专利名称：一种获得安全型抗黄花叶病转基因小麦的方法
技术领域：
本发明涉及利用生物工程手段培育抗病植物的方法，特别是涉及培育抗小麦黄花叶病毒小麦品种的方法，尤其是涉及获得安全型抗黄花叶病转基因小麦的方法。
背景技术：
小麦黄花叶病是由小麦黄花叶病毒(Wheat Yellow Mosaic Virus，WYMV)引起的一种病毒病，是小麦的重要病害之一。早春时分，当田间气温回升至10℃左右时，病害开始进入发病高峰，温度继续上升至18-20℃时开始显症，小麦黄花叶病在田间的典型症状是病叶表现黄花叶或条纹花叶，严重时使植株明显矮化，叶片枯黄扭曲，不能抽穗结实，一般会造成小麦减产20-30％，重者达到50-70％，甚至颗粒无收。小麦黄花叶病毒在田间病土经4年，干燥病土室内贮藏9年仍有致病力。传统的抗病育种在生产上发挥了一定的作用，但由于小麦品种资源抗源有限，育种进程漫长，小麦黄花叶病的防治一直是生产上的难题。
植物基因工程的发展为防治该病开辟了一条新途径。1985年Sanford John首先提出病原体引发抗性的概念，即利用病毒的某些基因，如外壳蛋白基因和复制酶基因，通过人工合成和改造并将其转入植物，使植物对病毒产生抗性。目前，已提出并应用的策略有两大类一类是病毒来源基因介导的抗性。应用较多的基因有外壳蛋白、复制酶、移动蛋白基因和其他一些序列；另一类是非病毒来源的基因介导的抗性，有来自植物的抗性基因、毒素蛋白基因以及来自动物的病毒抗性基因等。各种策略均有其优点和不足之处，其中外壳蛋白基因介导的抗性是研究最早，也是目前应用最多的抗病毒基因工程策略。而复制酶基因介导的抗性，由于它独有的优点和特点而逐渐引起人们的注意。植物RNA病毒的复制酶是依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRp)是病毒基因组编码的自身复制不可缺少的部分，特异地合成病毒的正、负链RNA。复制酶基因是病毒非结构蛋白基因，一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成的。复制酶介导抗性机理主要是源于病毒的复制酶基因干扰病毒的复制。
大多数单子叶植物，特别是重要的禾谷类作物，不具有明显的创伤反应，从而使农杆菌转化方法的应用极大地受到了限制，与双子叶植物相比，其转化技术要滞后许多。小麦是最后一个获得成功转化的主要禾谷类作物，直至1991年，Vasil等才利用基因枪法转化小麦悬浮细胞获得了转化的愈伤组织，1992年，他们利用同样的方法转化长期培养的胚性愈伤组织，将编码β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)的Gus基因和抗除草剂基因bar(草丁膦解毒基因)导入了小麦，首次获得了小麦转基因植株，由于这种胚性愈伤组织不易获得且费时费工，1993年，他们又用基因枪法直接轰击幼胚愈伤组织，获得了可育转基因小麦株系。Weeks等也通过基因枪法转化小麦愈伤组织获得了可育的转bar基因的小麦植株，转化效率约为0.1-0.2％(Vasil等，1992；Vasil，1993；Weeks等，1993)。但这些转化方法的转化效率至今仍不够理想，其具体的转化参数、流程尚需要优化、改良，目的基因的表达、稳定遗传等问题也需要开展更为深入的研究。
转基因作物带来巨大经济和社会效益的同时，其安全性问题也日益受到人们的重视。选择标记基因在转基因的研究中是一个用于区分转化细胞和非转化细胞的必不可少的重要基因，它的使用大大加速了转基因技术的发展。但选择标记基因也带来了一些不利因素，目前广泛使用的有效标记基因只有少数几种，而在基因工程操作过程中往往需要对同一基因片段进行多次转化，不易找到合适的选择标记基因；另外选择标记基因的表达可能会对转化细胞中的其它基因的表达产生负面作用，导致结果分析的复杂化；同时选择标记基因在转基因作物中的存在增加了它们分布环境的不确定性，由此带来转基因作物的环境安全性问题，对转基因作物的环境释放有很大的制约作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗黄花叶病转基因小麦的方法，用该方法培育的小麦没有标记基因，是一种安全型小麦。
一种培育抗黄花叶病转基因小麦的方法，包括以下步骤1)用基因枪轰击小麦愈伤组织，所述基因枪的子弹中包含放在两个不同T-DNA片段内的序列表中的SEQ ID №1目的基因及筛选基因；2)培养愈伤组织获得转基因植株；3)转基因植株进行自交传代，在自第二代起的植株中挑选只具有目的基因，没有筛选基因的植株，即为安全型抗黄花叶病转基因小麦。
