专利名称：地面模拟空间环境植物育种方法
技术领域：
本发明涉及利用模拟空间环境影响植物的生物遗传效应的方法，特别是在地面模拟空间环境处理植物种子和离体培养物开展植物育种方法。
背景技术：
科学实验证明，空间综合环境因素对植物种子的生理和遗传性状具有强烈的影响作用。地磁场效应，尤其是屏蔽地磁场的模拟空间环境生物效应，是生命活动的重要环境因素。近年来，随着科学技术的发展和人类对空间资源的开发，利用新的诱变因素如采用高空气球和返回式卫星搭载植物种子，进行空间诱变处理，已成为一种有效的诱变育种技术，如(顾瑞琦等。空间飞行对小麦种子的生长和细胞学特性的影响。植物生理理学报，1989，15(4)403～407；王彩莲等。模拟空间环境对水稻的细胞学效应研究。核农学报，1998，12(5)269～273)。
虽然在人工磁场(同时存在地磁场)处理农作物种子的生物效应研究方面已有人做过许多研究(毛伟海，磁场对小麦的生物效应及其应用研究进展。麦类作物，1997，151～53。)，但尚未开展过模拟空间环境对植物的生物效应研究。
但是，进行空间育种投资大，技术要求高，机会十分有限。因此，探索地面模拟空间环境因素的研究工作，对于空间诱变机理的揭示和育种应用意义重大。
发明内容
本发明的技术方案是利用地面模拟空间零磁场处理植物种子和离体培养物，为开展地面模拟空间环境诱变育种，进行品种改良提供一种新方法。
具体操作方法是先将待处理的植物种子或离体培养物置于模拟空间环境(MF)处理，经适宜周期后进行种植选育或培养。
所述模拟空间环境为采用磁屏蔽装置，其磁强为≤20nT。
所述置于模拟空间环境(MF)处理是在室温下进行的。
所述植物包括粮食作物(如小麦、大麦、水稻、玉米)、蔬菜(如西芹、油菜)、花卉(如串红和小丽花)。
所述离体培养物是花药。
所述适宜周期是≥180天。
本发明采用不同基因型的植物种子及离体状态脱分化过程中的组织等材料，经不同时间周期的模拟空间环境处理，实验室分析和大田种植试验相结合，通过世代跟踪和对比分析方法，揭示模拟空间环境处理植物的生物遗传效应特征如下所示(1)模拟空间环境处理植物种子的生物效应a.经三年试验共选用小麦、大麦、水稻、玉米、西芹、油菜、串红和小丽花等8种植物的种子进行模拟空间环境(MF)处理，发现模拟空间环境处理具有与γ射线辐照处理显著不同的生物效应，且不同植物种子对模拟空间环境处理的敏感性不同。具体表现为小麦、大麦、串红和小丽花等植物种子对MF处理较为敏感，当处理周期(Tmf)大于180天时，明显抑制种子的萌发和幼苗生长，但这种抑制作用不存在明显的剂量效应，即不随着处理时间的增长而增强；水稻则表现一定的刺激生长作用；而玉米、西芹、油菜等植物种子则反应迟钝，在所选用的试验材料范围内无明显的生物损伤特征。
b.对3个小麦品种的种子分别进行180天MF处理、250Gyγ射线、250Gyγ射线+180天MF处理，与对照(CK)进行生物效应比较分析，初步结果表明，以幼苗抑制损伤(苗高降低)值为指标，损伤效应表现为γ+MF＞γ＞MF＞CK。MF处理与γ射线处理损伤特征显著不同，MF幼苗表现为真叶变短、宽、厚，叶尖钝圆，叶色浓绿；而γ射线处理幼苗真叶变短、窄，叶色浅绿。这些形态差异同样在过氧化物同工酶上得到印证，即不同处理的酶谱和酶活性存在差异。
c.多年试验初步确定的小麦等农作物种子的模拟空间环境处理适宜周期Tmf为大于180天。
