专利名称：来源于稻的高表达型多肽链延长因子启动子及其使用方法
技术领域：
本发明涉及有用植物的育种，其中使用植物基因的启动子。更详细地说，涉及有用植物的育种，其中使用稻的多肽链延长因子β1(以下称为OsEF1β1)基因的启动子。
背景技术：
近年来，为了赋予植物所需的性质，一般是在植物中导入所需的基因，使之表达。但是，这种表达在植物的生长和发育阶段会发生变化，例如虽然在植物幼小时期进行表达，但是随着不断生长和发育，有时表达会减弱。因此，需要一种启动子，其能够稳定地表达导入的基因，而与植物的生长和发育阶段无关。
多肽链延长因子是与核糖体中的氨基酸聚合反应有关的因子，在进行蛋白质合成的细胞中进行表达。在Arabidopsis thaliana中构筑使多肽链延长因子1β(eEF-1β)的启动子区域和5’末端区域以及β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因融合的嵌合基因，使用其考察转基因植物中该基因的表达(Gene，170，(1996)201-206)。发现该基因的第1内含子必须高水平表达。该试验表明Arabidopsis thaliana的eEF-1β的第1内含子中可以存在增强子样的元件。
关于稻的多肽链延长因子的研究，在FEBS Letters 311(1992)46-48；FEBS Letters 338(1994)103-106；以及Biochemica etBiophysica Acta 1442(1998)369-372中有报道。FEBS Letters 311(1992)46-48报道了编码稻多肽链延长因子1β’(EF-1β’)的cDNA的克隆和分离，FEBS Letters 338(1994)103-106报道了编码稻多肽链延长因子1β(EF-1β)的cDNA的克隆和分离，而且Biochemicaet Biophysica Acta 1442(1998)369-372报道了稻多肽链延长因子1β(EF-1β)形成的多基因家族的新型基因EF-1β2的分离和特征。但是，任何一篇文献都仅仅与多肽延长因子家族的其它成员进行了序列比较，而没有提到启动子活性。
因此，如果能够由稻的基因取得一种用于表达的启动子，该启动子与植物的生长和发育阶段无关，持久，且活性高，能够实际使用，那么将会对包括稻等作物在内的有用植物的品种改良做出巨大贡献。
发明公开本发明涉及利用基因工程学方法的植物育种，其目的在于提供一种强烈促进在植物组织中表达的植物基因启动子，及含有该启动子的表达载体，以及其利用方法。
本发明人发现稻的多肽链延长因子基因(OsEF1β1)持久地显示非常高的启动子活性，基于这一发现完成了本发明。
本发明提供一种DNA，其具有在植物组织中使异种基因强烈表达的启动子活性。该DNA是具有序列号1(图2A～C)表示的序列或其一部分，且具有与序列号1的序列同等的启动子活性的DNA。其中，序列号1表示的序列包括稻OsEF1β1结构基因的5’上游区域、第1外显子、第1内含子和第2外显子的一部分。在本发明的1种实施方式中，本发明的启动子能够在生长分裂组织中特异地促进异种基因的表达。在本发明的一种实施方式中，该DNA在严紧条件下，与具有序列号1记载的序列或其一部分的多核苷酸杂交。
本发明还提供一种用于在植物组织中使异种基因强烈表达的表达载体。该表达载体包括稻OsEF1β1基因启动子，其具有序列号1表示的序列或其一部分，且具有与序列号1的序列同等的启动子活性，而且该表达载体还包括与该启动子能够表达地连结的异种基因。本发明还提供通过上述表达载体进行性状转化得到的植物细胞(可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞)、由该植物细胞再生的植物体、该植物体的后代及传播体、以及由该后代得到的种子。
本发明还提供在植物中导入希望在植物组织中表达的异种基因的方法。该方法包括下述步骤用上述表达载体使植物细胞进行性状转化的步骤，以及使进行了这种性状转化的植物细胞进行再分化，得到植物体的步骤。在上述方法中，植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞中任意一种。
图1表示λOsEF1β1插入片段的限制图。
图2A～C是表示OsEF1β1的5’末端区域的序列的图。图中，“n”表示A、T、C或G。图中，大写字母对应的碱基表示外显子部位(1671位～1876位以及2639位～2651位)。
图3是表示OsEF1β1GUS融合构建物的模式图。
图4是表示本发明的性状转化植物以及用含有35S启动子作为启动子的载体进行性状转化得到的对照植物中各组织的GUS组织染色结果的照片。
发明的最佳实施方式以下更详细地说明本发明。
(稻OsEF1β1基因启动子的分离)稻OsEF1β1基因启动子由稻的基因组文库筛选得到。可以使用美国CLONTECH公司(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)市售的稻基因组DNA文库(Rice Genomic Library)。
作为筛选用的探针，可以使用本发明人分离得到的稻OsEF1β1cDNA。
首先，使大肠杆菌感染用噬菌体λ制作的稻基因组基因文库，形成噬斑。按照常规方法将该噬斑移至硝酸纤维素等的膜上，用标记后的筛选用探针进行杂交。杂交结束后，洗涤，进行放射自显影，由确认杂交的噬菌体制备DNA。
组合适当的限制酶对制备的噬菌体DNA进行消化，通过凝胶电泳分离其消化产物。将分离的DNA片段移至尼龙薄膜上，使之杂交上述筛选用探针，根据信号强度和谱带图案的差异进行筛选。
认为信号最强的无性系含有OsEF1β1基因，信号弱的无性系含有的基因与OsEF1β1类似，但不是OsEF1β1。另外，通过谱带图案的比较，能够识别缺失部分基因的无性系。而且，通过制作以谱带图案为基础的各种无性系的物理地图，可以确定推测构成启动子的结构基因5’上游的长度为约1.6Kbp左右的无性系。