序列表中的SEQ ID №1为复制酶基因Nib8，由1212bp组成，属于依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，是病毒基因组编码的自身复制酶不可缺少的一部分。包含该复制酶基因Nib8的植物表达载体pUbiNiB8，其图谱如图1所示。
所述两个不同T-DNA片段可以是连锁的，也可以存在于不同的DNA分子上。转化过程中两个T-DNA片段分别被整合到植物基因组的不同位置上，在减数分裂的过程中标记基因和外源基因将被分离，达到剔除标记基因的目的。
所述筛选基因优选为抗除草剂的草丁膦解毒基因，当然也可以是其它标记基因，如卡那霉素等。含筛选基因bar的质粒pAHC20的图谱如图2所示。
用于轰击的愈伤组织优选用小麦幼胚愈伤组织，是小麦幼胚在SD2培养基上，在黑暗条件下培养7-9天得到的；为了使转化的效果更好，轰击前应在0.4mol/L渗透压培养基上处理4-6小时。
所述轰击后的愈伤组织在0.4mol/L渗透压培养基上处理16-18h后，转入SD2培养基黑暗条件下，26℃恢复培养2周，再移到分化培养基上，24℃诱导分化，每日10小时光照，3-5周出现绿芽。
一般情况下，采用分子检测的方法挑选所述只具有目的基因，没有筛选基因的植株，扩增功能基因的上游引物为5’-ATGATCAGAATGTTGGAAGACGCCGGCC-3’，下游引物为5’-GGAGCTCAATGCTGCTATCACCATAGTG-3’；扩增选择标记基因草丁膦解毒基因的上游引物为5’-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3’，下游引物为5’-GTTTCTGGCAGCTGGACTTC-3’。
利用本发明的方法可以获得高水平的抗病毒植株。复制酶基因介导的抗性强，对完整的病毒粒子和裸露的病毒RNA都具有高度抗性或免疫，对高剂量接种也有抗性。抗性持续时间长，寄主整个生活史不发病，而且对高温(31℃)敏感。抗性水平与整合到染色体上的基因拷贝数无关。
本发明利用基因枪法进行转化，在一定程度上改善了采用原生质体转化系统时培养及再生困难的障碍，重复性较高，操作方法也相对简单。同时巧妙地利用共转化的方法将标记基因剔除，使转基因植物的安全性得到了保障。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为重组DNA质粒pUbiNib8的图谱。
图2为质粒pAHC20的图谱。
图3为本发明的技术路线图。
图4为RT-PCR扩增电泳图谱。
具体实施例方式
实验材料与方法；1、转化所用质粒质粒pUbiNIb8(5.4kb)含Ubiqutin(2.0Kb)启动子调控的复制酶基因Nib8基因(1212bp)(如图1所示)，复制酶基因Nib8从扬州地区的病毒株系中分离得到。
质粒pAHC20(5.5kb)含Ubiqutin(2.0Kb)启动子调控的筛选基因bar(0.6kb)(如图2所示)。
2、植物材料供试小麦品种为扬麦158、鲁麦22、鲁麦23、鲁麦21、鲁875067、烟2980、烟8017-2、山农25931、济17。
3、所用培养基(1)LB培养基每升含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。
用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。加2％的琼脂配成固体培养基。
(2)MS基本培养基参照Murashige T.&Skoog F.(1962)文献报道，用于组织基本培养。
(3)诱导培养基 MS+Asp150mg/L+2、4-D 2.0mg/L(4)渗透压培养基MS+36.43g/LMannital+36.43g/LSorbital(5)分化培养基 1/2 MS+5mg/L zeation+3mg/L Bialaphos(6)伸长培养基 1/2 MS+5mg/L Bialaphos(7)壮苗培养基 1/2 MS+0.5mg/L IAA+4mg/L Bialaphos4、生化试剂生化试剂如表1所示表1实验所用试剂试剂类型购自常用化学试剂 北京市化学试剂商店限制性内切酶类 Promega公司、华美生物工程公司同位素α-32PdCTP 北京亚挥生物医学工程公司PCR试剂盒 华美生物工程公司TRZOL试剂盒 GIBCOBRL公司DNA回收试剂盒 原平皓物工程公司Taq DNA Polymerase 华美生物工程公司5、酚-氯仿大量提取DNA与纯化方法1)取新鲜的叶片3-5克，在液氮冷冻下，迅速研磨成粉末放到50ml离心管中，加入SDS提取液，充分混匀。将离心管置于65℃水浴温浴1小时，其间温和混匀几次。
