专利名称：生产抗α－疱疹病毒介导的感染的哺乳动物的方法和用该方法得到的哺乳动物及其子代的制作方法
已知可以通过疱疹病毒的基因组以及它们的生物学特征来区分不同类型的疱疹病毒。
这些病毒中的一个亚科为α-疱疹病毒(alphaherpesvirus)，其实例包括1型和2型人单纯疱疹病毒(HSV-l和HSV-2)、Aujeszky’s病病毒或伪狂犬病病毒(PRV)和1型牛疱疹病毒(BHV-1)。
所有的这些病毒都有嗜神经性及具有非常短的复制周期和宿主谱广的特性。
这些病毒的感染可造成表皮病变，通常位于粘膜内，随后病毒播散到神经系统，它可以引起急性感染和潜伏感染。
引起的损害最严重的α-疱疹病毒的实例是PRV，因该病原体所造成的直接花费以及因此所采用的对付该病原体的手段，使其成为在猪生产中具有很大经济重要性的一种致病体。
该病毒广泛地存在于大部分的猪高产区(欧洲、北美和亚洲)。
目前有一些抗PRV病毒的疫苗，这些疫苗说明存在世界范围内的市场需求。
然而这些疫苗有着一些缺点，具体的就是接种大量动物群所需的费用以及与之相关的实际问题，这使得这个操作是特别难行的，由于一般都需要进行几次注射，因此使得该操作更加难行。
该操作的费用及局限可能限制了它的使用并因此也可能限制了它的作用。
也应用了不同的根除病毒的策略，但结果都很差。
造成感染性牛鼻气管炎的BHV-1病毒在畜牧业上也引起严重的问题。
事实上该病毒在新生牛和更大龄的牛中都具有高传染性，它可以引起鼻腔和喉部炎症、眼部病变和呼吸问题，并且它也可以在脑部引起脑炎或甚至影响生殖系统。
对新生牛经常是致命的各种问题对农民就意味着严重的减产，此外，在奶牛中还观察到牛奶产量的显著下降。
也有一些抗BHV-1病毒疫苗，但疫苗具有与在猪养殖中所用的抗PRV病毒疫苗一样缺点。
此外，已经发现肌肉内注射抗BHV-1病毒疫苗可以造成孕牛的流产。
在一些欧洲国家也已经特别地提出要根治这种病毒，但是已经证实因为病毒的潜伏特性使得这是特别困难的，病毒在实际发病之前可以在生物体内长时间保持无活性，只在应激下才发病。
因此，一种容许生产组成型地抗PRV病毒的转基因猪系或甚至组成型地抗BHV-1病毒的转基因牛系的方法的想法将是具有相当大的经济学意义的。
本发明的目的是提出这样一种方法。
根据在鼠模型上所进行的研究，实现这一目的是可能的，该鼠模型象猪或牛一样，对特定的α-疱疹病毒且特别是HSVl和PRV病毒是敏感的。
已知α-疱疹病毒与细胞的结合首先归功于病毒糖蛋白gC(其使得病毒体的成分进入)与细胞表面上的类肝素硫酸膜的相互作用，同时随后病毒体包膜与细胞膜融合，然后生成其它的糖蛋白(gB、gD、gH和gL)。
许多工作都集中于对哺乳动物宿主细胞表面上的α-疱疹病毒的潜在受体的研究，这些受体具有与病毒颗粒的结合能力并因此能中和它的感染能力。
至今已经鉴定出四种α-疱疹病毒的受体蛋白，即-HVEM或HveA，是一种HSV1和HSV2病毒的侵入介质，但不是PRV病毒的侵入介质(Montgomery，R.I.，Warner，M.S.，Lum B.J.，andSpear，P.G.(1996).Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by anovel member of the TNF/NGF receptor family.Cell 87，427-436)。
-三个免疫球蛋白超家族的成员(HveB或柄蛋白-2(nectin-2)；HveC或柄蛋白-1(nectin-1)和HveD)。
(Cocchi，F.，Menotti，L.，Mirandola，P.，Lopez，M.，and Campadelli-Fiume，G.(1998).The ectodomain of a novel member of the immunoglobulinsubfamily related to the poliovirus receptor has the attribute of a bona fidereceptor for herpes simplex virus types 1 and 2 in human cells.J.Virol.72，9992-10002；Geraghty，R.J.，Krummenacher，C.，Eisenberg，R.J.，CohenG.H.，and Spear，P.G.(1998)Entry of alphaherpesviruses mediated bypoliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor.Science 280，1618-1620；Shukla，D.，Liu，J.，Blaiklock，P.，Shworak，N.W.，Bai，X.，Esko，J.D.，Cohen，G.H.，Eisenberg，R.J.，Rosenberg，R.D.，and Spear，P.G.(1999).A novel role for 3-O-sulfate heparan sulfate in herpes simplex virusentry.Cell 99，13-22；Warner，M.S.，Martinez，W.，Geraghty，R.J.，Montgomery，R.I.，Witbeck，J.C.，Xu，R.，Eisenberg，R.J.，Cohen，G.H.，andSpear，P.G.(1998).A cell surface protein with herpesvirus entry activity(HveB)confers susceptibility to infection by herpes simplex virus type 2，mutants of herpes simplex virus type 1 and pseudorabies virus.Vriology 246，179-189.)根据文献Spear，P.G.(1993).Entry of alpha-herpesviruses into cells.Semin.Virol.4，167-180；Campadelli-Fiume，G.，Arsenakis，M.，Farabegoli，F.，and Roizman，B.(1988).Entry of herpes simplex virus 1 in BJ cells thatconstitutively express viral glycoprotein D is by endocytosis and results indegradation ofthe virus.J.Virol.62，159-167，已经说明除了与类肝素硫酸的最初结合外，还有α-疱疹病毒的糖蛋白gD与细胞表面上的受体之间的相互作用，这容许病毒以感染的形式侵入细胞，以及在特定的细胞类型中，HSV-1、PRV和BHV-1病毒可以利用糖蛋白gD的常见受体侵入细胞内。
因此已经证实蛋白HVEM可以容许HSV1和HSV2病毒侵入到非许可细胞内，但不容许PRV病毒侵入。
在另一个方面，已经证实HveC蛋白，特别是猪的HveC蛋白不仅作用为HSV1病毒也作用为动物的α-疱疹病毒PRV和BHV-1病毒的功能性受体。(Milne，R.S.B.，Connolly，S.A.，Krummenacher，C.，Eisenberg，R.J.，and Cohen，G.H.(2001).Porcine HveC，a member of the highlyconserved HveC/nectin 1 family，is a functional alphaherpesvirus receptor.Virology 281，315-32g；Cocchi，F.，Menotti，L.，Mirandola，P.，Lopez，M.，and Campadelli-Fiume，G.(1998).The ectodomain of a novel member oftheimmunoglobulin subfamily related to the poliovirus receptor has the attributeof a bona fide receptor for herpes simplex virus types 1 and 2in human cells.J.Virol.72，9992-10002；Geraghty，R.J.，Krummenacher，C.，Eisenberg，R.J.，Cohen G.H.，and Spear，P.G.(1998)Entry of alphaherpesvirusesmediated by poliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor.Science 280，1618-1620)。