如上所述，分离得到完全的OsEF1β1基因组基因。
通过比较OsEF1β1基因组基因的碱基序列和OsEF1β1 cDNA的碱基序列，可以确定启动子区域。作为启动子序列，基因组基因具有内含子时，不仅可以含有结构基因的5’上游区域，也可以含有第1内含子等区域。本启动子序列优选序列号1表示的序列(也参照图2A～C；序列号1和图2表示的序列中，“n”表示腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞苷(C)中任意一种)。序列号表示的序列包括稻OsEF1β1结构基因的5’上游、第1外显子、第1内含子和第2外显子。
(通过GUS活性测定确定启动子活性部分)如果能够确定OsEF1β1基因的启动子区域，则可以切出其序列，连结到植物表达用载体中。为了评价连结的启动子的活性，可以制作在该启动子的下游连结了报道基因例如编码适当酶的基因的质粒。将该质粒引入到植物细胞中，测定、观察基因的表达，例如酶活性。以植物作为宿主的场合，一般例如使用pBI101等质粒，以β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的表达作为指标进行测定，在本说明书中，也可以适用通过GUS的表达进行测定的方法。
GUS活性采用例如植物细胞工学，第4卷，第4号，281～286页(1992)，植物细胞工学，第5卷，第5号，407～413页(1992)，Plant Mole.Biol.Reporter 5(4)387-405(1987)记载的顺序进行测定，但测定方法并不限于此。简单而言，将植物体的各组织或切片浸渍于含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)、7％(v/v)甲醇以及50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)的组织化学基质溶液中，接着以适合进行反应的温度和时间(例如引入CaMV启动子等和GUS的融合基因时，37℃下30分钟～4小时)进行温育。为了防止褐变以及GUS惰化，可以添加二硫苏糖醇(DTT)等还原剂。例如可以在刚刚切出后、(制作切片时)琼脂包埋阶段、切削的过程中或切片的减压脱气时添加2mM DTT。另外，5mM浓度的DTT可以在37℃的GUS反应时添加。接着，添加乙醇使反应停止，使之脱色，接着在显微镜或实体显微镜下观察组织或切片。
使用OsEF1β1基因的启动子区域的各种缺失体，例如5’上游侧起以各种长度缺失的OsEF1β1基因的启动子区域，与GUS基因融合得到的质粒，测定启动子活性，可以确定其活性所必须的部分等。用于确定这种活性部分的方法，对于本领域技术人员来说是公知的。因此，例如除去OsEF1β1基因的启动子区域中不需要的序列得到的具有与OsEF1β1基因的启动子同等活性的序列也包括在本发明的范围内。
一旦确定了OsEF1β1基因的启动子区域及其活性部分，也能够进一步改变其序列，提高启动子活性，或者使表达的组织改变特异性。例如，对OsEF1β1基因的启动子区域或其活性部分部分改变而得到的具有与改变前同等活性的序列也包括在本发明的范围内。
具有序列号1(图2A～C)的序列的启动子区域在植物组织中强烈表达其活性。因此，在本说明书中，关于启动子活性，“强烈”是指活性的强度至少与以前的启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂氨酸合成酶的启动子等)相比，为同等倍数以上，优选2倍以上，更优选5倍以上，进一步优选10倍以上的强度。这种强度可以通过GUS活性测定方法进行测定。
本发明的启动子可以在植物的生长分裂组织中特异地促进异种基因的表达。在本说明书中，在生长分裂组织中“特异地”促进异种基因的表达是指在生长分裂组织中，与相同植物体的其它组织或器官的至少1种相比，更高地促进目的基因的表达。“生长分裂组织”是指细胞分裂旺盛，且蛋白质合成高的任意组织。通过本发明的启动子，异种基因在例如茎顶端、根端部等生长点组织中强烈表达。通常，植物的最上部的分裂组织在某一期间内形成茎和叶，茎伸长，且叶展开。最下部的分裂组织，其一生仅仅是形成根。利用本发明启动子的异种基因表达，特别是在分裂组织中能够得以促进。这种表达特异性可以通过在与本说明书的下述实施例同样的条件下制作性状转化植物进行评价。
本发明的植物启动子也可以使异种稳定地表达，其表达与植物的生长和发育阶段无关。也就是说，在植物的整个营养生长期，均可使异种基因表达。这种表达的恒定性也可以通过在与本说明书的下述实施例同样的条件下制作性状转化植物进行评价。
另外，在本说明书中，关于启动子活性，“同等”是指活性的强度至少与作为基准的启动子区域的活性强度程度相同，同时活性的特异性也至少与作为标准的启动子区域的活性的特异性程度相同。需要注意的是，用语“同等”并不是要排除活性的强度和活性的特异性与作为基准的启动子区域相比明显高的场合。“具有与序列号1的序列同等的启动子活性”是指，例如在与本说明书的下述实施例同样的条件下使GUS基因在原生质体中表达时，其GUS活性为序列号1的序列相关的GUS活性的约50％以上，优选约70％以上，更优选约90％以上。