2)离心管，加入等体积的酚-氯仿(v/v＝1∶1)溶液，混匀后离心，3000rpm离心20min。
3)将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的预冷异丙醇，轻轻混匀，静置20min，挑出DNA，4)70％的乙醇清洗2-3次，室温下干燥至乙醇完全挥发，溶于5ml1×TE(pH8.0)中。
5)加入10ul RNA酶溶液(10mg/ml)，混匀，37℃保温2小时。
6)加入等体积的酚-氯仿溶液，轻轻混匀，3000rpm离心15min。
7)取上清液，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH4.8)，混匀后加入二倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，静置30min，钩出DNA，用70％的乙醇清洗2次，室温下干燥至乙醇完全挥发。
8)加适量1×TE(pH8.0)溶解DNA。
9)取少量样品于0.8％Agarose胶中电泳，检测DNA的质量，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，4℃或-20℃贮存备用。
6、Southern杂交所需溶液及其配制(参照Sambrock等的方法进行)20×SSC每1000ml含NaCl175.3g；柠檬酸钠88.2gNaOH，调节pH值至7.020×HBS3mol/L NaCl；0.1mol/L PIPES；20mmol/L EDTA pH6.8Denhardt’s III每100ml含2％Fioll 400；2％PVP360；2％Gelatin；10％SDS；5％Na2P2O7·10H2O预杂交液于50ml离心管中依次加入ddH2O、5×HBS和Denhardt’sIII，混匀后置于65℃水浴中，各溶液用量视膜的多少而定，具体如表2所示表2、预杂交液中各种成分的用量
ssDNA(Salmon Sperm DNA，10mg/ml)需用超声波打断，并在使用前于100℃变性7分钟后迅速置于冰上，待50ml离心管中的预杂交液澄清后加入。
实施例1、安全型抗黄花叶病转基因小麦的获得一、受体材料的准备1、田间选取授粉后14天左右的麦穗(颖壳开始撑开，籽粒开始变绿，内含少量淀粉)，室内收集适宜籽粒(幼胚大小为1.0-1.5mm)；2、超净工作台内用70％的乙醇中浸泡消毒30秒；
3、10％的次氯酸钠溶液中摇动灭菌15-20分钟；4、灭菌水冲洗3次；5、轻轻剥取幼胚，盾面向上接种在SD2诱导愈伤组织培养基，黑暗条件下(26℃)诱导愈伤组织；6、7天后将愈伤组织集中在培养皿中央，经0.4mol/L渗透压培养基处理4-6小时做基因枪轰击之用。
二、制备微粒子弹1、称取30mg金粉(BioRad公司产品，直径为1.0μl)置于1.5ml微量离心管中，加500μl灭菌水，消毒备用；2、配制2.5M CaCl2100ml消毒备用；3、制弹取15μl金粉颗粒悬浮液于一无菌的1.5ml离心管中，14000rpm离心30秒，去上清液，加1ml无菌水，离心5分钟，去掉水，依次加入15μl质粒pUbiNIb8 DNA(1μg/)，15μl质粒pAHC20DNA220μl无菌水250μlCaCl2(2.5M)50μl亚精胺(0.1M，现配现用)；将混合液涡旋10分钟14000rpm离心5分钟，去除上清液，用600μl无水乙醇洗涤，14000rpm离心1分钟，去除酒精，250μl无水乙醇重悬金粉颗粒，准备用于约25次轰击。
三、基因枪轰击1、将基因枪放置于超净工作台上，紫外灯杀菌30分钟以上，70％乙醇擦净基因枪真空室及各部件；2、阻挡网和装膜器在无水酒精中浸泡15分钟，用酒精灯烤干；3、载体膜、可裂膜于无水乙醇中消毒15分钟，然后置于无菌滤纸上，在超净台上吹干；4、装弹，取10μl子弹液均匀涂在载体膜中央，待干；5、取出盛载体膜的器件，拧开盖子，先将阻挡网放入凹槽中，然后把装有载体膜的器件倒扣于凹槽上，拧紧盖子；6、可裂膜装在固定盖中，并旋紧；7、将组装好的盛载体膜的器件放在真空室上数第二个格子里，载有要轰击的愈伤组织的培养皿放在上数第四个格子里，轰击距离为5cm；
8、抽真空按VAC键，当真空度达到25-28inchesHg时，将VAC键直接锁定在HOLD位置；9、轰击按住FIRE键，直至可裂膜爆裂，再按VENT键，使真空表指针回零，打开真空室小门，取出样品。
