoniae，芽胞杆菌及根瘤菌。生产量最多并形成产品的有保定微生物所生产的小麦根际联合固氮菌剂，玉米根际联合固氮菌剂，推广面积达几百万亩，但由于增产效果不稳定已停产。经中国专利信息中心计算机检索从1980-1994年11月国内外没有有关联合固氮菌菌肥专利的报道。
田间接种成功受很多因素影响，它依赖于起始细菌的特性，植物品种、土壤类型、接种量和环境条件，而要更好的发挥接种微生物的作用，其中一个重要环节是研究接种剂的配方，(包括菌和载体)以提供一个合适的微环境以保证在产品贮存、运输、施用到土壤后，接种微生物的存活率。联合固氮菌多数是非芽胞杆菌在土壤中存活率低对菌剂中保持菌种存活率的条件要求亦更高。以草炭作为接种剂载体10年前在根瘤菌制剂上已得到成功，并广泛得到应用。由于草炭是一不确定的复杂有机物，使制造、贮存，应用过程有很大变异性，近10年有很多关于新的合成聚合物和天然聚合物用作为微生物包裹剂，用这些聚合物包裹的细菌细胞制成新型的微生物制剂，改进了传统草炭菌剂的缺点，大大提高了微生物接种剂的在土壤中存活率，抗干旱能力和生物效益，是很有潜力的，如法国的Azogreen TM但这类产品仍存在价格高，制作难度大，对产业化设备要求高的问题。同时很多研究亦表明混合接种剂(多种微生物组合)对植物的效应优于单一菌种，这也是微生物菌剂生产的一种趋势。
本发明的一个目的是筛选一种新的具有更好的固氮效果的固氮菌。
本发明的另一个目的是提供一种含有本发明的新的固氮菌的生物肥料。
本发明人筛选到一种新的联合固氮菌，日勾维肠杆菌(Enterobactergergoviae)57-7，并在中国微生物军种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏(保藏中心地址中国，北京，中关村，邮政编码100080)，保藏号为CGMCC No.0510。保藏日为2000年11月28日。
Enterobacter gergoviae57-7特性Enterobacter gergoviae 57-7属肠杆菌科肠杆菌属(Enterrobacteriaceae)革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，E.gergoviae 57-7是从四川灌县玉米根分离到的183株在无氮培养基中能生长的菌株中固氮活性最高(用乙炔还原法测定)的菌株，分类位置是由中科院微生物所分类室周慧玲先生鉴定并命名。
E.gergoviae 57-7为革兰氏阴性发酵型固氮菌。细胞呈短杆状，周生鞭毛，运动，利用葡萄糖，乳酸产气。从粘液酸不产酸，脲酶(+)，鸟氨酸脱羧酶(+)，赖氨酸脱羧酶(+)，苯丙氨酸脱羧酶(-)，脱氨酸脱羧酶(-)，吲哚(-)精氨酸双水解酶(-)，脱氧核糖核酸酶(-)，甲基红(-)，VP试验(+)，在10℃生长，利用柠檬酸盐生长。经Rep-PCR基因组指纹图谱分析得到E57-7的特征图谱。
E.gergoviae 57-7在无机盐无氮培养基上生长良好，生长PH范围为5-8.0生长最适温度30℃，35℃以上生长受明显抑制。在改良的KP培养中E.gergoviae57-7固氮活性在培养15小时后达到高峰。活性可达8354n mol C2H4/mg蛋白小时，随菌体生长培养基变酸，NH4+抑制固氮酶合成，但固氮酶形成后固氮酶活性不受NH4+抑制，表明E.gergoviae 57-7中不存在固氮酶的翻译后修饰机制。
E.gergoviae 57-7含有一分子量300Kb的大质粒。而固氮基因簇定位于染色体。DNA杂交及nifHlacz活性测定表明E.gergoviae 57-7含有与模式菌K.pneunoniae相似的nifHDK及nifA基因，E.gergoviae 57-7nifA基因活化nifHlacz的能力与NH4+和氧有关。
E.gergoviae 57-7中类似nifA基因的产物对nifHlacZ融合子表达的影响