本发明的范围内含有的序列可以含有与OsEF1β1基因的启动子区域或其活性部分在严紧条件下杂交的序列。本说明书中使用的“严紧的杂交条件”或“严紧性”是指低于对靶具有正确的或几乎正确的互补性的靶序列以及探针的融解温度(Tm)，约5℃～约20℃或25℃的条件。本说明书中使用的融解温度是双链核酸分子的群体半解离形成单链的温度。计算核酸的Tm的方法是本领域公知的(例如，Berger和Kimmel(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.152GUIDE TOMOLECULAR CLONING TECHNIQUES，San DiegoAcademic Press，Inc.以及Sambrooks等，(1989)MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，第2版，第1-3卷Cold Spring Harbor Laboratory，以后简称为“Sambrook”)(均在本说明书中作为参考援引)。如标准文献说明的那样，核酸存在于1M NaCl水溶液中时，Tm的简单估算可以通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算。(例如，参照Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION(1985))。其它文献包括Tm计算中考虑结构和序列特征的更精细的计算。杂交体的融解温度(进而与严紧杂交有关的条件)受探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组合物)及靶的性质(溶液中存在的或固定后的DNA、RNA、碱基组合物)，以及盐和其它成分的浓度(例如甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、乙二醇的存在和不存在)等各种因子影响。这些因子的影响是众所周知的，可以在本领域的标准文献中查到。例如参照Sambrook(如上所述)和Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1997)。典型的是，严紧的杂交条件为pH7.0～8.3的低于约1.0M的钠离子盐浓度，优选约0.01～1.0M的钠离子的盐浓度，而且对于短探针(例如10～50核苷酸)为至少约30℃的温度，对于长探针(例如，超过50的核苷酸)为至少约60℃的温度。如上所述，严紧的条件可以通过添加甲酰胺等去稳定剂实现，这时可以采用更低的温度。例如2个多核苷酸，当它们在严紧的杂交条件下能够相互特异地进行杂交时，可以鉴定为具有实质上的序列同一性。本说明书中使用的用语“实质上的同一性”、“实质上的序列同一性”或“实质上的相似性”，在核酸的情况下，是指2个多核苷酸间的序列类似性的尺度。或者，实质上的序列同一性可以记载为2个核苷酸(或多肽)序列间的百分同一性。2个序列在至少约60％相同时，优选至少约70％相同时，或者至少约80％相同时，或者至少约90％相同时，或者至少约95％或98％～100％相同时，认为是实质上相同。序列同一性的其它程度(例如低于“实质上”的程度)，可以通过不同的严紧条件下的杂交赋予特征。序列(核苷酸或氨基酸)的百分同一性，典型地可以通过下述方法求得，即确定2个序列间的最适对比排列，然后对2个序列进行比较。例如在蛋白质表达中使用的外因性转录物可以记载为具有与参照序列(例如对应的内因性序列)比较得到的同一性或相似性的特定百分比。序列的最适对比可以通过下述方法进行，即，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性对比算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的用于相似性方法的检索，这些算法的计算机实施(Wisconsin Cenetics Software Package，Cenetics ComputerGroup，575 Science Dr.、Madison、WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者使用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法进行检验。选择通过各种方法得到的最优的对比排列(即，同一性达到最高百分比)。典型的是，这些算法在“比较窗口”(通常为至少18个核苷酸的长度)内对2个序列进行比较，鉴定和比较序列相似性的局部区域，因此能够有小的添加或缺失(即，缺口)。添加或缺失典型地是相对于没有添加或缺失的参照序列为序列的20％以下的长度。通常优选参照特定的长度或区域，记载2个序列间的序列同一性(例如2个序列可以记载为在至少500个碱基对的长度范围具有至少95％的同一性)。通常长度至少为约50、100、200、300、400或500个碱基对、氨基酸或其它残基。序列同一性的百分比可以通过下述方法计算对于在比较的区域内最适对比排列的2个序列进行比较的步骤；确定相同核酸碱基(例如A、T、C、G或U)生成两个序列的位置数，得到吻合的位置数，接着与参照序列或比较区域的碱基总数比较，确定吻合的位置数(或百分比)的步骤。适于测定序列相似性的其它算法是BLAST算法，记载于Altschul(1990)J.Mol.Biol.215403-410；以及Shpaer(1996)Genomics 38179-191中。用于进行BLAST解析的软件可以由面向公众的NationalCenter for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。这种算法包括在与数据库序列中相同长度的字码进行对比时，通过鉴定在是否吻合或满足某些评价为阳性的阈值T的质疑序列中长度W的短字码，首先鉴定高值的序列对(HSP)。T是指相邻的字码值阈值(Altschul等，如上所述)。这些最初的相邻字码的标的(ヒット)作为用于开始用以找出包含它们的更长的HSP的检索的核心。如果累积对比值增加，则编码的标的沿各序列向两方向扩张。