与病毒糖蛋白gD结合的能力可更具体地归结于HveC的V结构域和HVEM的前两个富含半胱氨酸结构域(“CRD”)(Structure-BasedAnalysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Presenton Herpesvirus Entry Mediator HevA(HVEM).Connolly SA，Landsburg DJ，Carfi A，Wiley DC，Eisenberg RJ，Cohen GH；J virol 2002，Nov 1；76(21)10894-10904)。
然而，在文献Martinez WM，Spear PG，Amino acid substitutions in theV domain of nectin-1(HveC)that impair entry activity for herpes simplexvirus types 1 and 2 but not for Pseudorabies virus or bovine herpesvirus 1，JVirol.2002 Jul；76(14)7255-62中已经表明，可以显著地改变HveC蛋白与病毒糖蛋白gD结合的能力，但不能消除该蛋白触发细胞膜和病毒膜的融合以及因此所造成的PVR和BHV-1病毒以感染的形式侵入到细胞内的能力。
在文献Campadelli-Fiume G，Cocchi F，Menotti L，Lopez M.the novelreceptors that mediate the entry of herpes simplex viruses and animalalphaherpesviruses into cells Rev Med Virol.2000Sept-Oct；10(5)305-19中也已经表明，鼠所表达的HveC蛋白在PRV、BHV-1和HSV的侵入中可以起到介质的作用，且不依赖于与糖蛋白gD的可检测到的相互作用。
此外，在Geraghty RJ，Fridberg A，Krummenacher C，Cohen GH，Eisenberg RJ，Spear PG，use of chimeric nectin-1(HveC)-related receptors todemonstrate that ability to bind alphaherpesvirus gD is not necessarilysufficient for viral entry，Virology.2001 Jul 5；285(2)366-75的研究中已经全面推断出，HveC蛋白与糖蛋白gD的相互作用不足以容许病毒侵入到细胞内，以及HveC蛋白的作为HSV、PRV和BHV1病毒侵入到靶细胞内的介质性能的特性不能被简化为它与糖蛋白gD结合的能力。
而且应当注意到的是，HveC蛋白在哺乳动物物种之间具有非常保守的多肽序列，例如，猪所表达的HveC蛋白与牛所表达的HveC蛋白有着97％的共同氨基酸，这意味着在这两种物种之间的结构和功能的同一性。
根据文献INOBE MANABU等“Functional analysis of HVEM，amember of TNFR family，by using a transgenic mice expressing soluble formof HVEM”(Biosciences information Service，Philadelphia，PA-US-2001.03.07)，通过在鼠的基因组中引入编码由HVEM蛋白的细胞外结构域和免疫球蛋白IgG的可结晶部分Fc所构成的嵌合蛋白的转基因可以生成用于实验目的的经遗传学修饰的鼠株，以研究HVEM蛋白在免疫系统调节中的意义。
因此已经证实可溶形式的HveM(TNFα受体家族的一个成员)的表达产生了免疫抑制剂的作用。
从这个先前的认识中，本发明提出了一种用于生产一种通过种系转基因(germinal transgenesis)获得抗α-疱疹病毒感染的非人类哺乳动物的方法，其中HveC或柄蛋白-1多肽构成了α-疱疹病毒的功能性受体，该方法的特征在于通过插入或同源重组将在一种适当的表达体系中的容许表达由柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域或其一部分和免疫球蛋白特别是免疫球蛋白G的可结晶片段所构成的嵌合蛋白的转基因引入到细胞基因组内，这些细胞包括哺乳动物的种系(germinal line)或一种此类祖细胞(ancestor)。
因此本发明所依据的想法包括通过一种仍需确认的方法部分利用HveC蛋白与靶病毒侵入所相关的介导能力，且对细胞无害的方式(通过分离它的细胞内结构域或其一部分)使得最终抑制该病毒侵入到细胞内并有助于它的根除。
所表达的嵌合蛋白的作用机制具体地可以包括，归结于它与病毒颗粒以及细胞受体Fc的结合能力，这增加了巨噬细胞和树突状细胞的吞噬作用及对病毒体的破坏能力以及NK细胞毒淋巴细胞的活性。
作用机制也可以包括通过组合一个或多个嵌合蛋白的单元形成了功能修饰的多体形式的α-疱疹病毒的膜受体，使得病毒颗粒被结合于细胞表面但不能以感染的形式侵入到细胞浆内。
根据本发明，HveC或柄蛋白-1蛋白和/或免疫球蛋白优选地属于同源物种(homologous species)。
也可以只使用柄蛋白-1或HveC的一部分，或者如果需要甚至可以使用这些部分的突变形式，所选择的突变形式具有与靶病毒结合的能力。
因此，本发明方法的第一阶段对应为转基因的制备，利用本领域人员所熟知的以及被文献所大量描述的方法可以进行转基因的制备，这些文献包括克隆一方面，或来自从哺乳动物中取得的组织样本中所提取的RNA产物中的转录细胞受体基因的RNA的互补DNA，或来自也从哺乳动物中取得的组织样本中提取到的基因组DNA产物的包括该受体基因的染色体区域(所有外显子和内含子)，或一部分cDNA或相应的基因组片段(“小基因(mini-gene)”)的多肽链的剩余部分所组成的嵌合构建体。
在所有情况中，只使用对应于该受体的细胞外结构域的部分，或在本方法的另一个形式中，使用本结构域的亚部分(sub-part)，或如果需要甚至可使用主要来源于本细胞外结构域的多肽序列。
另一个方面，或来自从哺乳动物中取得的组织样本中提取的RNA产物中的转录所选定的免疫球蛋白(例如G1)类型或亚型的其中一个重链基因的RNA的互补cDNA，或来自也从哺乳动物中取得的组织样本中提取的基因组DNA产物中的包括该重链基因的染色体区域(所有外显子和内含子)，或由一部分cDNA或相应的基因组片段(“小基因”)的多肽链的剩余部分所组成的嵌合构建体。所构建的构建体将优选仅保留所选定的免疫球蛋白重链的铰链区、CH2和CH3区(可结晶部分)。
在文献CTLA-4 Is a Second Receptor for the B Cell Activation AntigenB7.By Peter S.Linsley，William Brady，Mark Urnes，Laura S.Grosmaire，Nitin K.Damle，and Jeffrey A.Ledbetter；J.Exp.Med.The RockefellerUniversity Press；volume 174，September 1991，561-569中描述了人免疫球蛋白G1的这样一种构建体的实例。