(2)模拟空间环境处理植物对植物遗传性状的影响a.研究发现小麦种子经模拟空间环境处理，第1代(MF1)在株高、穗长、小穗数和穗粒数等农艺性状的变异率明显高于对照，变异幅度为3.33％-56.25％；模拟空间环境处理对水稻干种子的当代植株生长没有显著影响，但MF2代变异类型丰富，早熟类型突变频率相对较高，最早熟变异比对照早10天抽穗，育性分离亦较大，各类分离程度大小依次为早熟＞育性＞株高＞穗型＞粒型，当选变异类型单株后代稳定快；模拟空间环境处理的串红和小丽花种子等在MF1当代即出现变异株，如“白花”串红、花瓣异型小丽花等。b.研究了在小麦花药培养过程中附加模拟空间环境(MF)处理对小麦花培效果的影响。结果表明，在愈伤组织诱导率上，室温MF处理(6.9％)明显高于室温本底对照(4.0％)，说明模拟空间环境处理对小麦雄核发育和最终形成愈伤细胞团有一定的刺激作用；在愈伤组织绿苗分化方面，MF处理(17.7％)显著高于本底对照(10.9％)和正常培养对照(12.0％)，且白化苗产生频率，MF处理(7.8％)显著低于本底对照(14.0％)和正常培养对照(21.0％)，说明MF处理有助于促进高质量愈伤组织及其绿苗的获得率。
c.MF处理花培第1代(H1)花粉植株在株高、有效穗数、穗长和小穗数上的表型变异系数均高于京花1号实生苗及其正常培养花粉植株和本底对照花粉植株，在MF处理H1代出现了较高频率的矮杆和多穗变异。说明在小麦花药培养中附加MF处理，可诱发某些农艺性状的变异。在MF处理的小麦花培H2代，所考察的4个农艺性状上都发生一定频率的突变，且在总突变率上，MF处理(3.8％)显著高于室温本底对照(1.2％)以及正常培养(0.8％)。MF处理的有益突变中主要表现为矮杆、大穗多粒等突变。零磁处理获得的MF0353-1突变株系，平均株高为78cm，比京花1号小麦矮12cm，穗粒数由35粒提高到43粒。由于H2突变来源于H1加倍单倍体植株后代，因此H2代获选的突变系理论上其遗传背景已趋于纯合，H3代可直接用于株系鉴定，这可比传统的辐射诱变育种程序缩短1-2年。
(3)模拟空间环境处理引发植物性状变异的作用机理a.细胞学观查表明，水稻干种子经模拟空间环境处理后，根尖细胞染色体畸变率明显高于未处理的对照，但又低于γ射线辐照处理畸变类型以染色体桥和微核为主；小麦MF处理与对照幼苗叶片电镜制样观察发现，MF幼苗叶片表面气孔排列零乱，气孔被挤压变形，叶绿体形状亦发生变化。表明模拟空间环境处理能够引起细胞分裂行为及细胞器结构与分布的深刻变化。
b.生化和分子生物学分析表明，模拟空间环境处理种子所引起的形态差异在过氧化物同工酶上得到印证，不同处理的酶谱和酶活性存在差异；对MF处理获得的3个突变材料与其亲本进行了初步的SSR分子检测分析，所筛引物中Xgwm82，102，153，169，192，213，332，469，538在突变体与亲本间有差异，揭示差异的比例为6.0％。说明模拟空间环境处理确能引起基因位点的突变。
本发明初步明确了模拟空间环境对植物遗传特性的影响，为开拓植物育种提供了新方法，在植物育种改良及空间生命科学研究等方面具有良好的应用前景。
具体实施例方式实施例1模拟空间环境处理对小麦种子萌发与幼苗生长实验1材料和方法1.1供试材料小麦Triticum aestivum L.品种Y1225，Y1221，R344和京花1号(JH1)。
1.2试验方法Y1225，Y1221和R344每品种各200粒风干种子，在室温模拟空间环境(MF)处理216天后，与未经处理的对照同时在21℃恒温条件下做室内发芽试验，每一处理100粒，两次重复。调查统计萌发势、发芽率及10天后的苗高和根长。
模拟空间环境为采用双层磁屏蔽结构和线圈补偿方式相结合的大型26面体磁屏蔽装置，其直径2.3m，磁强≤20nT，为地球磁强度的4×10-4。
取京花1号小麦单核中晚期的幼穗，在4℃下预处理24h，用0.1％升汞表面消毒，无菌条件下将花药接种在附加2mg/L2，4-D和0.5mg/L的C17培养基上，分别设室温模拟空间环境(MF)、室温本底对照(CK0)和28℃正常培养(CK)三种处理，经暗室培养40天后转分化，分化培养基为MS附加1mg/l KT和1mg/l NAA。三种处理的分化培养均置于24℃-26℃培养室中，每天光照12h。