各方向中编码标的的扩张在下列情况下停止，即，当累积对比值距离其最大达到值为未知数X时；当累积值由于1个以上的负值残基序列对比累积而成为0以下时；或者到达任一序列的端部时。BLAST算法的参数W、T和X由序列对比的灵敏度和速度决定。BLAST程序使用的默认值为，编码长(W)为11、BLOSUM62计分矩阵(参照Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)的序列对比(B)为50、预测(E)为10、M＝5、N＝4以及双链比较。用语BLAST是指，对两序列间的相似性进行统计解析的BLAST算法。可参照Karlin(1993)Proc.Natl.Acd.Sci.USA 905873-5787。由BLAST算法所提供的相似性的1个尺度为最小总概率(P(N))，其提供了偶然发生2个核酸序列或氨基酸序列间的吻合性的概率指标。或者，作为2个核酸序列相似的其它指标为，第1核酸编码的多肽与第2核酸编码的多肽的免疫交差反应性。
(表达盒(カセット)和表达载体的构建及其应用)具有确认活性的OsEF1β1基因的启动子区域或其活性部分的序列，可以被引入到适当的植物表达载体中。
本发明中植物表达载体可以使用本领域人员所周知的基因重组技术制得。植物表达载体的构建例如优选使用pBI系的载体，但并不限于此。
“植物表达载体”为，调节基因表达的启动子等的各种调节元件以在宿主细胞的细胞中可以工作的状态被连接的核酸序列。优选地，可以包括本发明的植物基因启动子、终止子以及药剂耐受性基因。表达载体的类型和所使用调节元件的种类可以根据宿主细胞而更换，这一点是本领域技术人员所公知的。本发明的植物表达载体还可以具有T-DNA区域。特别是在使用农杆菌属性状转化植物时，T-DNA区域可以提高基因的导入效率。该表达盒可以进一步包括对于所使用特定的宿主生物适宜的选择标记基因。
“终止子”位于基因的编码蛋白质的区域的下游，为与DNA被转录为mRNA时的转录终结和多A序列增加有关的序列。已知，终止子提供mRNA稳定性并对基因的表达量有影响。作为终止子的例子可举出CaMV35S终止子和胭脂氨酸合成基因的终止子(Tnos)，但并不限于此。
“药剂耐受性基因”优选为，容易选拔性状转化植物的基因。可以优选使用，可赋予耐卡那霉素性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因和可赋予耐潮霉素性的潮霉素磷酸转移酶基因等，但并不限于此。
待表达的异种基因在上述启动子的3’下游例如多克隆位点被可表达地连接，生成表达载体。本申请说明书中的“异种基因”是指，OsEF1β1基因以外的稻或其它植物中的内因性基因、或相对于植物的外来基因，其基因产物的表达理想为在植物、特别是细胞增殖旺盛的组织中的基因表达的任意基因。
使用由此而产生的表达载体，可以性状转化植物细胞。植物细胞的性状转化可以使用本领域技术人员公知的任意方法进行，如使用农杆菌属的方法、向原生质体中电穿孔的方法等。植物细胞的原生质体的制备例如可以按照Kyozuka等，Mol.Gen.Genet.206408-413(1987)中记载的方法进行。单子叶植物中优选的、使用农杆菌属的性状转化方法可举出由本发明者开发的PCT/JP/03920中记载的方法。这种方法即使对于单子叶植物也可快速且有效地得到性状转化体植物，不过用于植物性状转化的方法并不限于此。
性状转化后的植物细胞经常规方法再分化，得到性状转化后的植物组织，进而可以成为植物体。在制备用于性状转化的表达载体时，OsEF1β1基因启动子例如可被引入到在细菌和植物两宿主中可表达的二元载体中。这种二元载体是本领域技术人员周知的。例如，当使用包括农杆菌属的表达系在内的pBI系等载体时，可以利用用微生物感染植物的系统。使用适当的表达载体，可以将目的异种基因导入到包括稻等单子叶植物和烟草等双子叶植物在内的任意可性状转化的植物中。
所谓植物细胞可以为任意的植物细胞。植物细胞可以为培养细胞、培养组织、培养器官或植物体的任一形态。优选为培养细胞、培养组织或培养器官，更优选培养细胞。可用于本发明生产方法的植物种为可进行基因导入的任意植物种。
可用于本发明生产方法的植物种的例子可举出，茄科、稻科、油菜科、蔷薇科、豆科、瓜科、紫苏科、百合科、藜科、水芹科的植物。
茄科植物的例子可举出，属于Nicotiana、Solanum、Datura、Lycopersion、或Petunia的植物，例如包括烟草、茄子、马铃薯、西红柿、辣椒、矮牵牛等。
稻科植物的例子可举出，属于Oryza、Hordenum、Secale、Scccharum、Echinochloa或Zea的植物，例如包括稻、大麦、黑麦、稗子、高梁、玉米等。
油菜科植物的例子可举出，属于Raphanus、Brassica、Arabidopsis、Wasabia或Capsella的植物，例如包括萝卜、油菜、シロイヌナズナ、山 菜、荠菜等。
蔷薇科植物的例子可举出，属于Orunus、Malus、Pynus、Fragaria或Rosa的植物，例如包括梅、桃、苹果、梨、草莓、蔷薇等。
豆科植物的例子可举出，属于Glycine、Vigna、Phaseolus、Pisum、Vicia、Arachis、Trifolium、Alphalfa或Medicago的植物，例如可包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蚕豆、花生、三叶草、苜蓿等。
瓜科植物的例子可举出，属于Luffa、Cucurbita或Cucumis的植物，例如包括丝瓜、南瓜、黄瓜、白兰瓜等。
紫苏科植物的例子可举出，属于Lavandula、Mentha或Perilla的植物，例如包括薰衣草、薄荷、紫苏等。
百合科植物的例子可举出，属于Allium、Lilium或Tulipa的植物，例如包括葱、蒜、百合、郁金香等。