依据与所用基因相关的现有认识进行克隆操作，这些认识是它们的序列、它们的染色体定位，尽可能的是同源物种的，否则依据其它哺乳动物的本基因的已知序列。
通过聚合酶链反应(PCR)可以进行这些操作，在此之前是互补DNA的逆转录阶段，或在靶物种的基因组DNA文库内检测有可能与特异性探针杂交的克隆，或生成所研究的基因的特异的PCR扩增子。
将进行构建，使得加入柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域或其一部分的编码序列以及免疫球蛋白重链的可结晶片段的5’编码序列(由终止密码子所终止)，同时顺应于两个基因的原始可读框以及如果含有内含子-外显子结点还要顺应于结点的性质和有效性；使得最终保证表达由对应于细胞受体HveC的细胞外结构域或它的亚部分的一部分的多肽的氨基末端部分以及免疫球蛋白重链的铰链区、CH2和CH3区的羧基末端部分所组成的嵌合蛋白。
将该构建体置于一个表达载体中，使得可以在宿主的一个或多个生物学的区室内强表达嵌合蛋白，这将保护细胞并使得宿主获得对最初感染或感染发展的全面抗性。本发明将特别地包括使用组成型存在于所有细胞内或更特异地组成型存在于病毒感染的靶组织内的活性表达体系，这些靶组织是例如中枢神经系统的组织或表皮组织(特别是呼吸系统的表皮组织)。
表达载体将包括一个启动子区域、终止信号、转录的刺激元件、染色质的隔离序列、其它转录单元以及保证所需表达的所有元件。
本方法将包括优先使用由从同源物种或者对于动物生产的应用为在正常养殖的用于人类消费的其它动物中所克隆的调节序列组成的表达体系。
本发明方法的第二阶段包括也利用本领域人员所熟知的方法通过插入或同源重组将转基因引入并因此包含于包括靶宿主哺乳动物的种系的细胞的基因组中，使得该转基因被整合于该哺乳动物的遗传继承物中。
特别可以使用编码转基因的DNA片段的原核微注射(Pronuclearmicro injection)或通过所培养的转基因转化的细胞的核转移。
本发明也涉及一种利用表达由优选的同源物种的柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域或其一部分和免疫球蛋白(优选的为同源物种的免疫球蛋白G)的可结晶片段所构成的嵌合蛋白的作用，通过种系转基因获得抵抗α-疱疹病毒感染的非人类哺乳动物，其中多肽HveC或柄蛋白-1构成α-疱疹病毒的功能性受体。
本方面也涉及这样一种哺乳动物的具有世袭遗传的插入于它们的亲代的种系的基因组中的转基因的子代。
根据本发明，α-疱疹病毒可以优选的是PRV病毒且所述哺乳动物是猪。
根据本发明的不同部分，α-疱疹病毒也可以是BHV-1病毒且所述哺乳动物是牛。
根据本发明所必需的是转基因操作是使得哺乳动物的子代也能表达嵌合蛋白的种系转基因。
本发明也涉及一种主要来源于上述类型的转基因哺乳动物的遗传物质例如精液或卵细胞或胚胎。
附上了一些本发明的嵌合蛋白的序列的实例。
这里有一些在氨基末端包括有在成熟过程中将被处理的信号肽的氨基酸序列。
在另一申请框架内的文件JP-2001-328430中也描述了本模型的嵌合蛋白。
本发明方法的可行性已经被以下的结果所证实1.在体内分析表达嵌合蛋白Hvem-Ig的转基因鼠对1型人单纯疱疹病毒(HSV-1)的抗性的框架内所得到的实验结果。
根据这些测试，通过种系转基因将编码由鼠的该病毒的HVEM受体的细胞外结构域和人免疫球蛋白IgG-1的可结晶部分Fc所构成的嵌合蛋白的转基因引入到这些鼠的DNA内。
通过RT PCR从从来自原种鼠BALB/c的经伴刀豆凝集素A(concavaline A)刺激的雌鼠的细胞中所提取的RNA产物中克隆出鼠HveM细胞外结构域。
用于RT PCR反应的引物是5’-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3’和5’-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3’。
将cDNA插入到具有人免疫球蛋白G1的可结晶片段序列的质粒的Xhol和BamH1限制性位点上(如文献Nakagawa I.，Murakami，M.，Ijima，K.，Chikuma，S.，Saito，I.，Kanegae，Y.，Ishikura，H.，Yoshiki，T.，Okamoto，H.，Kitabatake，A.，and Uede，T.(1998).Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containingCTLA41gG.Human Gene Therapy 9，1739-1745所描述的那样)。
从该构建体中分离出含有编码嵌合蛋白HveMIg的DNA的XhoI/XbaI片段，在平钝末端后，依次插入到在己知的容许在任何一种细胞内高度组成型表达的CAG启动子(β肌动蛋白启动子)的控制下的粘粒载体pAxCAwt(从日本京都的TAKARA公司商业化获得)的SwaI限制性位点上(Niwa，H.，Yamamura，K.，and Miyazaki，J.(1991).Efficientselection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene 108，193-200)。
然后通过将含有转录病毒基因CMV IE的刺激因子、鸡β肌动蛋白基因的启动子、蛋白HVEMIg的序列以及兔β球蛋白位点的3’聚腺苷酸化信号的载体的Pmel/Sall片段微注射到鼠的受精胚胎原核(基因型F1C57BL/6X SJL)中，生成表达该嵌合蛋白HVEM Ig的3株转基因鼠A、B、C，每株转基因鼠都来自独立的建立者。
利用免疫电泳在3株转基因鼠的血清中都检测到如抗HVEMIg抗体(通过兔的超免疫法所生成的抗体)所显示的特殊条带那样的HVEMIg蛋白的存在，B株鼠具有更低的平均含量。
在
图1中图解显示了所构建的构建体。
在附录的表1、2、3和4中显示了3株转基因鼠ABC血清中的嵌合蛋白HVEMIg的浓度。
3株转基因鼠都能正常发育，在这些鼠的重量和那些来自同一窝的它们的非转基因的同系物的重量之间没有发现差别。
为了验证表达嵌合蛋白HVEMIg的转基因鼠能否有效地对抗HSV-1病毒，用对应于致死剂量10倍剂量(10LD50)的109cfu病毒静脉内接种来自同一窝的转基因鼠和非转基因的对照鼠。
最初在较低敏感性的两株用于生成杂交转基因动物的鼠中测定出LD50。
根据图2、3和4，分别为A、B和C株的转基因Tg鼠和非转基因的Tg鼠仍能存活到在感染后第14天的计数。
也能注意到所有的转基因鼠株都能抵抗HSV-1病毒。
更具体的，在试验结束后，被病毒接种的A和C株的所有转基因鼠都能存活并保持良好健康数个月(表1和4)。
在接种病毒后，只有1只B株转基因鼠死亡，而其它6只鼠均存活(表3)，而B株是所测试的血清HVEMIg含量最低的一种转基因鼠株。
在另一方面，在用HSV-1病毒接种14天后，7只与A株转基因鼠来自同一窝鼠的非转基因鼠中的6只、14只与B株转基因鼠来自同一窝鼠的非转基因鼠中的13只以及7只与C株转基因鼠来自同一窝鼠的非转基因鼠中的6只都出现例如麻痹的症状或死亡。
用文献中所描述的方法研究了HSV-1病毒的LAT在接种后存活鼠的三叉神经节内的表达。
-Spivak，J.G.，and Fraser，N.W.(1987).Detection of herpes virus type1 transcripts during latent infections in mice.J.Virol.，61，3841-3847.
-Stevens，J.G.，and Cook，M.L.(1971).Latent herpes simplex virus inspinal ganglia of mice.Science 173，843-845。
