专利名称：一种获得并繁育羊草无性系的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得并繁育羊草无性系的方法。
背景技术：
羊草隶属单子叶植物纲、禾本科、禾亚科、早熟禾系、大麦族、野麦亚族、赖草属植物，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。主要分布于俄罗斯、朝鲜、蒙古及我国东北、内蒙古、河北、山西、陕西、新疆等省区。羊草是多年生根茎型禾草，对不同的生境条件表现出很强的生态适应性，对改善我国北方草原生态环境和西部盐渍化土地治理具有重大生态意义。同时，羊草是一种重要的牧草资源，蛋白质含量高，营养价值高，适口性好，耐践踏，是一种优质牧草。
“体细胞变异somatic variance”也称“克隆变异clone variance”，是指体细胞在繁殖过程中出现的各种变异。细胞诱变是获得植物体细胞变异的方法之一，是植物育种，研究与开发植物种质资源，特别是牧草及草坪草育种的重要途径之一。羊草体细胞诱变是创造新的变异品种的方法之一，通过体细胞变异诱导植株，进行高品质品种筛选，提高资源丰度。获得植物体细胞变异的方法有组织培养和原生质体培养，化学诱变及物理诱变法等。目前，人们利用这些诱变方法已经获得了多种植物的突变体。但到目前为止，尚没有一种方法成功地用于羊草的诱变研究并获得突变体。
低能重离子(简称低能离子)是指能量在10keV-100keV之间，原子序数大于氦的剥离原子核。19世纪70年代，低能离子束被广泛的应用于物理材料表面的修饰，它与生物体的相互作用研究是近十几年的事情。科学家应用不同的材料进行离子注入的生物效应和作用机理的研究，揭开了一个新的生命科学研究领域，如低能离子束与生命起源和进化的关系，环境中低剂量辐射的危害以及低能离子束对生物遗传物质的修饰作用等。
发明创造内容本发明的目的是提供一种获得并繁育矮化，返青早，根茎生长快的羊草的方法。
本发明所提供的繁育羊草无性系的方法，是使用N+离子辐照羊草愈伤组织，再培养经N+离子辐照后的愈伤组织，得到矮化，返青早，根茎生长快的羊草；所述N+离子辐照中N+的能量可为20-30keV、脉冲剂量可为1.4-3.4×1016N+/cm2，优选为N+的能量为25keV、脉冲剂量为2.6×1016N+/cm2。
其中，进行N+离子辐照的羊草愈伤组织可由常规方法得到，最好是以羊草幼穗为外植体，以含0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培养基为愈伤组织诱导培养基培养得到的羊草愈伤组织，且最好为紧密型愈伤组织。
经N+离子辐照后的愈伤组织的分化培养基最好为含有1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6培养基，培养条件最好为25℃，光照强度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。
本发明将低能离子诱变法应用于羊草愈伤组织，获得了矮化，返青早，根茎生长快的羊草无性株系。本发明方法的特点是实用性强，诱变效率高，具有重要的理论意义和实际意义。
具体实施例方式
实施例1、一种获得并繁育羊草无性系的方法繁育羊草的工艺流程为原材料无性繁殖→幼穗培养→继代培养→低能离子辐射→植株再生→幼苗移栽→大田形态鉴定→分子鉴定。具体方法和过程如下1、植物材料来源及特征本实施例采用的羊草“无性系3号”原产于河北省沽源牧场蒙古大营，它是经以下筛选得到的先从河北省沽源牧场蒙古大营的13个种质中选择形成68个无性克隆系，然后将25个无性系移栽到中科院植物研究所试验田(北京)，最后通过预备实验筛选出植株(试管苗)再生能力较强的“无性系3号”羊草作为本实施例的实验材料。“无性系3号”的特点是4月30日前后返青，5月营养枝高46cm，生殖枝高72cm，叶色深蓝，叶毛少，叶宽0.41cm，叶长18cm，群体抽穗率42％，每平米的枝数230，穗型复生，穗长18cm，每穗小花数114，茎叶比1.64，产草量(鲜重)约2.6kg/平方米。
2、幼穗培养(1)羊草外植体处理采集孕穗期的羊草幼穗，长度为4-7cm，幼穗完全被叶鞘紧密包裹。从田间取回的材料在超净工作台内用75％的酒精将包裹幼穗的叶鞘擦拭几遍，然后小心剥出幼穗，叶鞘中的幼穗一般是无菌的，无需消毒。
(2)培养基培养基的基本成分是N6培养基，在诱导愈伤、继代、诱导分化、生根等培养基中需添加适当激素、蔗糖和琼脂，所有培养基的pH均调整为5.8，培养基先分装，然后在120℃高压锅内灭菌20min。
(3)愈伤组织的诱导将无菌幼穗切成3mm左右的小段，接种在含有0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培养基上。25℃恒温暗培养，培养4周统计结果。
3、愈伤组织的继代愈伤组织形成后，将紧密型愈伤组织转到含有2，4-D 0.5mg/1的N6培养基上继续培养，每4-5周继代1次。
4、低能离子辐照选取继代的紧密型愈伤组织，将其分为对照组和处理组，将处理组放在无菌的培养皿内，置于靶室中进行离子注入。小靶室本身消毒，并在样品进出时通入无菌空气，保证样品不受杂菌污染。处理组N+离子能量为25key，脉冲剂量分别为1.4×1016，1.8×1016，2.2×1016，2.6×1016，3.4×1016N+/cm2；对照组除没有N+离子注入外，其他条件同处理组。
