专利名称：兜兰的无菌播种和组织培养技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及兜兰的无菌播种和组织培养技术。
背景技术：
兜兰(Epidendrum)又名拖鞋兰，本属植物全球约有70多种，附生或地全部为珍贵的濒危物种，在我国所有的原生种都是国家一级保护植物。兜兰的栽培和育种历史悠久，目前有大量的杂交品种，在世界范围内有众多的狂热爱好者。兜兰的繁殖多采用分株法，繁殖速度慢；而兜兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发，其无菌播种技术虽早有研究，但普遍存在萌发率低，成苗率低的困难，其无性增殖更是困难重重；目前兜兰的商业生产中往往利用自交生产种苗，而兜兰的现代杂交种的倍性复杂，往往只能获得少量种子，难以进行大规模生产。
本发明提供的兜兰的无菌播种和组织培养技术，采用人工营养液利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌播种出的原球茎和小苗进行增殖，通过生根培养能形成完整植株。
发明内容
本发明提供的兜兰的无菌播种和组织培养技术，在开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后120天，果实成熟时取下，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分种，无菌水冲洗4-5次切开果实，用接种针将白色粉末状胚接种到改良R培养基(R培养基+NDM培养基维生素成分)附加10％的椰子汁、6-苄基嘌呤0.5毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升、活性碳2g/升的培养基中，30天左右胚萌发，萌发率在30％-95％之间，60天左右形成整株后，接种到改良R培养基附加马铃薯提取液100毫升/升、6-苄基嘌呤0.2毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升的壮苗培养基上壮苗培养。为获得更多的种庙，利用原球茎或小苗继代培养在改良R培养基附加6-苄基嘌呤2-5毫克/升、萘乙酸0.2毫克/升上，能形成芽和类原球茎混合组织，这类组织在壮苗培养基上，30天后可形成带短根的丛生植株，及时将植株分开，接种到新的壮苗培养基上培养壮庙，种子萌发与生根壮苗时蔗糖浓度以2％最佳，继代培养时以3％最佳，当试管苗长至3-4厘米时，转移到自然光下炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入蕨根和水苔的混合基质中，保持适当的通风和足够的湿度，移栽的成活率可达90％以上。
本发明所述的技术包括如下的步骤1、材料开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后果实120天成熟做为外植体用播种。
2、无菌播种用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水漂洗4-5次后切开果实，用接种针将白色粉末状胚接种到附加6-苄基嘌呤0.5毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升、活性碳2g/升、10％椰子汁和NDM培养基维生素成分的R培养基中，30天左右胚萌发，60天左右形成完整小植株，及时将小植株转入改良R培养基附加马铃薯提取液100毫升/升、6-苄基嘌呤0.2毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升壮苗培养基。
3、组织培养将无菌播种产生的原球茎或小苗培养在改良R培养基附加6-苄基嘌呤2-5毫克/升、萘乙酸0.2毫克/升上能形成芽和类原球茎混合组织，在相同的培养基上能进行继代增殖，将混合组织接种到壮苗培养基上，30天后可形成带短根的丛生植株，及时将植株分开，接种到新的壮苗培养基上培养壮苗。
4、试管苗移栽试管苗壮苗培养90天后(植株约3-8厘米高)，转移到自然光下炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭∶蕨根为1∶1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽成活率可达90％以上。所用培养基种子萌发与壮苗时蔗糖浓度以2％最佳，增殖培养时以3％最佳，pH5.8-6.0，琼脂0.7％。培养温度(26±2)℃，光照度1500-2000Ix，光照12小时/天。
本发明所述的无菌播种和试管育苗技术，与现有技术相比，具有萌发率高，出苗快，苗壮，种苗品质好、生长良好等优势。本发明供试材料有广泛代表性，可作为兜兰属其它种、属内或与其它属间杂种的无菌播种和组织培养方法，具有配方简单有效、投入少，产出高的特点，培养设备简单，因而有很好的应用前景。
实施例1、材料开花时选取生长健壮的兜兰母株进行人工授粉，授粉后果实120天成熟，做为外植体用播种。