四、转化体筛选1、轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养基上处理16-18h；2、转入SD2培养基黑暗条件下(26℃)恢复培养2周；3、移到分化培养基上诱导分化，24℃条件下，每日10小时光照，3-5周出现绿芽，分子检测结果表明，本发明的转化率为2.38％；4、转到伸长培养基上培养，24℃条件下，每日10小时光照，3-5周小苗长到1-2cm；5、移入壮苗培养基上，再生植株生长到适宜大小(苗高6-8cm，根系较好)时移入花盆，置于温室；6、转基因植物进行自交传代。
五、无选择标记的安全型抗黄花叶病转基因小麦的获得1、采用酚-氯仿方法提取自交第2代以后(第3代、第4代，依此类推)转基因小麦植株基因组，进行PCR扩增；功能基因的上游引物为5’-ATGATCAGAATGTTGGAAGACGCCGGCC-3’，下游引物为5’-GGAGCTCAATGCTGCTATCACCATAGTG-3’，扩增程序为先在94℃下变性5min，然后94℃变性50sec，67℃复性1min，72℃延伸2min，共计35个循环，最后在72℃下延伸10min。选择标记基因bar基因的上游引物为5’-AAGCACGGTCAACTTCCG TA-3’，下游引物为5’-GTTTCTGGCAGCTGGACTTC-3’，扩增程序为先在94℃下变性3min，然后94℃变性1min，54℃复性30sec，72℃延伸30sec，共计30个循环，最后在72℃下延伸5min。
其中，反应液的加入量为0.2ml微量离心管中，加入10×PCR buffer 2.5μldNTP(10mM each) 0.5μlMgCl2(25mM) 2.0μlPrimer1(10pmol/μl) 0.8μlPrimer2(10pmol/μl) 0.8μl小麦基因组DNA模板2.0μlTaq酶(5U/μl)0.5μlH2O至总体积 25μl2、PCR产物在1％的琼脂糖胶上电泳后，筛选只具有功能基因，而不具备选择标记bar基因的植株，即为安全型抗黄花叶病转基因小麦。
用PCR技术检测了转基因株系的268个T3单株，PCR扩增分析，获得了只含Nib8基因而没有bar基因的28个转基因单株。
实施例2、利用RT-PCR分析鉴定转基因植株1、取实施例1中筛选出的第3代安全型抗黄花叶病转基因小麦，氮下研磨100mg样品转入DEPC处理过的1.5ml管中。
2、加450μlPLT(使用前，PLT温热使沉淀重新溶解并确保加巯基乙醇于PLTbuffer中10ulME/ml PLT)剧烈震荡。
3、溶解液转到2mlQIAshredder Spin Colume中，以最大速度离心两分钟，将流下的部分转移到新管中。
4、加0.5体积(通常225μl)无水乙醇至新管的溶解液并通过充分吸打混合。
5、将样品(约675μl)连同沉淀转移到2ml的Rneasy minispin Column中，以至少10000r/min离心15秒。(这一步是调节结合状态，倒出流出部分液体后在step6继续使用此管)6、700μl buffur Rw1至Rneasy column通过至少10000r/min离心15秒对其进行洗涤。
7、将Rneasy Column转入一个新的2ml收集管中，抽吸500ul RPE至Rneasy Column中，并以10000r/min离心15秒。
8、加500μl RPE(使用前确保RPE中已加4体积乙醇)至Rneasy column以最大速度离心两分钟以干燥Rneasy membrane。
9、将Rneasy column放入新管中，以最大速度离心一分钟。
10、转移Rneasy column到1.5ml新管中，抽吸30-50ul RNase-free水至Rneasymembrane上，以10000r/min离心一分钟至洗脱。用同一管加另外30-50μl RNase-free水重复这一步骤。
11、测算RNA浓度并琼脂糖电泳检测RNA完整性。
12、加如下成分于0.5ml管中(冰上操作)total RNA 8μl10×buffer 1μlRQ 1RNase-Free Dnase1μl(1unit/lu)13、37℃温育15分钟。
14、加stop buffer 1μl(20uM EDTA)。65℃温育15分钟，然后放在冰上1分钟使酶灭活，稍许离心收集反应物。
15、在RNase-free处理过的管中依次加入如下混合物5ug总RNAnμl10mM dNTP 1μlOligo(dT)12-18(0.5ug/ul)1μlDEPC-treated water至10μl16、样品于65℃温育5分钟然后放在冰上至少1分钟。
17、接着依次加入如下混合物10×RT buffer 2μl25mM MgCl24μl0.1M DTT2μlRNase Inhibitor 1μl轻轻混合并稍许离心。