因此用RT-PCR方法检测LAT的表达。
在出现症状的非转基因鼠中以及在没有出现症状的单只B株转基因鼠中都观察到了这一点，但是另一方面，在其它任何一只所测试的转基因鼠或所存活的没有出现症状的非转基因鼠中都没有观察到这一点。
在本研究的框架内，为了验证当HVEM蛋白不是PRV病毒的功能性受体时表达嵌合蛋白HVEMIg的转基因鼠能否对抗PRV病毒，也进行了一项对照试验。
为了这个目的，用致死剂量10倍剂量(10LD50)的PRV病毒静脉内接种来自同一窝的A株转基因鼠和非转基因鼠(表2和图5)。
也能注意到，在用PRV病毒接种后，除转基因鼠存活了10天外，所有的鼠都在5天内死亡。
随后，没有证明表达嵌合蛋白HVEMIg的转基因鼠能抗PRV病毒。
在本研究的框架内，也要验证是否体内可以观察到的转基因鼠对HSV-1病毒接种的抗性平行地伴随有所分离的这些鼠的细胞对HSV-1病毒的抗性。
因此用HSV-1病毒接种转基因鼠或非转基因鼠的胚胎成纤维细胞的培养物。
然后在接种5天后计数病毒对细胞培养物所造成的裂解范围，并且注意到这些非转基因鼠的成纤维细胞的裂解范围的数目明显地要比转基因鼠的成纤维细胞的裂解范围更大(非转基因鼠是平均每个培养盘22个斑，而转基因鼠是平均每个培养盘1个斑)。
通过用PRV病毒接种转基因鼠或非转基因鼠的胚胎成纤维细胞的培养物平行地进行对PRV病毒的相似测试，没有注意到任何在转基因鼠和在非转基因鼠所观察到的裂解范围的数目之间的显著差异。
这些结果可以证实转基因鼠的成纤维细胞所表达的嵌合蛋白HVEMIg参与了对胚胎成纤维细胞吸附HSV-1病毒的抑制。
在互补测试中，表5中显示了这个测试的结果，研究了转基因鼠的血清中所存在的嵌合蛋白HVEMIg是否能抑制HSV-1或PRV病毒对细胞培养物的感染。
因此从C株转基因鼠收集血清，在将病毒与Vero细胞培养物接触前，先用该血清孵育HSV-1或PRV病毒。
因此可以确定C株转基因鼠的血清可以使得Vero细胞避免HSV-1病毒的污染但不能避免PRV病毒的污染。
相反地，用非转基因鼠的血清所进行的对照测试没有注意到任何的抗病毒活性。
此外还注意到，将C株转基因鼠的血清与兔的高度免疫所产生的多克隆抗HVEMIg血清在室温下接触30分钟后，C株转基因鼠的血清没有再表现出任何的抗病毒活性。
后一个结果证实转基因鼠的血清的血清中和活性可以归功于嵌合蛋白的表达。
所有的这些结果证明所注意到的抗病毒活性来自转基因鼠的血清中所存在的嵌合蛋白HVEMIg，但无疑也与该嵌合蛋白在正如在这些测试中所评价的胚胎成纤维细胞的宿主细胞表面上的表达有关。
除所描述的关于HveM蛋白的免疫抑制的性能外，这些结果还证实了体内表达的α-疱疹病毒的膜受体的修饰形式的抗病毒作用。
2.在体内分析表达嵌合HveC蛋白-Ig的转基因鼠对PRV病毒的抗性的框架内所得到的试验结果。
根据这些测试，通过种系转基因将编码由鼠的PRV病毒的HveC受体的细胞外结构域和人免疫球蛋白IgG-1的可结晶部分Fc所构成的嵌合蛋白的转基因引入到这些鼠的DNA内。
用RT PCR从从猪细胞中提取的RNA产物中克隆出猪HveC的细胞外结构域。
用于RT PCR反应的引物是如所述的
5’-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3’和5’-TIAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3’，并按在文献(Milne，R.S.B.，Connolly，S.A.，Krummenacher，C.，Eisenberg，R.J.，andCohen，G.H.(2001)Porcine HveC，a member of the highly conservedHveC/nectin 1 family，is a functional alphaherpesvirus receptor.Virology 281，315-32)中所提出的条件进行反应。
将cDNA插入到具有人免疫球蛋白G1的可结晶片段序列的质粒的Xhol和BamH1限制性位点上(如文献Nakagawa I.，Murakami，M.，Ijima，K.，Chikuma，S.，Saito，I.，Kanegae，Y.，Ishikura，H.，Yoshiki，T.，Okamoto，H.，Kitabatake，A.，and Uede，T.(1998).Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containingCTLA41gG.Human Gene Therapy 9，1739-1745所描述的一样)。分离出该质粒的含有编码HveC-Ig融合蛋白的DNA的XbaI/XbaI片段，将其平钝末端并结合到SalI结合体上，在用Xhol和Sall消化后，将其依次插入到在已知的容许在任何一种细胞内高度组成型表达的CAG启动子(β肌动蛋白启动子)的控制下的载体pCXN2(从日本京都的TAKARA公司商业化获得)的ShoI限制性位点上(Niwa，H.，Yamamura，K.，and Miyazaki，J.(1991).Efficient selection for high-expression transfectants with a noveleukaryotic vector.Gene 108，193-200)。将所获得的重组质粒称为Pcxn2/pHvecIg。
然后通过将含有转录病毒基因CMV IE的刺激因子、鸡β肌动蛋白基因的启动子、蛋白HVEMIg的序列以及兔β球蛋白位点的3’聚腺苷酸化信号的载体的SalI/SalI片段微注射到鼠的受精胚胎原核(C57/BL6株)中，生成表达该嵌合蛋白HveC-Ig的6株转基因鼠#6、#22、#32、#33、#37和#45，每株转基因鼠都来自独立的建立者。
图6图解显示了所构建的构建体。
3株转基因鼠都能正常发育，在这些转基因鼠的重量和来自同一窝的非转基因鼠的重量之间没有注意到差别。
经腹腔内注射的病毒试验为了验证表达嵌合HveC蛋白-Ig的转基因鼠能否被有效地抗PRV病毒，在第一个试验系列中，用相当于致死剂量20倍(20LD50)剂量的500p.f.u.病毒腹腔内接种来自同一窝的转基因鼠和非转基因鼠。
根据表6，分别来自#6、#22、#32、#33、#37和#45株转基因的Tg鼠和非转基因的Tg鼠仍能活到了感染被计数后的第14天。
因此在这个有名的严格试验中可以注意到6株转基因鼠都能抵抗PRV病毒，除#33株的单只动物外，转基因动物100％存活。
另一个方面，只有约9％非转基因鼠存活，根据对每个株所进行的试验而有所不同。
在独立的实验室用不同的PRV病毒株验证了对#22和#32株的这些试验。
经鼻内感染的病毒试验在试验的第二个系列中，用相当于致死剂量10倍剂量的250p.f.u.病毒经鼻内接种来自同一窝的转基因鼠和非转基因的对照鼠。
根据表7，分别来自#6、#22、#32、#33和#37株转基因的Tg鼠和非转基因的Tg鼠仍能活到了感染被计数后的第14天。
在这个有名的严格试验中，因此注意到5株转基因鼠都是相对抵抗PRV病毒，约70％的转基因动物存活。
另一方面，只有约10％的非转基因鼠存活，根据对每个株所进行的试验而有所不同。
这些结果证实了容许表达嵌合蛋白HveC-Ig的转基因在鼠的经鼻内给药的严格试验中的有效的保护活性。
总而言之，所有的这些结果都说明本发明方法对哺乳动物保护作用的体内有效性是依据于对α-疱疹病毒侵入靶细胞内的抑制作用。这个有效性仅是可能的，因为所提出的方法可能有一些作用水平，而作用的机制还没有被完全阐明除已知的HveM和HveC受体与病毒蛋白gD结合的能力外，单独使用细胞外结构域的用法可以将它的受体能力从这些跨膜蛋白在侵入上的复杂生物学功能以及特别是它们启动细胞内信号级联的能力中分离出来。
这可以预见到该蛋白结构域的超表达而不放大它的生理功能，而且无疑可以缺乏在表达嵌合蛋白的转基因动物中所观察到的继发作用。