H1代花粉植株移栽大田，采用顺序排列，并同时种植实生苗。H1代单株收获，单穗脱粒。H2代按穗行种植，一次重复，行长2m，行距30cm，株距5cm。田间调查记载主要农艺性状，收获后室内考种，按超出实生苗m±2Sd统计农艺性状变异频率。
2结果与讨论2.1模拟空间环境处理对种子萌发与幼苗生长的影响小麦品种的干种子经模拟空间环境处理180天以下时，种子萌发与幼苗生长未受到明显影响。表1列出了3个小麦品种经模拟空间环境处理216天后的发芽试验结果。可以看出，不同小麦品种的处理组(MF)与相应对照组(CK)比较，3天后的萌发势和7天后的发芽率表现极显著差异，萌发势的损伤效应均在90％以上，说明模拟空间环境处理种子明显抑制种子萌发。
表1模拟空间环境处理对小麦种子萌发与幼苗生长的影响品种处理发芽势％)发芽率％)苗高(cm) 根长(cm)Y1225 MF 9**70**5.01±0.92**8.06±1.54**CK 93 95 11.84±0.94 10.45±1.46Y1221 MF 7**47**3.07±0.46**5.22±1.26**CK 91 92 11.68±0.96 9.44±1.21R344MF 7**67**5.07±1.75**5.50±1.76**CK 92 94 14.30+0.8811.45±1.05**表示在0.01水平上有显著差异。
模拟空间环境处理明显抑制小麦幼苗的苗高和根长。216天零磁处理的小麦苗高致矮损伤效应均在50％以上。模拟空间环境处理的小麦幼苗的形态特征突出的表现为真叶变短、宽、厚，叶尖钝园，叶色浓绿。说明模拟空间环境对小麦种子具有明显的诱变作用，且有可能成为一种不同于γ射线的新的物理诱变剂应用于小麦品种改良。
实施例2对小麦花药愈伤组织诱导和分化的模拟空间环境处理供试材料及试验方法同实施例1。
结果见表2。
表2模拟空间环境处理对京花1号小麦花药愈伤组织诱导和绿苗分化的效应接种花出愈率 绿苗率 白苗率处理出愈数 绿苗数 白苗数药数(％) (％) (％)1998 MF 4400 258 5.9 69 27.0 - -CK02200 72 3.3 6 8.3 - -CK 2300 149 6.5 26 18.0 - -1999 MF 4600 361 7.9 31 8.6 28 7.8CK02000 93 4.7 12 14.0 13 14.0CK 2100 199 9.5 13 6.5 42 21.1平均 MF 4500 310 6.9 50 18.0 - -CK02100 83 4.0 9 12.0 - -CK 2200 174 8.0 19 11.0 - -从表中可看出，不同的外界环境因素对小麦花药愈伤组织的诱导和分化有不同的影响。在愈伤组织诱导率上，室温模拟空间环境处理(6.9％)虽然不及正常培养对照(8.0％)，但明显高于室温本底对照(4.0％)。
在愈伤组织绿苗分化方面，模拟空间环境处理(17.7％)显著高于本底对照(10.9％)和正常培养对照(12.0％)；而白化苗产生频率，模拟空间环境处理(7.8％)则显著低于本底对照(14.0％)和正常培养对照(21.0％)，结论模拟空间环境处理可刺激小麦雄核发育和最终形成愈伤细胞团，且有助于增加高质量愈伤组织及其绿苗的获得率。
实施例3模拟空间环境处理的小麦花培H1代、H2代农艺性状研究实验供试材料及试验方法同实施例1。
结果见表3、表4。