E.gergoviae 57-7能分泌IAA、GA等植物激素Enterobacter gergoviae 57-7及E7分泌植物激素(kp液体培养基)菌株 植物激素分泌量(μg/ml.OD660＝1.0)Enterobacter gergoviae 吲哚乙酸IAA赤霉素GA3玉米素Z野生型57-70.027 0.0230.057工程菌E7 0.023 0.0230.044用扫描电镜观察及用标记基因gfp标记E.gergoviae57-7，在荧光显微镜下观察E.gergoviae 57-7在玉米根部的定殖表明，E.gergoviae 57-7主要定殖在根毛区及次生根裂隙处，显微镜观察免疫金银染色的石蜡切片发现E.gergoviae 57-7能侵入玉米根内在根皮层细胞间隙甚至木质部导管内定殖。E.gergoviae 57-7依靠植物根分泌的营养物繁延，随根系的生长而扩展，亦能定殖于根际土壤依靠植物的残片生存。可以在土壤中运动和通过流水或尘土传播。在55℃高温或0℃以下低温细菌容易死亡。E.gergoviae亦可在动物粪便、污水、土壤中找到，是正常的肠道宿居菌。经中国预防科学院流行病学微生物学研究所检验E.gergoviae 57-7为非致病性病原体(表4)。肠杆菌科肠杆菌属的固氮细菌在世界各地不同生态环境均有分布，并有不少利用这类固氮菌为研究材料的报道，但用日勾维肠杆菌作研究材料的报道仅限本实验室和中国医科大学协和医学院临床实验室。本实验室首次报导E.gergoviae的固氮能力及应用。中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所对E.gergoviae 57-7进行致病性检测，检测结论本检测菌株为非致病性病原体。中科院遗传所动物实验中心用E.gergoviae 57-7活菌和死菌从肌肉和静脉注射大白免证明E.gergoviae 57-7无致死和致病性。
本发明还提供了一种生物肥料，它含有本发明的日勾维肠杆菌。这种生物肥料所使用的载体可以是草炭。
KP培养基配方Na2HPO4.12H2O 32g/LKH2PO40.68g/L PH8.0柠檬酸铁36mg/LMgSO430mg/LCaCl2.2H2O26mg/LMnSO40.3mg/LNa2MoO4.2H2O7.6mg/L蔗糖20g/L酵母粉 0.5g/L草炭菌剂采用拌种，做底肥或拌种加底肥，三种施用方法在正常施肥条件下三种施用方法皆比无菌对照有增产作用。
按增产幅度计算拌种加做底肥＞做底肥＞拌种。施用量为1kg/666.7m2，5×107CFU/种子。
接种E.gergoviae57-7对玉米的影响以1997年宝泉岭农场试验为例，在砂壤土的田间小区接种试验结果表明，玉米接种野生型菌和无菌载体相比，在不同生育期地上部分、地下部分干重皆有增加，这种效应在苗期比较明显。
在土壤肥力较低的白浆土，砂壤土及黑土、黑钙土中接种E57-7对玉米产量的影响皆优于无菌载体，但增产的幅度与土质有明显相关性。在土壤肥力较低的白浆土、砂壤土中，不论施用化肥量为16.8kg/666.7m2或20kg/666.7m2，接种E57-7比无菌载体增产平均幅度达到4.2％，在黑土及黑钙土试验田，接种E57-7比无菌载体增产平均幅度达到9.2％。
权利要求
1.一种联合固氮菌，日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)57-7，保藏号为CGMCC No.0510。
2.一种生物肥料，它含有权利要求1所述的固氮菌。
3.按照权利要求1所述的生物肥料，它还含有草炭。
全文摘要
本发明提供了一种联合固氮菌,日勾维肠杆菌(Enterobactergergoviae)57－7,保藏号为:CGMCC No.0510。本发明还提供了一种生物肥料,它含有本发明的固氮菌。本发明的生物肥料中所使用的载体可以是草炭。
文档编号C05F11/00GK1355293SQ0013362
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月29日 优先权日2000年11月29日
发明者李永兴, 李久蒂, 王继文 申请人:中国科学院植物研究所