藜科植物的例子可举出，属于Spinacia的植物，例如包括菠菜。
水芹科植物的例子可举出，属于Angelica、Daucus、Cryptotaenia或Apitum的植物，例如包括独活、胡萝卜、鸭儿芹、旱芹等。
本发明启动子可作用的“植物”还包括可基因导入的任意植物。“植物”包括单子叶植物和双子叶植物两者。这些植物包括任意的有用植物，特别是作物植物、蔬菜植物和花卉植物。优选，稻、玉米、高梁、大麦、小麦、黑麦、稗子、小米、龙须菜/马铃薯、萝卜、大豆、豌豆、油菜子、菠菜、西红柿、矮牵牛等，但并不限于此。本发明方法使用的最优选植物为稻、特别是日本稻。
如上所述，OsEF1β1基因启动子在植物组织中可以强烈地表达异种基因。使用性状转化体选拔用标记基因作为异种基因，由此更容易选拔性状转化植物体。例如，使用编码毒性蛋白质的异种基因作为异种基因，由此可控制摄食茎叶的害虫等。使用抗病害性基因作为异种基因，由此可以得到耐病害性优异的植物。利用在营养生长组织中的特异基因表达而制备任意的有用植物，也包含在本发明范围内。本发明启动子所表达的基因可举出，被希望在细胞增殖旺盛的组织中基因表达的全部基因。
本发明的启动子的作用除了性状转化植物当代外，还可遗传给其后代植物。在性状转化当代植物和下一代植物、其传播体(例如花粉)、和由其传播体生成的种子中，本发明的启动子都能发挥作用。向后代导入启动子的遗传，例如可以通过以该启动子的序列作为探针的DNA分析或RNA分析来确定。
本发明提供，来自稻的基因、在植物组织(特别是生长分裂组织、细胞分裂旺盛的组织等)中比以往启动子活性高的启动子的使用。因此，本发明不仅可用于稻品种改良，还可用于其它各种植物的品种改良。
(实施例)以下举出实施例，具体说明本发明。这些实施例并不是对本发明的限定。实施例中使用的材料、试剂等没有特别的限制，可以从商业供应源处获得。
实施例1 稻OsEF1β1基因组基因的分离从基因组文库中筛选为了分离稻EF启动子，使用已知的cDNA序列(松本等、如前)合成1对引物，以由稻愈伤组织提取的mRNA作为模板进行RT-PCR，得到cDNA片段。同位素标记该PCR产物用作探针，对经日本晴Sam3A部分分解而得的基因组文库(EMBL3噬菌体载体)进行筛选。按常规方法用大肠杆菌(XLI Blue)感染噬菌体(EMBL3)。按常规方法将噬斑转移到尼龙膜上，使其与用32P标记的上述探针按常规方法杂交(Molecular Cloning、第2版、该公开内容作为参考援引在本说明书中)。杂交结束后，洗涤，放射自显影，由确认杂交的噬菌体制得DNA。
将适当的限制酶SaII、EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI组合，对制得的噬菌体DNA进行消化，将消化物用琼脂糖凝胶电泳分离。将分离的DNA片段转移到尼龙膜上，按常规方法与上述筛选用探针杂交。按常规方法对该膜进行放射自显影，检出与探针杂交的DNA片段。
根据信号强度和谱带图案的不同进行筛选。认为，信号最强的无性系含有OsEF1β1基因，信号弱的无性系含有与OsEF1β1相似但并非OsEF1β1的基因。此外，通过比较谱带图案，可以识别缺失部分基因的无性系。进而制作基于谱带图案的各无性系物理地图，由此推断构成启动子，得到结构基因的5’-上游区域的长度为约1.6kbp左右的无性系λOsEF1β1。λOsEF1β1插入片段的限制地图如图1所示。由此可知，在λOsEF1β1插入片段中存在7个外显子。
由详细的DNA分析、部分碱基序列的解析、基于OsEF1β1 cDNA碱基序列的PCR解析等，得到含有对应于OsEF1β1 cDNA的基因和其5’上游被判定为启动子区域的由约1.6kbp构成的序列的无性系λOsEF1β1。该序列如图2A～C所示。
实施例2.具有OsEF1β1基因启动子的表达载体的制备用作含有实施例1中所得OsEF1β1基因的5’末端区域的表达载体的序列为2，651bp。而且可知，从该序列的第1，671到第1，876存在第1外显子，从第2，639到第2，651存在部分第2外显子，以及在各外显子之间存在第1内含子(参照序列号1和图2A～C)。
具有稻OsEF1β1基因启动子的载体的制备如图3所示。
作为含有稻OsEF1β1基因的5’非翻译区域的片段，使用了由实施例1所得无性系λOsEF1β1(SalI(5’末端)和SmaI(3’末端))。该片段具有从克隆插入序列的第1到第2，651的序列，而且含有5’非翻译序列、第1外显子、第1内含子和部分第2外显子。为了确认OsEF1β1基因的启动子功能，使用了植物细胞用表达载体pBI101(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)。该载体依次具有胭脂氨酸合成酶启动子(NOS-Pro)、用以赋予耐卡那霉素性的新霉素磷酸转移酶II编码区域(NPTII(KON R))、胭脂氨酸合成酶的终止子(NOS-T)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)编码区域和胭脂氨酸合成酶的终止子(NOS-T)。将上述片段连接在经限制消化的上述表达载体上，制得含有与GUS报道基因的融合的pBI101-Hm3。该表达载体中，为了赋予耐潮霉素性，在GUS编码区域的下游还可插入潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因(位于花椰菜花叶病毒35S(35S)和胭脂氨酸合成酶基因的终止子(Tnos)之间)。
实施例3.向稻种子中的性状转化将作为稻代表品种的日本晴的种子，除去谷壳后，在无损伤的状态下，在70％乙醇中放置10秒后，水洗，然后在0.1％Tween20和2.5％次氯酸钠(NaC10)的水溶液中放置30分钟，由此杀菌。在水中充分洗涤后，将稻提供到下述无菌操作中。