在体内感染的过程中有可能的是溶液中的嵌合蛋白或存在于细胞表面的嵌合蛋白与病毒的功能性膜受体竞争性固定所感染的病毒颗粒；通过调理作用中和病毒颗粒并增加巨噬细胞和树突状细胞的吞噬作用；通过刺激NK淋巴细胞激活细胞免疫。
本方法在经鼻给药的试验性感染中的有效性与转基因动物的胚胎成纤维细胞的抗性都共同(对HveMIg)指向为通过所表达的嵌合蛋白的膜片段对病毒侵入敏感的靶细胞的有效抑制，并超过了血清中所分泌的可溶性片段的血清中和能力。
根据优先的方法，这种对病毒侵入细胞的抑制作用是经修饰的病毒的膜受体的结果，使得病毒可以固定于靶细胞的表面但不能以感染的形式侵入到细胞浆内。
本方法在病毒侵入上的有效性以及与感染后病毒潜伏期相关的第一个结果(对HveM和HSV1)还可以容许所饲养的动物缺乏潜伏期而因此被保护，而这对于接种策略却不是必然的结果，因此这是对任何病毒复发的更为有效的控制。
3.在体外分析被表达由猪HveC蛋白的细胞外结构域和人免疫球蛋白Ig的可结晶片段所构建的嵌合蛋白的质粒所转化的细胞株对BHV-1和PRV病毒的抗性的框架内所得到的试验结果。
根据这个测试，制备被表达抑制BHV-1和PRV病毒侵入的猪HveC蛋白的可溶形式的质粒所转化的Vero细胞株，然后分析这些细胞株对这些病毒感染的抗性以测定猪HveC蛋白的可溶形式在体外的抗病毒性能。
为了构建表达猪HveC蛋白可溶形式的质粒(PHveCIg)，使用了表达载体PCXN2，该载体容许转录猪HveC蛋白的细胞外结构域和人免疫球蛋白IgG1的可结晶片段Fc在一起的编码信使RNA。
用RT PCR从从猪细胞中提取到的RNA产物中克隆到猪HveC的细胞外结构域。
RTPCR反应中所用的引物为5’-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3’和5’-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3’，如在文献中所描述的并根据文献中所提出的条件进行反应(Milne，R.S.B.，Connolly，S.A.，Krummenacher，C.，Eisenberg，R.J.，and Cohen，G.H.(2001).PorcineHveC，a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family，is afunctional alphaherpesvirus receptor.Virology 281，315-32)。
将cDNA插入到具有人免疫球蛋白G1的可结晶片段序列的质粒的Xhol和BamH1限制性位点(如在文献Nakagawa I.，Murakami，M.，Ijima，K.，Chikuma，S.，Saito，I.，Kanegae，Y.，Ishikura，H.，Yoshiki，T.，Okamoto，H.，Kitabatake，A.，and Uede，T.(1998).Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containingCTLA41gG.Human Gene Therapy 9，1739-1745中所描述的)。分离出该质粒的含有编码HveC-Ig融合蛋白的DNA的XbaI/XbaI片段，将其平钝末端并结合到SalI结合体上，以将其依次插入到在已知的容许在任何一种细胞内高度组成型表达的CAG启动子(β肌动蛋白启动子)的控制下的载体pCXN2(从日本京都的TAKARA公司商业化获得)的XhoI限制性位点上(Niwa，H.，Yamamura，K.，and Miyazaki，J.(1991).Efficient selectionfor high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene 108，193-200)。所得到的重组质粒被称为Pcxn2/pHvecIg。
通过用所得到的质粒的转染制备出被稳定转化的细胞株。
在容许嵌合蛋白蓄积于培养基中的条件下培养所转化的细胞株，即在次融合扩展后再继续培养24个小时。
然后用每35mm直径盒50p.f.u.量的PRV或BHV-1病毒接种这些培养物，一起孵育1个小时，之后在用DMEM 0.5％琼脂培养基覆盖之前，用DMEM冲洗两次后。
然后计数接种4天后病毒所造成的细胞培养物的裂解范围。接种4天后注意到，与对照的抗性细胞株和Vero细胞株比较，表达嵌合蛋白PHveCIg的细胞株的裂解斑的数目显著地减少。
表8显示了所得到的结果。
质粒PCXN2/pHveC Ig所转化的细胞株显然能抵抗PRV和BHV-1病毒的攻击。
4.在体外分析被表达由猪HveC蛋白的细胞外结构域和猪免疫球蛋白g1的可结晶片段所构建的嵌合蛋白的质粒所转化的细胞株对BHV-1和PRV病毒的抗性的框架内所得到的试验结果。
根据这个测试，制备被表达抑制BHV-1和PRV病毒侵入的猪HveC蛋白的可溶形式的质粒所转化的Vero细胞株，然后分析这些细胞株对这些病毒感染的抗性，以测定猪HveC蛋白的可溶形式在体外的抗病毒性能。
为了构建表达猪HveC蛋白可溶形式的质粒(PHveCIg)，使用了表达载体pCXN2，该载体容许转录猪HveC蛋白的细胞外结构域和猪免疫球蛋白IgG1的可结晶片段Fc在一起的编码信使RNA。
用RT PCR从从猪细胞中提取到的RNA产物中克隆到猪HveC的细胞外结构域。
RT PCR反应中所用的引物为5’-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3’和5’-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3’，如在文献中所描述的并根据文献中所提出的条件进行反应(Milne，R.S.B.，Connolly，S.A.，Krummenacher，C.，Eisenberg，R.J.，and Cohen，G.H.(2001).PorcineHveC，a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family，is afunctional alphaherpesvirus receptor.Virology 281，315-32)。
将所得到的cDNA连接到猪免疫球蛋白Ig的可结晶Fc片段的cDNA编码片段的5’末端，并顺应于这两种多肽的原始可读框。
用RT PCR从从Large White型(FHO 25)株的猪淋巴组织中提取出的RNA产物中克隆到猪免疫球蛋白的cDNA片段，引物为TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3’和5’-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3’，依据文献Simon Musyoka Mwangi，Thomas J.Stabel*，Marcus E.Kehrli Jr，development of a baculovirus expression system for soluble porcine tumornecrosis factor receptor type I and soluble porcine tumor necrosis factorreceptor type I-IgG fusion protein，Veterinary Immunology andImmunopathology 86(2002)251-254所提出的条件进行反应。
融合得到的cDNA编码嵌合蛋白，附录了它的氨基酸序列(序列4)。
将融合得到的cDNA插入到在鸡β肌动蛋白基因的启动子以及转录病毒基因CMV IE的刺激因子和兔β球蛋白的聚腺苷酸化序列控制下的质粒pCXN2的XhoI限制性位点上。
所得到的质粒被称为PCXN2/pVCC-pFc。
只用HveC蛋白的V结构域和猪免疫球蛋白IgG的可结晶片段Fc构建出该质粒的被称为PCXN2/pV-pFc的限制性形式。