18、样品于42℃温育2分钟。
19、加1μl SuperScriptII RT至每一管中并于42℃温育50分钟。
20、70℃温育15分钟以终止反应，然后放在冰上。
21、稍许离心收集反应物，加1μlRNaseH于管中，37℃温育20分钟。设立对照，，除了不加SuperScriptII RT外，其它步骤如上。
结果如图4所示，图中1.PCR marker；2.阳性对照；3.扬麦158；4.反转录时未加反转录酶的转基因植株；5-9.为反转录时加反转录酶的转基因植株。从图中可以看出，反转录时加反转录酶的5个转基因株系中，除8以外其余4个株系的扩增带与用质粒做模板得到的扩增带相同，说明外源基因在转基因植株的RNA水平上得到了表达。
实施例3、转基因植株抗病性鉴定用实施例1的方法得到的第二代安全型转Nib8基因植株抗病性鉴定在江苏省里下河地区农科所病圃进行，毒土来源于江苏省宜兴重病区，以抗源宁9312、仪宁小麦、扬辐93-11和宁丰小麦为抗病对照，扬麦158为感病对照。采用0-3级的方法统计病株发病及3级以上重病株，重复3次。其标准如下0级无病症；1级部分叶片轻度黄化，无明显条纹坏死斑和黄化现象；2级花叶和条纹明显，部分黄化矮缩，部分叶片、分蘖和整株枯死。3级心叶严重花叶，或是扭曲或是缩顶状，全部黄化矮缩，部分叶片和分蘖和整株枯死。结果见表1。在15个T2代株系中，有11个株系的发病率与感病亲本扬麦158相似，说明这11个株系基因功能不表达。但另有4个株系N12、N13、N14、N15表现高抗，其中N12、N13、N14感病株数为0，发病率为0，N15仅有1株轻度感染，发病率为2.17％，远远低于感病对照扬麦158的发病率(47.83％)，也略低于4个抗源的发病率(分别为4.35％、2.27％、4.17％、8.70％)，第二年将上年选出的4个抗病转基因株系，在江苏扬州市的3个点(农科所农场、姜堰、仪征)继续进行抗性跟踪鉴定，结果仍表现高抗。
表3、T2代转基因植株抗WYMV病毒鉴定结果编号鉴定株数感病株数3级感病株数发病率％N12 19 0 0 0.00N13 48 0 0 0.00N14 42 0 0 0.00N15 46 1 0 2.17Yangmai 158(CK1) 46 224 47.83扬麦158(对照1)Ning 9312(CK2) 46 2 0 4.35宁9312(对照2)Yining wheat(CK3) 44 1 0 2.27仪宁小麦(对照3)
序列表<160>1<210>1<211>1212<212>DNA<213>RNA-dependent RNA polymerase(wheat yellow mosaic virus，WYMV)<400>1gatcgatgca ggttgtttca gacatgcagt ggaacacttc cgccggacct agctaccagg 60gcaagaaaag agacgtttgc gcacatctca gcgagcagga agttctacac cctgcagaaa 120cgtcgcgaca gcagtttcta gctcgcaatt ccatcggcta ttggaacgga tcgctcaaag 180cggagcttag gaccattgag aaagtggaag ctgagaaaac cacagttttc acggcttcgc 240caatcacgag tctattcgcc atgaagttct acgttgacga tttcaacaac aagttctatg 300cgacaaactt gaaagctcca cacacggtag gaatcaacaa attcagcaga ggctgggaaa 360tgctccacga caagatcaac cgcccaggtt ggcttcacgg cagtggccat gggtcacgat 420ttgatagttc aattgatcct ttcttcttcg acataatcaa ggacattcga aagcactttc 480taccagttga gcaccatcgc gcaatcgacc taatatacca cgacgttctc aacaccaaca 540tttgtttggc aaatggcatg gtgattcgaa agaacgttgg gaataacagc gggcagccaa 600gcacggtcgt agacaacaca cttgttctca aggtctcttt tctctacgct tacattcata 660aaaccgggga ccatatgctc aagaaactta