(前培养)将种子播种到含有2，4-D的N6D培养基(30g/l蔗糖、0.3g/l酪蛋白氨基酸、2.8g/l脯氨酸、2mg/l 2，4-D、4g/l脱乙酰吉兰糖胶、pH5.8)，在27℃～32℃下保温5天。期间种子发芽。
(植物表达用载体)用上述生成的pBI101-Hm3性状转化农杆菌属EHA101(Hood等、J.Bacteriol.，1681291-1301(1986))。EHA101为源自辅助质粒的vir区域为强病原性的农杆菌属A281的菌。将农杆菌属在补充了潮霉素(50mg/l)的AB培养基(葡萄糖(5g/L)、K2HPO4(3g/L)、NaH2PO4·2H2O(1.3g/L)、NH4Cl(1g/L)、KCl(150mg/L)、CaCl2·2H2O(10mg/L)、F2SO4·7H2O(2.5mg/L)、pH7.2、bactoagar(1.5％)(3g/200ml)、1M MgSO4·7H2O(120μl/100ml))中在25℃下暗处培养2～3天。
(农杆菌属感染)使性状转化的农杆菌属悬浊在添加了2μg/ml乙酰丁香酮的AAM培养基(AA-1(×1000)1ml(MnSO4·4～6H2O(1000mg/100ml)、H3BO3(300mg/100ml)、ZnSO4·7H2O(200mg/100ml)、Na2MoO4·2H2O(25mg/100ml)、CuSO4·5H2O(2.5mg/100ml)、CoCl2·6H2O(2.5mg/100ml)、KI(75mg/100ml))、AA-2(×1000)1ml(CaCl2·2H2O(15.0g/100ml))、AA-3(×1000)1ml(MgSO4·7H2O(25g/100ml))、AA-4(×1000)1ml(Fe-EDTA(4.0g/100ml))、AA-5(×1000)1ml(NaH2PO4·2H2O(15.0g/100ml))、AA-6(×200)5ml(烟酸(20mg/100ml)、硫胺HCl(200mg/100ml)、维生素B6HCl(20mg/ml)、肌醇(2000mg/100ml))、从-Sol(×100)10ml(L-精氨酸(5300mg/300ml)、氨基乙酸(225mg/300ml))、AA-KCl(×50)20ml(KCl(3g/20ml))、酪蛋白氨基酸(500mg/L)、蔗糖(68.5g/L)、葡萄糖(36g/L)、L-谷酰胺(900mg/L)、L-天冬氨酸(300mg/L)、pH5.2)中。将前培养的上述种子在此悬浊液中浸渍90秒，然后移植到2N6-AS培养基(30g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、0.3g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l 2，4-D、10mg/l乙酰丁香酮、4g/l脱乙酰吉兰糖胶、pH5.2)中。在暗黑条件下25℃保温3天共存培养。
(除菌和选拔)共存培养结束后，使用含有500mg/l羧苄青霉素的N6D培养基，从种子中洗出农杆菌。接着在以下条件下选拔性状转化的种子。
第一次选拔将种子放置在补充了羧苄青霉素(500mg/l)和潮霉素(50mg/l)的、含2mg/l的2，4-D的N6D培养基上，在30℃保温7天。
第二次选拔将种子放置在补充了羧苄青霉素(500mg/l)和潮霉素(50mg/l)的、含2～4mg/l的2，4-D的N6D培养基上，再在30℃保温7天。
(再分化)将选拔后的性状转化种子在以下条件下再分化。
第一次再分化将选拔后的种子放置在再分化培养基(补充了羧苄青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的MS培养基(30g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇、2g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l激动素、0.002mg/l NAA、4g/l脱乙酰吉兰糖胶、pH5.8))上，在30℃保温2周。
第二次再分化使用与第一次再分化中所用相同的再分化培养基，再在30℃保温2周。
(装盆)将再分化后的性状转化体转移到生根培养基(补充了潮霉素(25mg/l)的不含激素的MS培养基)上，确认根生长后装盆。
实施例4 GUS染色的组织表达在用具有本发明稻OsEF1β1基因启动子的载体性状转化的植物(播种后经过约6周后的稻)的各植物组织中，为了讨论由上述启动子的基因表达，进行了GUS活性的组织化学分析。使用由含有以往用作植物表达用启动子的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的pBI121性状转化的植物作为对照，比较通过启动子的基因表达。
为了讨论植物组织中通过上述启动子的基因表达，进行GUS活性的组织化学分析。这样的组织化学分析使用植物细胞工学、第4卷、第4号、281～286页记载的步骤实施。本方法以Jefferson等的方法(EMBO J 63901-3907(1987))为基础，同时伴有Kosugi等的改良(Kosugi等，Plant Science 70133-140(1990))。简单地，将切除了的切片包埋在5％(w/w)琼脂中，然后使用微切片机将琼脂块切薄。将厚度为100～130μm的组织切片浸渍在含有1mM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)、7％(v/v)甲醇以及50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)的组织化学基质溶液中，接着37℃下温育2～24小时。在刚刚切出后、琼脂包埋阶段、切削的过程或切片的减压脱气时添加2mM DTT。另外，5mM浓度的DTT可以在37℃的GUS反应时添加。接着，添加乙醇使反应停止，使之脱色，接着在显微镜切片。