表3模拟空间环境处理对京花1号小麦花培H1代农艺性状的影响株高(cm) 有效穗数 穗长(cm) 小穗数处理M±SCV M±S CVM±SCVM±S CV％％％ ％MF 82.5±11.5 14.0 8.7±6.4 73.4 7.9±1.012.2 21.6±2.0 9.3CK086.5±5.0 5.79.5±0.7 7.4 7.5±0.79.4 23.0±2.8 12.3CK 84.3±4.9 5.93.5±1.3 36.9 7.5±0.45.6 23.0±1.4 6.2JH1实生苗 88.6±3.9 4.47.4±3.1 41.4 8.3±0.33.1 19.1±0.9 4.7模拟空间环境处理植株在株高、有效穗数、穗长和小穗数上的表型变异系数均高于京花1号实生苗及其正常培养花粉植株和本底对照花粉植株，在模拟空间环境处理H1代出现了较高频率的矮杆和多穗变异。说明在小麦花药培养中附加模拟空间环境处理，不仅有助于愈伤组织的诱导和分化，而且还可能诱发某些农艺性状的变异。
表4列出了模拟空间环境处理的小麦花培H2代4个农艺性状基于京花1号实生苗的变异频率。试验结果表明，与京花1号实生苗群体相比，模拟空间环境、室温本底对照以及正常培养三种花培处理方法获得的H2代在所考察的4个农艺性状上都发生一定频率的突变，且在总突变率上，模拟空间环境处理(3.8％)显著高于室温本底对照(1.2％)以及正常培养(0.8％)。模拟空间环境处理的有益突变中主要表现为矮杆、大穗多粒等突变。例如，零磁处理获得的MF0353-1突变株系，平均株高为78cm，比京花1号小麦矮12cm，穗粒数由35粒提高到43粒。除了成熟期比京花1号小麦晚3-4天外，MF0353-1突变系的综合农艺性状表现明显优于京花1号小麦。由于H2突变来源于H1加倍单倍体植株后代，因此H2代获选的突变系理论上其遗传背景已趋于纯合，H3代可直接用于株系鉴定，这可比传统的辐射诱变育种程序缩短1-2年。
表4模拟空间环境处理的京花1号小麦花培H2代农艺性状的变异频率(％)株高(cm) 有效穗数 穗粒数单株产量(g)处理 调查株数 总突变率高矮 多 少 多 少 高低MF 1040 0.2 1.60.20.10.6 00.20.6 0.3 3.8CK05260.1 0.30.10 0 00.50.2 0 1.2CK 6500 0.30.20 0 0.1 0.2 0 0.8结论模拟空间环境处理应用于小麦花药培养，可增加花培后代变异类型，为育种选择提供丰富遗传基础。
实施例3模拟空间环境处理水稻种子的细胞学观察与农艺性状调查实验本实验利用模拟空间环境处理干种子，并与r射线辐照和地面对照作比较，探讨其细胞学和生物学效应，为开展水稻模拟空间环境诱变育种提供实验依据。
材料选用水稻新品种(系)农垦58、组辐粳、优辐粳、9522及F1杂交种9705和XZ9216(马尾粘/突9216//XZ籼1号)等6个材料的干种子各3份，1份用于模拟空间环境处理，1份未经任何处理和1份经Co60r-射线辐照处理用作双对照，处理材料与对照一起进行田间种植。
方法1模拟空间环境处理采用双层磁屏蔽结构和线圈补偿方式相结合的大型26面体磁屏蔽装置，其直径为2.3M，磁强＜20nT为地球磁强度4×10-4。处理周期为1年。
.2r射线辐照
Co60r-射线辐照材料的辐照剂量为300gy，剂量率为30Gy/min。
3细胞学观察水稻种子置于26±1℃下进行浸种催芽，取根尖分生细胞经苏木精染色压片显微观察。每个处理观察30个根尖，每个根尖观察100多个有丝分裂细胞，按染色体结构变异类型进行分析统计。
4农艺性状调查对种子发芽势、发芽率、苗高、株高进行了观察调查及分析统计。