2、无菌播种取下果实，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水漂洗4-5次后切开果实，用接种针将白色粉末状胚接种到附加6-苄基嘌呤0.5毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升、活性碳2g/升、10％椰子汁和NDM培养基维生素成分的R培养基中，30天左右胚萌发，60天左右形成完整小植株，及时将小植株转入改良R培养基附加马铃薯提取液100毫升/升、6-苄基嘌呤0.2毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升壮苗培养基。
3、组织培养将无菌播种产生的原球茎或小苗培养在改良R培养基附加6-苄基嘌呤2-5毫克/升、萘乙酸0.2毫克/升上能形成芽和类原球茎混合组织，在相同的培养基上能进行继代增殖，将混合组织接种到壮苗培养基上，30天后可形成带短根的丛生植株，及时将植株分开，接种到新的壮苗培养基上培养壮苗。
4、试管苗移栽试管苗壮苗培养90天后(植株约3-8厘米高)，转移到自然光下炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入泥炭∶蕨根为1∶1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽成活率可达90％以上。所用培养基种子萌发与壮苗时蔗糖浓度以2％最佳，增殖培养时以3％最佳，pH5.8-6.0，琼脂0.7％。培养温度(26±2)℃，光照度1500-2000Ix，光照12小时/天。
权利要求
1.一种兜兰的无菌播种和组织培养技术，其特征在于，在开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后120天，成熟果实取下，用75％的酒精浸泡30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒20分种，无菌水冲洗4-5次切开果实，用接种针将白色粉末状胚接种到培养基中，60天左右形成整株后，接种到壮苗培养基上壮苗培养，为获得更多的种苗，利用原球茎或小苗继代培养在改良R培养基附加6-苄基嘌呤20毫克/升上能形成芽和类原球茎混合组织，这类组织在壮苗培养基上，30天后可形成带短根的丛生植株，及时将植株分开，接种到新的壮苗培养基上培养壮苗，当试管苗长至3-4厘米时，转移到自然光下炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入蕨根和水苔的混合基质中，保持适当的通风和足够的湿度，形成完整植株。
2.根据权利要求1中所述的兜兰无菌播种和试管育苗技术，其特征在于所述种子萌发与生根壮苗时蔗糖浓度为2％，继代培养时蔗糖浓度为3％。
3.根据权利要求1中所述的无菌播种和试管育苗技术，其特征在于所述种子萌发培养基为NDM培养基维生素成分的改良R培养基附加10％的椰子汁、6-苄基嘌呤0.5毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升及活性炭2克/升。
4.根据权利要求1中所述的兜兰无菌播种和试管育苗技术，其特征在于所述实生苗培养基为改良R培养基附加马铃薯提取液100毫升/升、6-苄基嘌呤0.2毫克/升、萘乙酸0.5毫克/升。
5.根据权利要求1中所述的兜兰无菌播种和试管育苗技术，其特征在于所述增殖培养基为改良R培养基附加6-苄基嘌呤2-5毫克/升、萘乙酸0.2毫克/升。
6.根据权利要求1中所述的兜兰无菌播种和试管育苗技术，其特征在于所述试管苗移栽的条件为培养基为泥炭∶蕨根为1∶1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，所用培养基pH5.8-6.0，琼脂0.7％，培养温度(26±2)℃，光照度1500-2000Ix，光照12小时/天。
7.根据权利要求1中所述的兜兰无菌播种和试管育苗技术，其特征在于所述技术可作为兜兰属其它种、属内或与其它属间杂种的无菌播种和组织培养方法。
全文摘要
本发明涉及兜兰的无菌播种和组织培养技术。兜兰又名拖鞋兰，在我国所有的原生种都是国家一级保护植物。而兜兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发，其无菌播种技术虽早有研究，但普遍存在萌发率低，成苗率低的困难，其无性增殖更是困难重重；目前兜兰的商业生产中多利用自交生产种苗，而兜兰的现代杂交种的倍性复杂，往往只能获得少量种子，难以进行大规模生产。本发明提供的兜兰的无菌播种和组织培养技术，采用人工营养液利用无菌播种的方法能获得大量试管苗，并利用无菌播种出的原球茎和小苗进行增殖，通过生根培养能形成完整植株。具有萌发率高，出苗快，苗壮，种苗品质好生长良好等优势。
文档编号A01H4/00GK1541519SQ20031011203
公开日2004年11月3日 申请日期2003年11月6日 优先权日2003年11月6日
发明者陈之林, 叶秀麟, 孙彩云, 杨燕仪, 易琦斐, 段俊, 曾宋君, 梁承邺 申请人:中国科学院华南植物研究所