专利名称：鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法
技术领域：
本发明属于低温生物学中的动物胚胎低温保存技术，是一种在液氮(-196℃)中长期保存鱼类胚胎的玻璃化冷冻方法。
背景技术：
种质资源是水产养殖生产、优良品种培育及水产养殖业可持续发展的重要物质基础。我国是一个水生生物种质资源较为丰富的国家，丰富多样的水生生物种质资源和遗传多样性对于我国水产养殖业的快速发展起到了非常重要的作用。然而，由于渔业资源地过度捕捞、无序利用及人工放流等，造成了某些鱼类资源的衰退和濒临灭绝，如长江鲥、松江鲈等。如果不及时采取保护措施，若干年后，在自然界中将难以找到许多鱼类原种、良种的遗传资源。因此，建立重要养殖鱼类原种、良种及珍稀濒危鱼类的种质资源库，将这些鱼类的种质资源和遗传多样性以活的形式长期保存起来，已成为鱼类种质资源保护和鱼类低温生物学研究中亟待攻克的重要科技问题。
由于鱼卵和胚胎体积大(直径通常为1-7mm，而哺乳类卵直径多数在200μm以内)、含水量多、卵膜通透性差、胚胎由胚体和卵黄囊两种结构组成、卵黄含量高，因此鱼类胚胎的超低温冷冻保存一直是国际鱼类低温生物学界的一个难题。迄今，国际上尚未建立鱼类胚胎超低温冷冻保存的有效技术。在本发明作出之前，加拿大维多利亚大学生物系的Harvey(1982)以斑马鱼为材料率先开展了鱼类胚胎低温保存研究。随后，国内外许多学者对淡水鱼类胚胎冷冻保存技术开展了大量研究，并取得一些进展。在鱼卵和胚胎冷冻方法上，试用过的方法有分段慢速降温、分段快速降温和玻璃化法3种。分段慢速降温一般为将样品从室温慢速(2-5℃/min)降到冰点的温度，然后再以极慢的速率(0.05-0.5℃/min)降至约-60℃左右，再以约1-2℃/min降至-85℃，停留约10分钟，最后快速降温至-196℃的保存温度。上海理工大学低温生物工程室的Zhang X.S等(1989)采用这种慢速降温方法在进行鲤鱼胚胎冷冻保存时，从在液氮中保存20分钟的16枚胚胎中获得了3枚复活的胚胎，但遗憾的是，这个实验结果在随后的研究中却再也重复不出来。第二种方法是分段快速降温法。这种方法与慢速降温的主要差别就是从0℃到-60℃，采用2-5℃/min的较快速降温速率。上海水产大学的张克俭等(1997)采用这种降温方法对草鱼和泥鳅胚胎进行了冷冻保存实验，并偶尔取得个别胚胎复活的成功事例，但实验结果不能重复。以上实验均因胚胎细胞内形成冰晶，而导致胚胎死亡。第三种冷冻降温方法就是玻璃化冷冻法。这种方法借助于极快速降温，使细胞内和细胞外的液体越过结冰过程，而直接形成玻璃状固体，从而避免细胞内形成冰晶，减少冰晶形成对细胞的损伤，保持细胞结构的完整性。台湾水产研究所的Chao N等(1997)比较了几种玻璃化液对斑马鱼胚胎冷冻保存的影响，表明DAP2B(2M DMSO+1M乙酰胺+3M丙二醇)的效果优于VSI(20.5％DMSO+15.5％乙酰胺10％丙二醇)的效果，但未获得冷冻复活的胚胎。英国Luton大学的Zhang和Rawson(1996)研究了斑马鱼胚胎玻璃化冷冻保存的可行性，表明丁二醇可以形成玻璃化的最低浓度为3Mol/L，几种不同抗冻剂的混合物可以形成玻璃化，尽管解冻后胚胎形态正常，但未获得复活的斑马鱼胚胎。美国Washington国家动物园的Hagedorn等(1998)重点研究了斑马鱼胚胎对抗冻剂的渗透屏障，但未获得过冷冻复活的鱼类胚胎。在美国Louisiana州立大学农业中心的Tiersch T和MazikPM博士(2000)合著的《Cryopreservation in Aquatic Species》这本权威专著中，将鱼类胚胎冷冻保存列为迄今世界上尚未攻克的难题之一。国内长江水产研究所的章龙珍等(2001)观察了泥鳅胚胎在不同玻璃化液中的存活时间，从中筛选出了几种可形成玻璃化的抗冻剂溶液，胚胎在这些玻璃化液中的存活时间可以长达70min，但未获得冷冻复活的鱼苗。因此，尽管一些学者对淡水鱼类胚胎的玻璃化技术进行了许多研究，但迄今尚未获得成功，也没有建立切实可行的玻璃化冷冻保存技术。而有关海水鱼类胚胎的冷冻保存，特别是牙鲆和鲈鱼胚胎的玻璃化冷冻保存技术，均未查到任何文献和专利报道。