结果1对染色体结构的影响水稻干种子经模拟空间环境处理后，不论是品种、稳定品系还是杂交1代，根尖细胞染色体畸变率均明显高于未处理的对照(表5、表6)，但又低于辐照处理。其中9705和XZ9216两个F1的有丝分裂细胞染色体畸变频率要高于农垦58、组辐粳等品种或稳定品系(表5)。这表明杂种F1对模拟空间环境处理的敏感性比品种或稳定品系高。经t测定，所有处理的品种(品系)与对照相比，均达到显著水平(见表6)。模拟空间环境处理与r射线处理相比，染色体畸变细胞频率也达到显著水平，说明辐射对染色体畸变的效应大于模拟空间环境。
表5模拟空间环境处理对水稻细胞学的影响品种(系)染色体畸变细胞率(％) 有丝分裂指数(％)MF γ CK MF γCK农垦58 1.02±0.79 1.12±0.11 0.21±0.07 14.32±1.52 11.25±0.32 13.8±1.089522 1.15±0.18 1.24±0.22 0.19±0.11 15.33±1.16 11.71±1.52 14.46±1.51组辐粳 0.98±0.74 1.65±0.16 0.21±0.13 15.71±1.48 12.12±1.36 15.01±1.51优辐粳 1.01±0.10 1.32±0.16 0.13±0.07 17.03±1.18 12.16±1.17 15.25±0.979705 1.08±0.21 1.12±0.14 0.17±0.09 17.11±1.34 10.61±1.27 15.23±1.49XZ9216 1.26±0.19 1.64±0.21 0.16±0.08 16.64±1.22 10.07±1.09 15.09±1.12从染色体畸变类型来看，模拟空间环境处理的染色体桥和微核高于辐射处理的；辐射处理的染色体断片和落后染色体的比例大于模拟空间环境处理的。在有丝分裂细胞中，经辐射处理的观察到有丝分裂细胞中有多桥、多微核的频率较高，而且随着剂量增大染色体多桥、多微核数量增高。模拟空间环境处理引起的染色体桥和微核多的现象，可能是由于细胞长期处于诱变处理环境之中，染色体断片不能及时进行自身修复而导致的。
表6模拟空间环境处理的细胞效应与r-射线和未处理对照的t测定品种(系) 细胞染色体畸变的t值 有丝分裂指数t测定MF+γMF+CK MF+γ MF+CK农垦58 0.92435.7624**3.579**1.10949522 1.10215.2115**5.6031**2.9119*
组辐粳1.98425.4180**4.9024**0.3379优辐粳1.77615.2171**4.003**0.42659705 2.2013*4.582**6.114**3.9423**XZ92163.202**4.6261**6.2014**4.001**2对水稻种子当代的生物学效应测量和分析了模拟空间环境诱变处理水稻干种子对当代的发芽率、成苗率、苗高、根长的生物学效应，发现模拟空间环境处理水稻干种子后没有任何抑制作用，相反其种子的发芽率、成苗率、苗高均比对照略高，根长比对照长，表明模拟空间环境处理水稻干种子后，对其苗期生长不存在明显的生物学损伤效应(表7)。
表7模拟空间环境处理对水稻当代发芽率、存活率、苗高和结实率的影响品种(系) 发芽率存苗率苗高结实率(％) (％) (cm)(％)农垦58MF 96.4 95.9 22.492.4γ88.3 84.5 19.881.2CK 96.1 95.2 21.692.39522 MF 95.2 95.6 21.693.4γ88.4 83.9 19.282.6CK 94.6 95.5 20.893.3组辐粳MF 96.4 96.1 22.192.5γ85.7 82.6 19.682.4CK 95.8 95.8 21.992.5优辐粳MF 97.1 97.5 21.794.6γ89.5 84.3 19.483.4CK 96.9 96.1 21.894.79705 MF 95.4 96.5 22.592.7γ87.9 83.4 20.180.9CK 95.2 96.1 22.292.5XZ9216MF 95.7 96.6 21.969.2γ88.5 82.7 19.774.4CK 95.3 96.4 20.890.13对水稻种子后代分离的影响模拟空间环境处理对水稻干种子的当代植株生长没有任何影响，高度比对照略高些。