专利名称：协同的昆虫控制方法
通过化学手段控制昆虫害虫长期以来一直是一种有用的保护农作物免受昆虫攻击和侵袭所造成的损伤的方法。更近来，引入了特异性针对靶昆虫的控制昆虫对作物破坏的方法，该方法避免了与使用传统杀虫剂相关的环境和生态危害。这些方法中的一种使用了可产生昆虫特异性毒素，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Cry毒素的遗传修饰作物。然而，表达苏云金芽孢杆菌Cry毒素的作物可能对大量的鳞翅目害虫物种表现出不同程度的防御作用。例如，表达CryIA(c)的棉花品种对烟草夜蛾幼虫，即烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)，有极高的抗性，但对棉铃虫谷实夜蛾(Helicoverpa zea)仅有中等程度的抗性(J.H.Benedict等，1996，Journal ofEconomic Entomology，第89卷(1)，第230页)。
另一个控制昆虫的此类方法是应用生物制剂例如核多角体病毒(NPV)(美国专利4,668,511)、或重组核多角体病毒(rNPV)(美国专利5,662,897和美国专利5,858,353)。然而，NPV和rNPV针对各种昆虫物种的毒力/效力水平，可以根据携带病毒的药剂的宿主范围和插入基因所编码的毒素的效力而不同。例如，昆虫物种谷实夜蛾对分别命名为HzNPV和HzAaIT的NPV和rNPV高度敏感，但对苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV(AcNPV)或其rNPV，即AcAaIT仅具中等敏感性(Treacy等，1999，Proceeding Beltwide Cotton Conf.，第1076-1083页)。尽管将含有对靶昆虫物种具有中毒毒性的载体的重组核多角体病毒应用于转基因作物品系的组合已有描述(All and Treacy，1997，Proceedings Beltwide Cotton Conf.第1294页)，但该转基因作物和rNPV剂无论单独还是组合在一起均没有提供商业规模上防止作物损失所需的昆虫控制水平。
因此，本发明的目的是提供对防止作物破坏和由此造成的经济损失有用的协同昆虫控制方法。
本发明的另一目的是提供增强转基因作物防御昆虫攻击和侵袭所造成的毁坏和破坏的方法。
本发明的一个特征是所提供的协同昆虫控制和作物保护方法是特异针对靶昆虫物种的，并表现出具有增强的环境和生态相容性，同时还提供了商业可接受水平的昆虫控制和作物保护。
从以下描述和所附权利要求，本发明的其它目的和特征对于本领域技术人员将是明显的。
本发明提供协同控制昆虫的方法，包括向转基因作物区域施用协同有效量的含有对所述昆虫具有强毒性的载体的重组昆虫病毒。
本发明还提供增强转基因作物防御昆虫攻击和侵袭所造成的破坏的方法。
尽管化学法控制害虫一直是一种控制重要的农业昆虫害虫的有效手段，但已引入了更多的具有靶昆虫特异性的控制方法。在这些昆虫特异性方法中包括使用通过遗传改变产生昆虫毒素如苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的转基因作物、或使用天然病毒如核多角体病毒(NPV)或重组NPV(rNPV)。然而，产生Bt毒素的转基因作物可能会表现出较不令人满意的对靶昆虫的防御程度。类似地，天然和重组的昆虫病毒当作为控制昆虫的单独方法使用时，通常也表现出不同程度的效力。
尽管对含有对靶昆虫物种具有中等毒性的载体的rNPV与转基因作物的组合使用已有描述，但是，在单独使用所述rNPV或在将所述rNPV与经遗传改变产生昆虫毒素的转基因作物一起使用时，并没有获得对于商业昆虫控制而言令人满意的结果。
现在已发现，给转基因作物，优选经遗传改变产生昆虫毒素(杀昆虫剂)的转基因作物，施用含有对靶昆虫物种具有强毒性的载体的重组昆虫病毒，显示出显著的协同作用(即，所获得的昆虫控制效果比单独使用毒性重组昆虫病毒时或单独使用转基因作物时能够预期的昆虫控制效果要高得多)。这种协同作用使得能够通过非化学的生物学手段实现商业有用水平的昆虫控制。而且，本发明的协同昆虫控制方法使得可以实现与环境和生态上合理的可持续农业实践活动相适应的有效抗性控制。