发明内容
针对鱼类胚胎具有体积大(直径为1-7mm)、含水量多、卵膜通透性差、胚胎由胚体和卵黄囊两种结构组成、卵黄含量高等特点，本发明专利的目的是通过建立鱼类胚胎玻璃化冷冻技术，解决在冷冻降温过程中胚胎细胞内形成冰晶，导致胚胎死亡的难题，从而攻克鱼类胚胎超低温冷冻保存的技术难关，为建立鱼类胚胎冷冻库、长期保存鱼类种质资源提供技术手段。
本发明是按照以下操作技术来实现的胚胎收集，镜检合格后在培养皿中培养至体节出现期时使用；用玻璃化基础溶液(BS2)稀释抗冻剂1，2-丙二醇(缩写为PG)和甲醇(缩写为MeOH)混合物，配制成不同浓度的玻璃化液(FVS1-FVS4)，其组成为50-67％BS2，20-30％PG及13-20％MeOH；将处于体节出现期-出膜前期的鱼类胚胎逐级在浓度递增的玻璃化液中各浸泡9-11分钟，进行冻前平衡；将平衡好的胚胎转入塑料麦管，封口后直接投入液氮中进行冷冻保存；需要解冻时，将麦管从液氮中拿出后进行快速解冻。将解冻后的胚胎放在洗脱液中洗脱10分钟，洗脱液为在BS2中添加0.125Mol/L蔗糖的溶液；然后，添加灭菌海水进行培养。
胚胎收集和适宜发育时期的确定采集鱼类胚胎，通过抗冻剂处理确定适宜玻璃化冷冻的胚胎发育时期，表明从体节出现期到尾芽期的胚胎均适宜进行玻璃化冷冻保存。
玻璃化基础溶液(BS2)的配制(为100ml水中的重量比)NaCl 2.472％、KCl 0.086％、CaCl2.2H2O 0.146％、MgCl2.6H2O 0.486％、NaHCO30.019％。
抗冻剂为1，2-丙二醇(PG)和甲醇(MeOH)，其浓度分别为20-30％和13-20％。
玻璃化液的配制本发明中使用的4种玻璃化液的配方分别为FVS1含BS2 67％，PG 20％及MeOH 13％；FVS2含BS2 60％，PG 24％及MeOH 16％；FVS3含BS2 55％，PG 27％及MeOH 18％；FVS4含BS2 50％，PG 30％及MeOH20％。
胚胎的冻前平衡处理将胚胎逐级依次在浓度为25％，33％，50％，67％及100％的玻璃化液中分五步进行平衡处理，共计45-55分钟，每步平衡约9-11分钟。
玻璃化冷冻将在最后一级玻璃化液中平衡好的胚胎10余粒连同约250ul玻璃化液吸入直径为3mm，长为10cm的麦管，用热压封口后，以2000℃/min以上的降温速率，将麦管迅速投入液氮中(-196℃)冷冻保存。
洗脱液的配制在基础溶液BS2中添加蔗糖，浓度为0.125Mol/L。
解冻和培养将冻存麦管从液氮中拿出，迅速放入39-40℃水浴中，使其快速解冻，麦管从液氮中移出到进入水浴的时间在1-2秒。待胚胎乳白色即将消失时将麦管从水浴中拿出，剪去封口，用0.125M的蔗糖2ml将麦管中的胚胎冲到培养皿中进行洗脱，时间为10min；添加灭菌海水进行培养。
与已有技术对比，本发明技术具有如下特点
(1)传统的鱼类胚胎冷冻保存技术是程序控制慢速降温法，这种方法无法避免胚胎细胞内形成冰晶，因而在鱼类胚胎冷冻保存中始终未能获得成功。本发明技术采用独特的玻璃化液配方和工艺流程，建立的玻璃化冷冻法的降温速率极高， 能最大限度减少降温过程中胚胎细胞内冰晶的形成，使胚胎免受冰晶的损伤，从而获得冷冻复活的胚胎和鱼苗。