附录了所得到的嵌合蛋白的氨基酸序列(序列3)。
通过所得到的质粒的转染制备出稳定转化的细胞株。
在容许嵌合蛋白蓄积于培养基中的条件下培养所转化的细胞株，即在次融合扩展后继续培养24个小时。
然后用每35mm直径盒50p.f.u.量的PRV或BHV-1病毒接种这些培养物，一起孵育1个小时，之后在用DMEM 0.5％琼脂培养基覆盖之前，用DMEM冲洗两次。
然后计数在接种3天后病毒所造成的细胞培养物的裂解范围，并将结果显示于表9中。
表达本发明的嵌合蛋白的两种形式的转基因所转化的细胞株显然能抵抗BHV-1和PRV病毒的攻击。
表1.A株转基因鼠对HSV-1病毒接种的抗性
表2.A株转基因鼠对PRV病毒接种的敏感性
表3.B株转基因鼠对HSV-1病毒接种的抗性
表4.C株转基因鼠对HSV-1病毒接种的抗性
在表1到4中，用*标记的动物是转基因动物，同时用L标记的动物是来自同一窝的非转基因的对照动物。
表5.C株转基因鼠的血清中的嵌合蛋白HVEMIg对HSV-1病毒的中和作用。
用HSV-1病毒接种与不同浓度的该血清孵育后的VERO细胞
表6.经腹腔内给药的试验(20LD 50)
表7.经鼻内给药的试验(10 LD 50)
表8.转化细胞株对PRV和BHV-1α-疱疹病毒的抗性。
在这个表中，A6和C1株是被质粒pCXN2/pHveCIg所转化的细胞株并表达嵌合蛋白PHveCIg，同时C2株对应于不表达转基因的该转化株的阴性对照，以及Vero株对应于对病毒敏感的原始细胞并用于生产被不同的转基因所转化的细胞株。
表9.所转化的细胞株对PRV和BHV-1α-疱疹病毒的抗性
*在这个表中，3-16株是被质粒p CXN2/pVCC-pFc转化的细胞株，以及V110株是被质粒p CXN2/pV-pFc转化的细胞株，同时Vero株对应于对病毒敏感的原始细胞并用于生产被不同的转基因所转化的细胞株。
序列表<110>法国海布雷德斯公司<120>生产抗α-疱疹病毒介导的感染的哺乳动物的方法和用该方法得到的哺乳动物及其子代<130>hvec<150>Fr02 12775<151>2002-10-15<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>440<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>Artificial protein fusing the extracellular domain of the proteinHveM of the mouse and the crystallisable fragment of the humanimmunoglobulin G1<400>1Met Glu Pro Leu Pro Gly Trp Gly Ser Ala Pro Trp Ser Gln Ala Pro1 5 10 15Thr Asp Asn Thr Phe Arg Leu Val Pro Cys Val Phe Leu Leu Asn Leu20 25 30Leu Gln Arg Ile Ser Ala Gln Pro Ser Cys Arg Gln Glu Glu Phe Leu35 40 45Val Gly Asp Glu Cys Cys Pro Met Cys Asn Pro Gly Try His Val Lys50 55 60Gln Val Cys Ser Glu His Thr Gly Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80Gln Thr Tyr Thr Ala His Ala Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Pro Cys85 90 95Gly Val Cys Asp Pro Asp Met Gly Leu Leu Thr Trp Gln Glu Cys Ser100 105 110Ser Trp Lys Asp Thr Val Cys Arg Cys Ile Pro Gly Tyr Phe Cys Glu115 120 125Asn Gln Asp Gly Ser His Cys Ser Thr Cys Leu Gln His Thr Thr Cys130 135 140Pro Pro Gly Gln Arg Val Glu Lys Arg Gly Thr His Asp Gln Asp Thr145 150 155 160Val Cys Ala Asp Cys Leu Thr Gly Thr Phe Ser Leu Gly Gly Thr Gln165 170 175Glu Glu Cys Leu Pro Trp Thr Asn Cys Ser Ala Phe Gln Gln Glu Val180 185 190Arg Arg Gly Thr Asn Ser Thr Asp Thr Thr Cys Ser Ser Asp Pro Glu195 200 205Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys pro Pro Cys Pro Ala210 215 220Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro225 230 235 240Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val245 250 255Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val260 265 270Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln275 280 285
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<223>Artificial protein fusing the extracellular domain(domains V-C-C)of the protein HveC of the pig and the crystallisable fragment ofthe human immunoglobulin G1<400>2
Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu1 5 10 15Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Ala His Thr Gln Val20 25 30Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val35 40 45Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Gly Val Lys Ile Thr Gln50 55 60Val Thr Trp Gln Lys Ala Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile65 70 75 80Tyr Asn Pro Ala Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg85 90 95Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser100 105 110Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr115 120 125Phe Pro Ala Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala130 135 140Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn165 170 175Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr His Leu Lys Gly Glu180 185 190Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile195 200 205Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Asp His Arg Gln Ser Leu