根据本发明方法，向转基因作物品种，优选经遗传改变产生昆虫毒素的转基因作物，施用协同有效量的含有对靶昆虫物种具有强毒性的载体的重组昆虫病毒，优选重组核多角体病毒(rNPV)，提供了对昆虫害虫的协同控制。即，向该转基因作物施用该毒性重组昆虫病毒导致杀昆虫成份的组合产生比单独地施用各杀昆虫成份所能预期到的杀昆虫效果要强的杀昆虫效果(协同效果)。
适用于本发明方法的含有强毒性载体的重组昆虫病毒包括rNPV如HzNPV、HzAzIT、EGTdel或它们的组合。
适用于本发明方法的产生昆虫毒素的转基因作物包括表达Bt的玉米和棉花品系(BTK系)，例如NuCotn 33BTM(一种通过BollgardTM转化事件来自于Deltapine DP5415TM的转基因棉花品种)，或转基因玉米品种如表达MON 810TM转化事件的那些(YieldGardTM，Monsanto Co.)。
在实际的操作中，可以以配制组合物的形式，例如可润湿粉末，将该毒性重组昆虫病毒施用于转基因作物，尤其是通过遗传改变产生昆虫毒素的转基因作物的区域、叶或茎上，优选叶上。优选的制剂描述在1998年6月9日提交的共同待决美国专利申请系列号09/094,279(并入本文作为参考)上。
毒性重组昆虫病毒的协同有效量可以根据主要的条件，例如转基因作物的昆虫抗性程度、施用的时间选择、天气情况、施用模式、昆虫群体的密度、靶作物物种、靶昆虫物种等来改变。一般地，当以每公顷1×1010个包含体(OB/ha)至1×1013OB/ha，优选5×1010OB/ha至12×1011OB/ha的比例向转基因作物施用毒性重组昆虫病毒时，可以获得协同的昆虫控制。
为了利于对本发明的进一步理解，给出以下实施例，主要用于举例说明其更为具体的细节。除了权利要求中所定义的，不应由此认为对本发明构成限制。
在以下实施例中，通过Colby法(Colby，S.R.，Weeds，1967(15)，第20-22页)确定双途径杀虫剂组合的协同作用，即，通过对单独使用每个杀昆虫成份所得的结果求和，然后减去这两个结果的乘积除以100后的值，计算出该组合的预期(或预测)结果(消灭的昆虫的百分数)。这通过算术方式描述如下，其中双途径组合由组份X加上组份Y组成。 如果实际观察结果大于从该公式计算出的预期结果时，即存在协同作用。
在本发明中，相对于密切相关的对照作物本发明的转基因作物表现出的昆虫控制百分数(不施用外在的杀虫剂)可以表示为X；当用于对照作物上时本发明重组昆虫病毒的控制百分数可以表示为Y。可以使用前述Colby公式计算病毒和转基因作物组合后的预期控制百分数。如果由使用病毒处理转基因作物的组合获得的观察结果(实际的控制百分数)大于计算出的预期结果时，则该组合具有协同作用。
在装有商业盆栽土的3.8升塑料盆中从种子培养出植株。为了比较的目的，将常规Deltapine DP54151棉花包括在内。在棉花栽种期后约1.5个月始向棉花施用病毒。在安装有吊挂旋转式喷水器的封闭室中喷洒植物。该喷水器配有三个中空锥形喷嘴(TX3，Spraying Systems，Wheaton，IL)；一个喷嘴设置用于直接向植物上进行喷洒，而两个喷嘴装在倾斜约45°角的下垂管上以喷洒植物的侧面。调节该喷水器的口径以按3.5kg/cm2的量递送189升/ha；使用压缩空气作为喷洒推进物。将配制的rNPV杀虫剂按3.5L/ha连同味觉刺激剂CoaxTM(CCT Corp.，Carlsbad，CA)一起悬浮在去氯水中。每隔7天喷洒植物3次。在平面顶上以完全随机的设计排列盆栽棉花植物，重复四次，而且所述平面顶覆盖有约2cm深的水以防止幼虫在植物之间迁移。给予每次处理的两株植物相同的剂量，从独立的测试中采取相同的子样品。在研究过程中温室的环境参数设定为平均每天最低温度约27℃，而平均每天最高温度为约32℃。