(2)本发明技术可重复获得冷冻复活的牙鲆胚胎，而以前在淡水鱼类上利用程序控制降温法只是偶尔获得一次复活的胚胎，实验结果不能重复。本发明技术在8次玻璃化冷冻保存实验中均获得过数量不等的牙鲆冷冻复活胚胎，从冷冻保存的292粒牙鲆胚胎中共获得复活胚20粒，冷冻解冻后胚胎最低复活率为1.64％，最高复活率为32.35％，冷冻胚胎平均复活率达6.8％。
(3)应用本发明技术多次成功地使冷冻复活胚胎继续发育并孵化出鱼苗，这一结果为国内外首次获得，居国际领先水平。我们在5次玻璃化冷冻保存实验中，均获得过冷冻复活胚胎继续发育并孵化出鱼苗的结果。在20枚冷冻复活胚胎中，共有14枚冻胚孵化出鱼苗，孵化率为70％。冷冻复活胚胎孵化出的鱼苗，胚体透明，形态正常，无畸形，与未冷冻的正常鱼苗完全一样。充分证明，本发明技术具有可靠性和可重复性。
(4)本发明技术无需使用昂贵的仪器设备，操作较为简单，成本低廉，易于推广。
具体实施例方式
鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法其技术路线是胚胎收集→胚胎质量及发育阶段的确定→筛选玻璃化基础液和抗冻剂→玻璃化液的制备→胚胎冷冻前在玻璃化液中的平衡→胚胎向麦管中的转移、麦管的封口、含胚胎的麦管的平衡→在液氮中的冷冻保存→麦管的解冻→胚胎的洗脱与平衡→胚胎的培养。
现以牙鲆胚胎进行的玻璃化冷冻保存的成功实验叙述如下
(1)胚胎收集按照常规技术进行牙鲆生产性育苗，收集人工条件下自然产卵的牙鲆受精卵在14-16℃培养，用显微镜观察胚胎发育阶段，选取发育至肌节出现期、尾芽期、心跳期、出膜前期等不同时期胚胎作为冷冻保存材料。
(2)胚胎玻璃化基础溶液的筛选鱼类胚胎都是在一定的水环境中发育的。海水鱼类胚胎和鱼苗发育和生活的环境与淡水鱼类完全不同。因此，必须根据海水鱼类胚胎的生理状况，配制相适应的基础溶液。我们在大量实验的基础上，选用NaCl、KCl、CaCl2.2H2O、MgCl2.6H2O、NaHCO3等配制成4种不同浓度的溶液，在室温(15-16℃)下对牙鲆原肠期胚胎进行培养，使其发育至出膜，统计其孵化率。选择成活率最高的溶液作为配制玻璃化液和洗脱液的基础溶液(缩写为BS)。其结果见表1
表1不同基础液配方筛选结果
基础溶 基础液成分(％)
液名 NaCl KCl CaCl2 MgCl2. NaHCO3 总盐度 胚胎孵化率(％)
称 .2H2O 6H2O (％)
BS12.3750.0760.1360.4660.0183.06878.33±16.37
BS22.4720.0860.1460.4860.0193.20981.5±5.57
BS32.5720.0860.2360.5660.0283.48874.84±6.01
BS42.7920.11 0.23 0.64 0.03 3.80270.73±10.17
由表1可见，基础溶液BS2产生的胚胎孵化率最高(81.5％)，故选用BS2作为配制玻璃化液和洗脱液的基础溶液。
(3)抗冻剂毒性的比较不同种类抗冻剂对不同鱼类胚胎的毒性不尽相同，我们以大菱鲆胚胎为材料，进行了抗冻剂筛选实验。将大菱鲆神经胚分别放在二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甘油、乙二醇(EG)，1，2-丙二醇(PG)及甲醇(MeOH)中平衡处理70min，然后观察胚胎的发育，计数成活率。其结果示于表2。
表2.不同种类抗冻剂毒性的比较
抗冻剂 DMSO DMF甘油 EGPG 甲醇
胚胎数(粒)
10 13 23 14 13 12 11 22 15 19 14 11 141312 1828 17
(n＝3)
成活胚数 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 4 12 4 06
成活率％ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64.4 30.8 100 22.2 035.2