acgacagatt tgttttcgtc tgcaatggtg 720acgacaacaa atttgccatt tccccagagt tcgacgccga gttcggtaca gacttttcac 780cggagcttac agagctaggt ttgacgtacg agtttgacga cataacagat gacatctgtg 840caaaccccta catatccctg accatggtcc gcactccctc tggaattggg ttctctttgc 900ccgtggaacg cattgtagca ataatgcagt gggctaagaa gggcggcgtt ctgcactctt 960acttggcagg aatctcagcc atttacgaaa gcttcaacac accaaagttg ttcaaatcad1020tctatgcgta tttgctatgg ctgacacacc aacacggctc tgacatccta gctgcgatga1080ccggaacaga gacagctctc ccaatcccct ccatgctcga tgtgtaccgc ctccactatg1140gtgatagcag cattgagctc caagcagctg acacacaaac agacgcgcag aaggaggaag1200ctcgactgca gt121权利要求
1.一种培育抗黄花叶病转基因小麦的方法，包括以下步骤1)用基因枪轰击小麦愈伤组织，所述基因枪的子弹中包含放在两个不同T-DNA片段内的序列表中的SEQ ID No1目的基因及筛选基因；2)培养愈伤组织获得转基因植株；3)转基因植株进行自交传代，在自第二代起的植株中挑选只具有目的基因，没有筛选基因的植株，即为安全型抗黄花叶病转基因小麦。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述两个不同T-DNA片段是连锁的或存在于不同的DNA分子上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述筛选基因为抗除草剂的草丁膦解毒基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述小麦愈伤组织为小麦幼胚在SD2培养基上，在黑暗条件下培养7-9天得到的幼胚愈伤组织；轰击前0.4mol/L渗透压培养基上处理4-6小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述轰击后的愈伤组织在0.4mol/L渗透压培养基上处理16-18h后，转入SD2培养基黑暗条件下，26℃恢复培养2周，再移到分化培养基上，24℃诱导分化，每日10小时光照，3-5周出现绿芽。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于用分子检测的方法挑选所述只具有目的基因，没有筛选基因的植株，扩增功能基因的上游引物为5’-ATGATCAGAATGTTGGAAGACGCCGGCC-3’，下游引物为5’-GGAGCTCAATGCTGCTATCACCATAGTG-3’；扩增选择标记基因草丁膦解毒基因的上游引物为5’-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3’，下游引物为5’-GTTTCTGGCAGCTGGACTTC-3’。
全文摘要
本发明公开了一种获得安全型抗黄花叶病转基因小麦的方法，目的是提供一种培育抗黄花叶病转基因小麦的方法，用该方法培育的小麦没有标记基因，是一种安全型小麦。一种培育抗黄花叶病转基因小麦的方法，包括以下步骤1)用基因枪轰击小麦愈伤组织，所述基因枪的子弹中包含放在两个不同T－DNA片段内的序列表中的SEQID №1目的基因及筛选基因；2)培养愈伤组织获得转基因植株；3)转基因植株进行自交传代，在自第二代起的植株中挑选只具有目的基因，没有筛选基因的植株，即为安全型抗黄花叶病转基因小麦。本发明利用基因枪法进行转化，重复性较高，操作方法也相对简单。同时巧妙地利用共转化的方法将标记基因剔除，使转基因植物的安全性得到了保障。
文档编号A01H1/00GK1534096SQ0312154
公开日2004年10月6日 申请日期2003年4月1日 优先权日2003年4月1日
发明者徐惠君, 马有志, 杜丽璞, 庞俊兰, 张新梅, 叶兴国, 陈剑平, 陈炯, 陈顺和, 吴宏亚 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所