这些结果示于图4中。左侧表示使用本发明启动子性状转化的植物的各种组织中的GUS活性，右侧表示对照植物的各种组织中的GUS活性(从上开始依次为茎、叶、根)。图3中，在茎、叶和根的任一中，本发明的性状转化植物都表现出比对照植物强烈的表达。本发明性状转化植物的GUS活性为对照植物的用35S启动子表达的GUS活性的约5倍以上的差。还有，本发明的性状转化植物中，在靠近茎中心的部分(维管束区域)、叶的基部、根端部对有强烈表达。这些表明，本发明的启动子特别在分裂组织有强烈表达。
产业上的可利用性本发明的OsEF1β1基因启动子可以强烈促进植物组织中基因的表达。因此，本发明对于通过植物的基因操作而对稻等植物进行品种改良是极为有用的。
序列表<110>独立行政法人农业生物资源研究所<120>来源于稻的高表达型多肽链延长因子启动子及其使用方法<130>AR025PCT<160>1<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2651<212>DNA<213>稻<220>
<221>外显子<222>(1671)..(1876)
<220>
<221>外显子<222>(2639)..(2651)<220>
<223>n为A，T，C或G.
<400>Igtcgacaaat aaccatattt tactgttgat taccctgttg tcattattta ctgtaatttt 60attttaaaaa tggaggattt tcccatataa ctatataaac cgatgttcaa tgaccgaacg120aaaatgggaa aagtttcaaa aaggaaaaaa acttttcgcc ttcaaccggg cctaattcaa180aacagcccaa ctattttgcc tctgtttttt tacgtgattt ttcaaatgtt caatttcaaa240aaaaaaaggt caagttcaag cttgacatga attttgacct tgtttttaca tgcattttaa300aatggaaact gaagttcaaa acatagggga gaaagcaata gcctagcaaa caaaaccatt360ttccccctcc aattggacct aatttgaaac aacacccaat tgaaaatgga atatgtctac420tttgactccc ttaactagtg tcttaaccta atttgtatct ttaaaccgta atagcggata480ttttgacccc caactattaa aactggtgta atttgtctcc ctcaacggtt ttggaggact540gttcactatc atggagcata cgtggcggng ttgtaagcgt ctgtcgagga gtgatcctct600ctagcaggag atcgtgagac ccccctttcg tgagttcggc cggggaagaa gctcgcctct660agaaatcgcg tatccgtccc caaggctcct agctagctcg cacacaacca aattatacag720
gttcgggccg ctatgaagcg taatacccta ctcctgtgta tgggatttag actgagagtt780acaatggttc ctaaactcgg gagaacactc ttacttccct cctccacaag ctcaggtttt840ctgagagtcg tcctctttct cggtgggtaa ggtcctcctt ttatacctca aggggatacc900acatgcaccg cttctaccta ctcttttttc gggaggggac ccaccatatc ttgactggaa960ctcgacccgt gccttcgcct ggaagctaaa ccatagcttg tccttgagcg gggcccatca 1020ccgtccctcg cctgacacgg gggacagccc tgtcattccc tcattaatag gtgaagactt 1080gtggtggccg ccgtccgaat gaccccccga cgggacgggc catacctacc tccattccac 1140cggaagcaga tgtgacgtgg gagcacggtt gtccatccag tcagacgtga ccggcgtcag 1200ccggtcacag accggtcatt cttgaccatc gcgcgtcagt ttagcacgcc gcacgtctgc 1260cccactgcat taaatgtgac atggggcagt tgaggcgctg tgcggattaa aggaagttca 1320gcctggggcc cctcctcgct tgctcccccc gccaaacggc ggctgggcga gggcctcggg 1380gcaaagcagt gcaagggccc gaggggcatg acgtggcacc ccgaggcccc gacaccccgg 1440ccgctcctgc ggttcgtgga atgcggggac aggaccatgc tgtagggaca cgtggtagga 1500tggaaaggta gattcccctc acttcgcata cccccgggcc catatctccg acagtttagg 1560gcttagggtt taatagttgg agagtcgaga tatccggtac tgcgattcaa gcatacgaat 1620cagattcggc ccaataatcc agatgccaat aggacggccc atcaatccag atg caa 1676Met Gln1tac gac ggc cca tca gat ccc gtc ccc gag aag gaa tcc ccc tca ccg 1724Tyr Asp Gly Pro Ser Asp Pro Val Pro Glu Lys Glu Ser Pro Ser Pro5 10 15