平均成活率％ 0 0 0 0 65.1 19.2
结果表明，只有PG(1，2-丙二醇)和甲醇中的胚胎存活，成活率分别为65.1％和19.2％，其它抗冻剂中的胚胎全部死亡，可见PG的毒性最低，其次为甲醇。故将1，2-丙二醇(PG)和甲醇(MeOH)选作海水鱼类胚胎冷冻保存的抗冻剂。
(4)适宜玻璃化的抗冻剂的筛选能否形成玻璃化及玻璃化状态的好坏，是建立玻璃化冷冻技术的关键之一。利用1，2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙二醇(EG)和二甲基亚砜(DMSO)等6种抗冻剂，以毒性最小的PG为主因子，在15、20、25、30％(v/v)四个浓度梯度水平上进行组合，利用BS2为基础溶液，配制成A、B、C、D四组80种不同组成、不同浓度的抗冻剂溶液。将上述各种抗冻剂溶液充装在麦管中后置于液氮(-196℃)中冷冻10-30min，然后在40℃水浴中迅速解冻，同时观察冷冻和解冻时的玻璃化状态，将玻璃化记为“+”，非玻璃化或脱玻璃化记为“-”，实验重复3次，选择冷冻和解冻时玻璃化次数最多的抗冻剂用于玻璃化液配制。现将筛选出的玻璃化程度较好的几种溶液的结果列于表3
表3玻璃化液组成及解冻温度
玻璃 总浓度 玻璃化程度*
化液 组成 易玻璃化解冻温度
代号 (％v/v)冷冻 解冻 (℃)
VSD1 PG4+MeOH145 3+2+，1-37～38
VSD2 PG4+MeOH250 3+2+，1-35～42
VSD5 PG4+Gly1 45 3+2+，1-42
VSD9 PG4+DMF1 45 3+2+，1-39
VSD10PG4+DMF2 50 2+，1-2+，1-39～40
VSD14PG4+EG2 50 3+2+，1-35～37
注在冷冻时“3+”表示3次玻璃化，在解冻时“2+，1-”表示2次玻璃化，1次脱玻璃化。
从表3可以看出，上述几种玻璃化溶液的玻璃化概率较高，玻璃化程度较好，但它们在解冻时保持玻璃化状态所要求的温度不尽相同。有些玻璃化液的玻璃化状态不错，但他们所要求的解冻温度不是过低(如VSD1和VSD14)，就是温度范围太狭小(如VSD5和VSD9)。而只有VSD2的玻璃化状态又好，又能在35-42℃的较宽水温范围内解冻而保持玻璃态。
因此，从抗冻剂的毒性及其玻璃化性质等方面综合考虑，我们筛选出适宜进行玻璃化冷冻的理想抗冻剂为1，2-丙二醇(PG)和甲醇(MeOH)。
(5)牙鲆胚胎玻璃化溶液的配制及筛选用步骤(1)中筛选出的基础溶液BS2将抗冻剂1，2-丙二醇(缩写为PG)和甲醇(缩写为MeOH)按一定比例混合，配制成如下四种玻璃化溶液(FVS1-FVS4)FVS1含BS267％，PG 20％及MeOH 13％；FVS2含BS2 60％，PG 24％及MeOH 16％；FVS3含BS2 55％，PG 27％及MeOH 18％；FVS4含BS2 50％，PG 30％及MeOH 20％。然后将牙鲆肌肉效应期胚胎放在上述玻璃化溶液中进行平衡处理。现将处理后的胚胎的成活率、孵化率及畸形率列于表4。
表4牙鲆肌肉效应胚在不同玻璃化液中的成活率(％)
玻璃化液 FVS1 FVS2FVS3 FVS4
胚胎成活率(％)54.29±4.4638.68±12.2037.8±1.51 27.71±1.29
孵化率(％)86.49±8.7887.87±5.24 69.21±14.139.42±5.43
畸形率(％)3.25±5.29 9.63±4.46 3.70±6.41 35.71±12.37
由表4可见，胚胎在玻璃化液FVS1、FVS2和FVS3中平衡处理后的成活率和孵化率都明显高于FVS4处理组，而畸形率则明显低于FVS4处理组。由此表明，玻璃化液FVS1、FVS2和FVS3都较适合于牙鲆胚胎的玻璃化冷冻保存。
