专利名称：真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法
技术领域：
本发明属海洋生物技术领域，具体讲把真鲷胚胎通过颗粒冷冻、液氮保存及解冻洗脱，获取复活胚胎的过程。
背景技术：
鱼类胚胎冷冻保存研究约有20年历史。国内外学者对鱼类胚胎冷冻保存的损伤机理、冷冻降温速率、解冻复温、抗冻剂种类和毒性等方面进行了大量研究，并取得很大进展。目前鲤科鱼类胚胎在-100℃以上温度的冷冻保存已获得较稳定的复活率(张克俭等。三种淡水鱼类胚胎低温保存及其降温和复温速率的研究。水产学报1997，21(4)366-372)，鲑鳟鱼类胚胎亦突破-25℃的界限(Erdahl，D.A.，Preservation of spermatozoa and ova from freshwater fish.Thesis of the Universityof Minnesota 1986)。鲤鱼(Zhang，X.S.，et al.A study on the cryopreservation of commoncarp embryos.Cryo Letters，1989，10271-278)、泥鳅(张克俭等，同上)在液氮区获得了个别冷冻复活胚胎，尽管以上实验还难以重复，但可以说是目前比较好的结果。由于鱼类胚胎尤其是海水鱼类胚胎体积大、含有大量的卵黄和水分等特点，给胚胎冷冻保存造成很大困难。颗粒玻璃化方法是基于仪器换热面积越大、界面的导热系数越高，降温速度就越快的原理而设计的玻璃化方法，以其胚胎独立冷冻、降温速度快、操作方便快捷、设备要求简单等特点而表现了良好的应用前景。真鲷的胚胎冷冻保存对真鲷这种海水名贵鱼类的种质保存、遗传多样性保护和育种及其养殖业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，选择真鲷心跳期至出膜前期胚胎，不同浓度的抗冻剂中两步平衡预冷，用玻璃吸管直接将胚胎滴加在置于液氮面上的铜箔片上，快速冷冻形成玻璃化颗粒，然后直接浸入液氮中冷冻，解冻时直接将冷冻颗粒投入到37℃的0.6M的蔗糖溶液中进行，经洗脱后转入海水中培育，获取复活胚胎。
选择真鲷心跳期胚胎时，真鲷胚胎心跳次数60-140次/分钟。
使用抗冻剂时，抗冻剂为甘油，以平衡盐溶液Cortland为基液，两步平衡的甘油浓度分别为第一步20％体积浓度和第二步40％体积浓度。
真鲷胚胎在冰箱中预冷时，预冷分两步进行，温度为0～4℃，预冷分别为第一步14～16min、第二步25～35s。
冷冻的过程中，使用了厚度为12微米的铜箔片作为冷冻介质。
冷冻的过程中，胚胎直接滴加在低温铜箔片上，形成玻璃化颗粒，颗粒体积0.005-0.01cm3。
冷冻保存的过程中，将胚胎单独冷冻，以玻璃化颗粒的形式保存于液氮中。
解冻时，解冻与去除抗冻液同步进行，解冻溶液为0.6mol/L蔗糖溶液。
水浴解冻时，解冻温度37℃，解冻溶液为0.6mol/L蔗糖溶液，至颗粒融化。
洗脱时，在0.6mol/L蔗糖中浸泡4～6分钟。
本发明的优点在于(1)真鲷心跳期至出膜前期胚胎与其它时期阶段的胚胎相比，对低温、抗冻剂毒性的耐受力最强；(2)甘油玻璃化形成能力强，对胚胎颗粒冷冻中的抗冻保护作用好。
(3)分两步平衡降低了抗冻剂对胚胎的毒性，同时可以满足玻璃化过程高浓度的要求。
(4)铜箔片的导热性能好，可以大大提高冷却速度；(5)颗粒滴加，体积小，散热面积大，没有冷冻容器的阻隔，有利于快速冷冻；(6)洗脱与解冻同步，二次洗脱避免了抗冻剂对解冻胚胎的毒害作用；本发明对真鲷心跳期胚胎，通过添加抗冻剂，采用快速颗粒玻璃化冷冻、液氮保存、解冻、洗脱等步骤，获得复活胚胎。真鲷胚胎冷冻保存对于真鲷的种质保存、遗传多样性和育种及可持续养殖等方面有着重要意义。
具体实施例方式
本发明的保护范围不仅局限于下列实施例中。
(1)捞取同批自然产真鲷受精卵，放置海水温度18±1℃、微充气的孵化桶内培育，至心跳期胚胎，心跳次数60次/分钟以上(60-140次/分钟)；(2)装入保温箱一定量液氮，液面高约10cm，将铜箔片(厚12微米)平放在液氮面上并固定。