ttg gat ccg atc cga cgg ctg aga cca gcc aca caa acc ctc aat ata 1772Leu Asp Pro Ile Arg Arg Leu Arg Pro Ala Thr Gln Thr Leu Ash Ile20 25 30tat tcg ctc gcc ccc cgc tgc gtc tcg ccg ctc cta cac cgc gcc gtc 1820Tyr Ser Leu Ala Pro Arg Cys Val Ser Pro Leu Leu His Arg Ala Val35 40 45 50gcc agc agc cgc gcc gct gcc tct cct cct cct ccc ctc gcc gcc gat 1868Ala Ser Ser Arg Ala Ala Ala Ser Pro Pro Pro Pro Leu Ala Ala Asp55 60 65cca atc cg gtaagcctgc cgccgaagct cccctcgtcc ttccccggat agttcgtcgc 1926Pro Ile Argctcgtcaggc atctcgccga tttggcgccg ttctgttgtt ctgtttggtg gagccgtgcg 1986cgagatttcc ggtgtttgtt gacctgttta gctctgatgg attcaccttg tgttagttag 2046ttttccgtcg aatggtgtgg cgattaggtt tggggggatt ggttcgtctg tgattttgta 2106gctagatttt ttgaaatcta gggtagtgtg agtggggaag ctgctggcct tagtggatac 2166atgctgttcg tggtctcctg gttcttgaaa tcatgatgag ttagtgctgt ttgaaccttg 2226aagcaaagtt ttaagttatt ggagttcctg tgcttagatt tgtatactat tagtgaagag 2286atgcatagct gtactgctgt agtggatata ggagtgttgt ttttgatttg ctggtgctct 2346tccatagcat ccggatgcgg tgttcaattg tgtagttgtt tatgtagttc aatgcactag 2406aagcttttat ttctgaatgc ctagttatta gttgggtatg aagtccaatg tgtgaaatgc 2466tgtcatgttt caacttttag ttaagatatg aaacttgaga aacaaatgaa aggtttagat 2526tcagtactga tgtacaactt aagtaacatc tatggttgta aattgtacca tgcattggtt 2586
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权利要求
1.具有在植物中强烈表达异种基因的启动子活性的DNA，其中，是具有序列号1所示的序列或其一部分的序列，且具有与序列号1的序列同等的启动子活性。
2.根据权利要求1的DNA，其中所述启动子在植物的生长分裂组织中特异地促进所述异种基因的表达。
3.根据权利要求1的DNA，其中在严紧条件下与所述序列号1所示序列或具有其一部分的序列杂交。
4.表达载体，其中含有权利要求1所述DNA以及与该DNA可表达地连接的异种基因。
5.由权利要求4所述表达载体性状转化的植物细胞。
6.根据权利要求5的植物细胞，其中所述植物细胞为单子叶植物细胞。
7.根据权利要求5的植物细胞，其中所述植物细胞为双子叶植物细胞。
8.由权利要求5所述植物细胞再生得到的植物体。
9.权利要求8所述植物体的后代。
10.权利要求8所述植物体的传播体。
11.由权利要求9所述的后代得到的种子。
12.将希望在植物中表达的异种基因导入植物中的方法，其中包括用权利要求3所述的表达载体性状转化植物细胞的步骤；和使该性状转化后的植物细胞再分化、得到植物体的步骤。
13.权利要求12的方法，其中所述植物细胞为单子叶植物细胞。
14.权利要求12的方法，其中所述植物细胞为双子叶植物细胞。
全文摘要
本发明提供具有在植物组织(特别是细胞增殖旺盛的组织)中强烈表达异种基因的启动子活性的DNA。该DNA为序列号1所示序列或具有其一部分的序列，其具有与序列号1的序列同等的启动子活性，为稻OsEF1β1基因启动子。还提供包含与该启动子可表达地连接的异种基因的表达载体。还提供由此表达载体性状转化的植物细胞、由此植物细胞再生的植物体、该植物体的后代和传播体以及由其后代得到的种子。还提供使用表达载体将基因导入植物中的方法。
文档编号A01H5/00GK1494595SQ0182310
公开日2004年5月5日 申请日期2001年3月27日 优先权日2001年3月27日
发明者田中宥司, 番保德, 萱野晓明, 松冈信, 坂本知昭, 明, 昭 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所