(6)适宜玻璃化处理的胚胎发育时期的确定胚胎发育时期不同，对抗冻剂及玻璃化液的耐受能力不同。针对第(1)条中的胚胎收集，本条将牙鲆4-5对体节胚、16-18对体节胚、尾芽期胚和心跳期胚分五步进入玻璃化液FVS3中，分别处理30min、40min和50min，然后用0.125mol/L蔗糖液洗脱10min。加入灭菌海水培养一定的时间，统计成活率，结果如表5
表5不同发育时期牙鲆胚胎在玻璃化液FVS3中处理后的成活率
由表5可以看出，4-5对肌节胚、16-18对肌节胚和尾芽期胚在玻璃化液FVS3中平衡处理不同时间后的成活率都较高，而心跳期胚对FVS3的适应能力则明显低。由此表明，4-5对肌节胚、16-18对肌节胚及尾芽期胚胎较适合于玻璃化液处理。
(7)胚胎平衡温度的确定分别在15℃和4℃下，利用FVS3五步法处理牙鲆尾芽开始形成期胚胎40min，不经冷冻，直接用0.125mol/L的蔗糖洗脱10min，用过滤海水培养(15.5℃)，统计其成活率，比较不同平衡温度对胚胎成活率的影响，结果见表6。由表6可见，牙鲆胚胎在15℃平衡后的成活率明显高于在4℃下的成活率，故选定15℃为有效平衡温度。
表6不同平衡温度下尾芽胚的成活率(％)
平衡温度℃15.0 4.0
五步平衡时间min 40 40
洗脱时间min 10 10
成活率(％)83.67±5.7666.27±14.47
(8)胚胎在玻璃化液中平衡步骤的确定采用一步法、三步法或五步法将肌节出现期胚胎逐步过渡到玻璃化液(20％DMSO和25％二甲基甲酰胺)中在室温下平衡处理40分钟，后用1mol/L蔗糖液洗脱，再用12℃过滤海水培养，观察其成活率和孵化率；结果如表7所示
表7胚胎在不同平衡方法下的成活率
由表7可见，经3次重复试验，肌节期胚胎采用五步法平衡后的成活率和孵化率明显高于三步法和一步法组，因此，在随后的冷冻保存实验中，都采用五步平衡法。
(9)玻璃化冷冻将在玻璃化液中平衡好的胚胎，连同玻璃化液一起吸入麦管，麦管直径为2.5mm，长度为10cm。每管吸入250μl玻璃化液，其中胚胎10余枚，使胚胎在麦管中均匀分布，避免聚集在一起；用火封口后，将麦管以2000℃/min以上的降温速率投入-196℃的液氮中进行玻璃化冷冻保存。保存时间长短根据实际需要确定。
(10)洗脱液的筛选采用五步法将尾芽期胚胎放在VSD2玻璃化液中平衡处理30min，然后在-20℃冷冻10min，分别用0.0625、0.125、0.25、0.5或1.0Mol/L蔗糖溶液进行洗脱，10min后将胚胎转移至海水中，在室温下(15℃)培养一定时间，统计成活率。如表8所示。
由表8可见，0.125Mol/L蔗糖液的洗脱效果最好，胚胎成活率最高。
表8不同浓度蔗糖液的洗脱效果
蔗糖浓度(M) 0.0625 0.125 0.25 0.5 1.0
总样本数 72 85 7786 105
成活胚5 14 6 77
平均成活率(％)4.7618.8 8.67 9.83 5.7
(11)胚胎解冻和培养将麦管从液氮中取出，快速插入39-40℃水浴中，不停的摇动解冻，麦管从液氮中移出到进入水浴的时间在1-2秒，时间过长会反玻璃化，导致胚胎破碎。在水浴中玻璃态由透明变乳白，再变透明，胚胎的乳白色即将消失时将麦管从水浴中拿出，剪去封口，迅速用2ml 0.125M的蔗糖洗脱液冲到培养皿中洗脱，洗脱10min后加入14-16℃灭菌海水培养，直到鱼苗孵化出膜。现将牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存的主要结果示于表9。
表9牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存结果
玻璃化胚胎发育冷冻 样本数复活复活率孵出鱼苗数成活时间
溶液 时期时间 胚数(％)(h)
FVS3 14体节胚1h 211 4.76 1 108