210 215 220Ala Cys Ile Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Arg Glu Ser Leu Thr225 230 235 240Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly245 250 255Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp260 265 270Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser275 280 285Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Arg Gly290 295 300Pro Ile Asn Tyr Ser Met Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn305 310 315 320Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe325 330 335Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Ala Asp Pro Glu Glu Pro Lys340 345 350Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu355 360 365Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr370 375 380Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val385 390 395 400Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val405 410 415Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser420 425 430
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu435 440 445Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala450 455 460Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro465 470 475 480Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln485 490 495Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala500 505 510Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr515 520 525Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu530 535 540Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser545 550 555 560Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser565 570 575Leu Ser Pro Gly Lys580<210>3<211>376<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>Artificial protein fusing the V domain of the protein HveC of thepig and the crystallisable fragment of the porcine immunoglobulinG1
<400>3Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu1 5 10 15Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Ala His Thr Gln Val20 25 30Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val35 40 45Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Gly Val Lys Ile Thr Gln50 55 60Val Thr Trp Gln Lys Ala Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile65 70 75 80Tyr Asn Pro Ala Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg85 90 95Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser100 105 110Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr115 120 125Phe Pro Ala Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Gly130 135 140Ser Val Gly Ile His Gln Pro Gln Thr Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys145 150 155 160Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp165 170 175Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp180 185 190Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly195 200 205
Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn210 215 220Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp225 230 235 240Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro245 250 255Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu260 265 270Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser275 280 285Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile290 295 300His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr305 310 315 320Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr325 330 335Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe340 345 350Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys355 360 365Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys370 375<2l0>4<211>578<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>Artificial protein fusing the extracellular domain (domains V-C-C)of the protein HveC of the pig and the crystallisable fragment ofthe porcine immunoglobulin G1<400>4Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu1 5 10 15Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Ala His Thr Gln Val20 25 30Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val35 40 45Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Gly Val Lys Ile Thr Gln50 55 60Val Thr Trp Gln Lys Ala Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile65 70 75 80Tyr Asn Pro Ala Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg85 90 95Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser100 105 110Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr115 120 125Phe Pro Ala Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala130 135 140Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn165 170 175Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr His Leu Lys Gly Glu180 185 190
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Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val420 425 430Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe435 440 445Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Thr450 455 460Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu465 470 475 480Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr Leu Thr Cys485 490 495Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val Glu Trp Lys Ser500 505 510Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln515 520 525Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp530 535 540Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe Glu Cys Ala Val Met His545 550 555 560Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln565 570 575Gly Lys
权利要求
1.用于生产通过种系转基因而获得对α-疱疹病毒感染的抗性的非人类哺乳动物的方法，其中多肽HveC或柄蛋白-1构成α-疱疹病毒的功能性受体，所述方法的特征在于通过插入或同源重组将一种在适当的表达体系中的容许表达一种嵌合蛋白的转基因引入构成所述哺乳动物的种系的细胞的基因组中，所述嵌合蛋白由柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域或其一部分和免疫球蛋白的可结晶片段组成。
2.权利要求1的方法，其特征在于免疫球蛋白是免疫球蛋白G。
3.权利要求1和2中任一项的方法，其特征在于柄蛋白-1或HveC和/或免疫球蛋白属于同源物种。
4.非人类哺乳动物，其特征在于其利用表达由优选为同源物种的柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域和优选为同源物种的免疫球蛋白的可结晶片段特别是免疫球蛋白G的可结晶片段组成的嵌合蛋白的作用，通过种系转基因而获得对α-疱疹病毒感染的抗性，其中多肽HveC或柄蛋白-1构成α-疱疹病毒的功能性受体。
5.权利要求4的哺乳动物，其特征在于α-疱疹病毒的特异性受体是柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域的亚部分。
6.权利要求4和5中任一项的哺乳动物，其特征在于其属于猪物种且所述α-疱疹病毒是PRV病毒。
7.权利要求4和5中任一项的哺乳动物，其特征在于其属于牛物种且所述α-疱疹病毒是BHV-1病毒。
8.权利要求4到7中任一项的哺乳动物，其特征在于其细胞的基因组中含有在适当的表达体系中的编码一种嵌合蛋白的转基因，所述嵌合蛋白由柄蛋白-1或HveC的细胞外结构域或其一部分和免疫球蛋白的可结晶片段组成，该转基因已经被插入到其亲代之一的种系的基因组中。
9.遗传物质例如精液或卵细胞或胚胎，基本上来源于权利要求4到8中任一项的哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及用于生产通过种系转基因而对α－疱疹病毒介导的感染产生抗性的非人类哺乳动物的方法，其中多肽HveC或柄蛋白－1构成α－疱疹病毒的功能性受体。所述方法在于通过插入或同源重组将一种在适当的表达体系中的可表达一种嵌合蛋白的转基因引入构成所述哺乳动物的种系的细胞的基因组中，所述嵌合蛋白由柄蛋白－1或HveC的细胞外结构域或其一部分和免疫球蛋白的可结晶片段组成。
文档编号A01K67/027GK1705436SQ200380101494
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月14日 优先权日2002年10月15日
发明者悦郎小野, 利光上出 申请人:法国海布雷德斯公司