(3)用80目筛绢网捞取胚胎，用滤纸轻蘸吸去表面海水，放入甘油体积浓度20％抗冻剂中，平衡盐溶液Cortland作为基液(即余量，pH＝8.28)，浸泡15min，然后转入甘油体积浓度40％抗冻剂中，平衡盐溶液Cortland作为基液(即余量，pH＝8.28)，30s后快速进行冷冻。浸泡过程在0～4℃冰箱中进行。
(4)用直径约1mm的玻璃吸管吸取一粒浸泡过的胚胎，快速滴加在铜箔片上，会立即形成体积约0.005-0.01cm3的透明玻璃化颗粒。
(5)反复多次进行以上颗粒冷冻，将冷冻颗粒导入置于液氮中的铜箔片槽中；(6)解冻时将铜箔片槽中的颗粒倒入到温度为37℃的0.6M的蔗糖溶液中，颗粒很快融化，而后将胚胎用筛网过滤出来，再放入0.6M的蔗糖溶液中室温洗脱5min后转入海水中，观察胚胎形态及存活情况。
(7)在48粒颗粒冷冻的胚胎中，复活胚胎为16粒，复活率为33.3％，11粒孵化出膜发育至仔鱼，孵化率68.8％。
另外，经试验，真鲷胚胎在冰箱中预冷时，温度为0～4℃，二步预冷时间可以分别为第一步14～16分钟、第二步25～35秒；洗脱时，在0.6mol/L蔗糖中浸泡4～6分钟，亦可达到本发明目的，由于其实施较为简单，故不再赘述。
权利要求
1.一种真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于选择真鲷心跳期至出膜前期胚胎，不同浓度的抗冻剂中两步平衡预冷，用玻璃吸管直接将胚胎滴加在置于液氮面上的铜箔片上，快速冷冻形成玻璃化颗粒，然后直接浸入液氮中冷冻，解冻时直接将冷冻颗粒投入到37℃的0.6M的蔗糖溶液中进行，经洗脱后转入海水中培育，获取复活胚胎。
2.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于选择真鲷心跳期胚胎时，真鲷胚胎心跳次数60-140次/分钟。
3.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于使用抗冻剂时，抗冻剂为甘油，以平衡盐溶液Cortland为基液，两步平衡的甘油浓度分别为第一步20％体积浓度和第二步40％体积浓度。
4.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于真鲷胚胎在冰箱中预冷时，预冷分两步进行，温度为0～4℃，预冷分别为第一步14～16min、第二步25～35s。
5.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，冷冻的过程中，其特征在于使用了厚度为12微米的铜箔片作为冷冻介质。
6.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于冷冻的过程中，胚胎直接滴加在低温铜箔片上，形成玻璃化颗粒，颗粒体积0.005-0.01cm3。
7.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于冷冻保存的过程中，将胚胎单独冷冻，以玻璃化颗粒的形式保存于液氮中。
8.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于解冻时，解冻与去除抗冻液同步进行，解冻溶液为0.6mol/L蔗糖溶液。
9.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于水浴解冻时，解冻温度37℃，解冻溶液为0.6mol/L蔗糖溶液，至颗粒融化。
10.根据权利要求1所述真鲷胚胎颗粒玻璃化冷冻保存方法，其特征在于洗脱时，在0.6mol/L蔗糖中浸泡4～6分钟。
全文摘要
本发明属海洋生物技术领域，具体讲把真鲷胚胎通过颗粒冷冻、液氮保存及解冻洗脱，获取复活胚胎的过程。本发明对真鲷心跳期胚胎，通过添加抗冻剂，采用快速颗粒玻璃化冷冻、液氮保存、解冻、洗脱等步骤，获得复活胚胎。真鲷胚胎冷冻保存对于真鲷的种质保存、遗传多样性和育种及可持续养殖等方面有着重要意义。
文档编号A01K67/033GK1748494SQ20041005041
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者丁福红, 李军, 肖志忠 申请人:中国科学院海洋研究所