FVS1 尾芽胚 1h 3411 32.35 9 90
FVS3 尾芽胚 7h33min352 5.71 1 67
FVS3 尾芽胚 1h22min321 3.13 0 18
FVS4 尾芽胚 1h8min 441 2.27 0 72
FVS4 尾芽胚 2h20min351 2.86 0 61
FVS2 肌肉效应1h31min302 6.67 2 62
期胚
FVS3 出膜前胚2h34min611 1.64 1 14
总计 20 14
由表9可见，应用上述技术方案，对牙鲆体节期胚，尾芽胚，肌肉效应胚，出膜前期胚进行了玻璃化冷冻保存实验，在8次不同的玻璃化冷冻保存实验中，成功地获得冷冻复活胚胎。从292枚冷冻胚胎中，共获得20枚完全复活的胚胎，冻胚复活率最高可达32％，解冻后胚胎形态正常，继续发育并孵化出鱼苗，其中14枚复活胚胎成功孵化出鱼苗，复活胚胎孵化出鱼苗的百分率高达70％，冻胚孵化出的鱼苗形态正常。
权利要求
1.一种鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法，其特征在于它的操作技术是，包括鱼类胚胎收集、制备基础液和筛选抗冻剂、配制玻璃化液、胚胎冷冻前的平衡处理、投入到液氮中予以冷冻保存等，之后待需时，予以解冻培育，其鱼类胚胎收集为体节出现期—出膜前期；玻璃化液配制是基础液和抗冻剂的混合液，基础液(BS2)为NaCl 2.472％、KCl 0.086％、CaCl2·2H2O 0.146％、MgCl2·6H2O 0.486％、NaHCO3 0.019％；抗冻剂为1，2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)；玻璃化液配方是BS250-67％，PG20-30％，MeOH13-20％；胚胎冷冻前的平衡处理将胚胎逐级依次在浓度为25％、33％、50％、67％及100％的玻璃化液中分五次进行平衡处理，处理45-55min，每步9-11min；液氮中速冻保存将平衡好的胚胎9-13粒连同250ul的玻璃化液吸入到直径3mm、长10cm麦管内，热压封口后，以2000℃/min的降温速率投入到-196℃液氮中速冻保存；解冻和培育将麦管从液氮中移出，在1-2秒钟时间内快速插入39-40℃水浴中使其迅速解冻，在胚胎乳白色即将消失时，剪开麦管，用2ml 0.125M的蔗糖洗脱液，将胚胎冲入器皿中进行洗脱，时间为10min，之后添加14-16℃灭菌海水进行培育。
全文摘要
一种鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法，通过比较不同抗冻剂的毒性效应和玻璃化性能，筛选出适宜海水鱼类胚胎的玻璃化液配方；确定适宜玻璃化处理的胚胎发育时期，研制出特定的洗脱溶液，采用分步平衡、快速降温和解冻的技术路线，建立了鱼类胚胎玻璃化冷冻保存技术。对牙鲆不同发育时期胚胎进行了8次玻璃化冷冻实验中共获得冷冻复活胚20粒，最高复活率达32％。其中5次实验中获得冷冻复活胚胎发育孵化出鱼苗的结果。在20枚冷冻复活胚胎中，有14枚冻胚孵化出鱼苗，孵化率高达70％。冻胚孵出的鱼苗，胚体透明，形态正常，无畸形。本发明技术无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，易于推广，可用于牙鲆等海水鱼类胚胎超低温(－196℃)冷冻保存。
文档编号A01K61/00GK1552200SQ0311241
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月29日 优先权日2003年5月29日
发明者陈松林, 田永胜 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所