第2代出现了丰富的变异类型，包括早熟、穗型等类型的变异。尤其是早熟和育性变异，最早熟变异比对照早10天抽穗，所有被处理水稻材料均有比对照早抽穗2～3d的突变单株，但也有少数植株抽穗比对照迟3～7d。本试验表明利用模拟空间环境来诱发水稻早熟突变是可行的。在育性分离差异方面，结实率分离幅度较大，大都在80％～90％之间，但其中XZ9216有1株结实率低于2％。从变异类型出现的频率来看，各类分离程度大小依次为早熟＞育性＞株高＞穗型＞粒型。
4突变性状遗传稳定性从诱变处理第2代中筛选出的早熟、育性等变异性状稳定，并且能真实遗传到下代。除株高突变在第3代个别单株中有略矮类型分离外，早熟、育性、穗型、粒型等变异农艺性状均未发现进一步分离。第3代筛选出26个早熟单株，32个外观垩白小、米质透明单株，11个株型理想、产量高、穗型好的单株，还有比对照早抽穗10d的97-1c-62突变株系，千粒重27.2克，穗长17.8cm，实粒数111粒，平均株高99.4cm，比对照高1cm；这些变异单株或株系基本保持了原亲本农艺性状。从XZ9216中筛选出1个不育突变株经过7代提纯回交和测交，已转育成醇香、优质、早熟三系配套的新籼型杂交组合，进入小面积试种和产量测定。
结论经模拟空间环境处理的水稻根尖细胞染色体畸变率比卫星搭载的或其他物理因素处理的低，各种细胞染色体畸变类型数量的多少也与空间条件处理的有差异。模拟空间环境处理的染色体桥和微核畸变率高于其他类型畸变频率。
模拟空间环境处理水稻干种子对当代苗期的生理损伤程度小，而且第2代出现丰富的变异，其中以早熟较为明显。当选的早熟和不育突变株在不改变其他农艺性状前提下能稳定地遗传，并能直接或间接用于育种，说明模拟空间环境诱变处理技术在水稻新品种改良中有着潜在的利用价值。
从被处理的水稻材料来看，常规杂交F1经模拟空间环境处理后，出现的各类变异最为丰富。早熟突变株比亲本抽穗期早10d，不育突变株连续3代保持稳定遗传。这说明利用杂合材料用作诱变亲本更为理想。
权利要求
1.一种植物育种方法，其特征是先将待处理的植物种子或离体培养物置于模拟空间环境处理，经适宜周期后进行种植选育或培养。
2.根据权利要求1所述的植物育种方法，所述模拟空间环境为采用磁屏蔽装置，其磁强为≤20nT。
3.根据权利要求1所述的植物育种方法，所述置于模拟空间环境处理是在室温下进行的。
4.根据权利要求1所述的植物育种方法，所述植物包括粮食作物、蔬菜和花卉。
5.根据权利要求1所述的植物育种方法，所述离体培养物是花药。
6.根据权利要求1所述的植物育种方法，所述适宜周期是≥180天。
全文摘要
一种地面模拟空间环境植物育种方法。先将待处理的植物种子或离体培养物置于模拟空间环境，经适宜周期处理后进行种植选育或培养。所述植物包括粮食作物、蔬菜和花卉。本方法为开展地面模拟空间环境诱变育种，进行品种改良提供了一种新的途径。
文档编号A01H1/06GK1502224SQ0214915
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月25日 优先权日2002年11月25日
发明者刘录祥, 王晶, 赵林姝, 金海强, 赵世荣, 郑企成, 陈文华 申请人:中国农业科学院原子能利用研究所