用实验室培养的谷实夜蛾幼虫在每次喷洒期后约1小时感染植物。使用小漆刷将幼虫放置在每株棉花植物整个上部份的叶和棉蕾上。在三次喷洒期的每一期后在每株植物上放置总共30只新鲜孵育的幼虫。设计在植物上人为放置幼虫的方式，以便接近该害虫物种的虫卵和小幼虫在棉花上的天然分布(Farrar和Bradley，1985，Environ.Entomol.)。在第3次施用期后7天，通过记录每株植物的受损和未受损棉蕾数，确定对棉花进行的这些处理的效率。通过方差分析(ANOVA，SAS Institute，1989)，就谷实夜蛾对棉花的损伤，确定这些处理之间的显著差异。通过Duncan的多排列测试(Duncan’s multiple range tests)(DMRT；SAS Institute，1989)，区分处理的平均值。
按Duncan的多排列测试所测定的，相同字母前的平均值没有显著差异(P＜0.05；F[df5，18]＝16.9)；将百分点数据进行反正弦变换用于分析。
在最后的施用/感染期后7天(7DA3T＝第3次处理施用后7天)，评价每株植物上受损和未受损的棉蕾数。结果在此温室研究中，每周感染谷实夜蛾幼虫造成未处理的DP5415棉花(敏感性的)比未处理的NuCotn 33B(抗性的)受到显著大得多的破坏，(分别有53.0％和20.8％的受损棉蕾)。以5×1011OB/ha和12×1011OB/ha的用量叶上施用HzAaIT显著降低了昆虫对两个棉花品种的破坏。当用HzAaIT按5×1011OB/ha和12×1011OB/ha进行处理时，敏感性植物品种DP5415分别产生27.6％和23.9％的平均受损棉蕾数。当用HzAaIT按5×1011OB/ha和12×1011OB/ha进行处理时，抗性植物品种NuCotn33B分别产生8.8％和5.0％的平均受损棉蕾数。数据显示在表1中。
正如可以从表1的数据中看到的，与昆虫对未处理的转基因作物的破坏相比，以12×1011OB/ha的用量向转基因作物(NuCotn33B)叶部施用毒性重组昆虫病毒(HzAaIT)使昆虫的破坏程度下降了4.2倍，而与未处理的敏感性作物相比，以12×1011OB/ha的用量向敏感性作物(DP5415)施用所述毒性重组昆虫病毒仅使昆虫的破坏程度下降2.2倍。因此，将毒性重组昆虫病毒应用于转基因作物的组合方法使昆虫的破坏程度，比单独施用该毒性重组昆虫病毒或单独使用转基因作物所能预期到的昆虫破坏程度低了约2倍。
表1通过叶部施用重组核多角体病毒HzNPV(Egtdel)/DA26-ADK-AaIT(HaZaIT)控制常规和转基因棉花品种上的棉铃虫、烟蚜夜蛾
1按Duncan的多排列所确定的，相同字母前的平均值没有显著差异(P＜0.05；F[df 5，18]＝16.9)；将百分点数据进行反正弦变换用于分析。2
*协同作用＝观察值＞预期值
权利要求
1.协同控制昆虫的方法，包括向产生昆虫毒素的转基因作物的区域、叶或茎施用协同有效量的含有对所述昆虫具有强毒性的载体的重组昆虫病毒。
2.根据权利要求1的方法，其中所述重组病毒是重组核多角体病毒。
3.根据权利要求2的方法，其中所述重组病毒是HzNPV、HzAIT、EGTdel或它们的组合。
4.根据权利要求1的方法，其中所述转基因作物是经遗传改变表达苏云金芽孢杆菌毒素的作物植株。
5.根据权利要求4的方法，其中所述转基因作物是玉米。
6.根据权利要求4的方法，其中所述转基因作物是棉花。
7.根据权利要求6的方法，其中所述作物是NuCotn 33B。
8.根据权利要求2的方法，其中所述重组昆虫病毒的协同有效量是1×1010OB/ha至1×1013OB/ha。
9.根据权利要求8的方法，其中昆虫是鳞翅目昆虫。
10.根据权利要求9的方法，其中昆虫是谷实夜蛾。
全文摘要
本发明提供协同控制昆虫的方法，包括向产生昆虫毒素的转基因作物的区域施用协同有效量的含有对所述昆虫具有强毒性的载体的重组昆虫病毒。
文档编号A01H5/00GK1420725SQ00818240
公开日2003年5月28日 申请日期2000年12月21日 优先权日2000年1月7日
发明者M·F·特里西 申请人:巴斯福股份公司