5、植株再生及幼苗移栽将辐照后和未经辐照的愈伤组织切成2-4mm大小，分别转移到继代培养基(含有2，4-D 0.5mg/l的N6培养基)上，1周后成活率如表1所示，结果说明各处理对愈伤组织存活率有显著影响，剂量越高愈伤组织存活率越低。将存活的愈伤组织接种到附加1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6分化培养基(经过筛选，在这个培养基上愈伤组织的分化频率最高，平均达到67％)。25℃恒温，光照强度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。一个半月左右再生频率如表2所示，结果说明各处理对愈伤组织再生频率无统计上的显著影响。将3-5mm长的芽转移到生根培养基(不含激素的1/2MS基本培养基)中生根，生根后的试管苗移栽到装有按照1∶1比例混合沙土的小盆中，在温室中过度一周，成活后转到试验田，移栽成活率平均96％。共获得1280个无性系，其中对照组306个株系，处理组974个株系。
表1 离子注入剂量与愈伤组织存活率的关系
*离子为N+离子，注入能量是25keV/次**相同的字母表示在统计上无显著差异。
表2 离子注入剂量与愈伤组织再生频率的关系
*离子为N+离子，注入能量是25keV/次**愈伤组织再生频率是指存活的愈伤组织的再生频率***相同的字母表示在统计上无显著差异。
6、大田形态鉴定在不同发育时期对移栽植株进行了形态记录。包括株高，叶色，叶长，叶宽，叶数，无性繁殖量，有性繁殖量，穗长，小穗数，小花数，结实率等。植株数目与样方面积的比值定义为植株密度，并折算为1平方米面积内的植株密度，茎重与叶重的比值定义为茎叶比；二者重量之和为样方面积内的产草量，并折算为1平方米面积内的产草量。始花期对以上性状重复测量，并记录营养枝和生殖枝的数量，将二者的比值定义为抽穗率。种子成熟期进行室内考种，包括穗长，每株种子产量，小穗数，小花数，千粒重，结实率等性状。结果如表3所示，表明N+离子能量为25keV，脉冲剂量为2.6×1016N+/cm2时得到的形态变异(称“典型无性系”)适合羊草作为优良牧草和草坪草的需要。与对照“无性系3号”相比，本方法获得的“典型无性系”具有以下显著特点植株矮化(营养枝高28cm，生殖枝高39cm)，叶色深绿，叶间距缩短，叶形变宽(0.65cm)，穗轴缩短(6cm)，返青早(3月5-15日)，根茎生长快(枝数316/平方米/周年)，产草量提高(3.18kg/平方米)。
表3 离子注入诱导的形态变异概率
注“-”表示未发生新的形态变异6、分子鉴定采用分子标记分析RAPD大田取200mg幼嫩叶片按CTAB法提取基因组DNA。纯化后用含0.5g/mL溴化乙锭的0.8％琼脂糖电泳检测，模板DNA浓度平衡为100ng/μL。RAPD反应总体积为20μL，其组分为MgSO42mmol/L；(NH4)2SO410mmol/L；KCl 10mmol/L；TrisHCl(PH9.0)50mmol/L；Triton X-100 0.1％；dNTP各200μmol/L；引物0.2μmol/L；基因组模板DNA 100ng；Taq plusI DNA聚合酶0.75U(购自上海生工工程公司)，超纯水13.25μl；加16μl石蜡油。PCR扩增程序94℃预变性5min，然后每个循环94℃ 40s，41℃ 90s，72℃ 70s，40个循环后，72℃延伸10min，PCR在N.J.Co.Ltd.AmpGene4800热循环仪上完成。反应结束后PCR产物在2％琼脂糖胶[EB(溴化乙锭)含量0.5mg/L]，1×TAE缓冲液为介质中，100V电泳1.5h，电泳结束后，紫外灯检测并照相。用λDNA/EcoRI+HindIII做分子量标记。
结果如表4所示，表明在对照组306个株系中，没有发现明显的形态变异，但检测到1个株系的DNA发生了变化，即减少了一条RAPD条带，变异频率为1/208＝0.48％。而处理组974个株系，发生了14个形态变异，变异频率为14/974＝1.44％；还检测到53条RAPD带发生了DNA水平上的变异，变异频率为181/3706＝4.88％。
表4 离子注入诱导的RAPD变异效率
权利要求
1.一种获得并繁育羊草无性系的方法，是使用N+离子辐照羊草愈伤组织，再培养经N+离子辐照后的愈伤组织，得到矮化、返青早、根茎生长快的羊草无性系；所述N+离子辐照中N+的能量为20-30keV、脉冲剂量为1.4-3.4×1016N+/cm2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述N+的能量为25keV，脉冲剂量为2.6×1016N+/cm2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于进行N+离子辐照的羊草愈伤组织是以羊草幼穗为外植体，以含0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培养基为愈伤组织诱导培养基培养得到的。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于进行N+离子辐照的羊草愈伤组织为紧密型愈伤组织。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于经N+离子辐照后的愈伤组织的分化培养基为含有1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6培养基。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于经N+离子辐照后的愈伤组织的培养条件为25℃，光照强度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。
全文摘要
本发明公开了一种获得并繁育羊草无性系的方法，其目的是提供一种获得并繁育矮化、返青早、根茎生长快的羊草的方法。本发明的繁育羊草的方法，是使用N
文档编号A01H1/06GK1543777SQ200310115338
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月19日 优先权日2003年11月19日
发明者刘公社 申请人:中国科学院植物研究所