专利名称：一种莲藕组培脱毒苗的驯化方法
技术领域：
本发明一种莲藕组培脱毒苗的驯化方法。属于蔬菜种苗生产技术领域，专用于莲藕组培苗的简易高效驯化，有利于莲藕组培(脱毒)苗的产业化应用。
二、技术背景莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn)是我国南方地区的传统特色水生蔬菜，具有很好的营养保健功能，也是我国主要的出口创汇蔬菜。因长期采用无性繁殖而使病毒积累，目前各产区均严重发生因此而致的“僵藕”问题，造成种性严重退化，根状茎(藕)变小，僵硬，品质变劣，产量严重下降，影响了出口创汇及其在国内市场上的竞争力。努力改善莲藕质量和产量，提高繁殖系数，解决目前生产上“僵藕”问题是当务之急。目前普遍采用每年均进行严格的大田选种的方法来改善或缓解上述问题的发生，但劳动强度大，技术要求高，效果不显著，不能真正彻底解决上述实践问题。
目前许多无性繁殖作物都使用茎尖生长点培养脱毒苗，并快繁脱毒种苗应用生产。莲藕茎尖脱毒快繁技术的研究已基本成熟，但莲藕组培苗的简易驯化技术尚未见报道，影响了莲藕组培(脱毒)苗的生产应用。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种莲藕组培脱毒种苗的驯化方法，提出最佳方案，简化组培苗应用中的生根培养、驯化过程及驯化对设施的要求，缩短了莲藕组培(脱毒)种苗的驯化周期，驯化成活的组培(脱毒)苗生长势旺，适合工厂化育苗，适于大田生产应用。
技术方案本发明所提供的一种莲藕组培脱毒苗的培养方法实施方案如下1)取莲藕茎尖为外植体，将茎尖外包叶鞘剥除后接种在附加0.01-8.0mg/l6-BA或ZRs和0-10mg/lNAA的MS或B5培养基中获无菌苗；后转接于附加0.01-10mg/l 6-BA，0-8.0mg/lNAA，30-50g/l蔗糖，pH5.6-7.2的MS或B5培养基中继代增殖，2)试管内驯化组培苗经增殖后，将莲藕培养脱毒苗转入1-3倍MS或B5基本培养基，附加4％-15％蔗糖、0-1000mg/l青霉素的培养基中，处理7-15天后，进入移栽驯化阶段，上述过程中，pH5.6-7.2，光照强度1800-2500lx，光照时间10-14h/d；1.3)试管外移栽驯化将经试管内驯化培壮后的莲藕组培脱毒苗，经自来水浸泡冲洗后，用50-5000mg/l氯化胆碱处理2小时-2天，浸蘸50-1000mg/LNAA后直接移栽于浅水大田。
有益效果本发明与现有技术相比，具有如下优点1.与目前采用的以成熟根茎(藕)作种相比，本发明利用莲藕茎尖为外植体，建立莲藕组培(脱毒)快繁体系，繁殖系数达8-20，可获大量脱毒苗，且不易发生变异，组培(脱毒)苗移栽成活率达90％以上，生长势旺，可大大减少用种量，便于种苗运输，从而解决了现有技术中的莲藕种苗繁殖系数低，用种量大、运输和生产成本高，不利于优良品种的快速大面积推广应用的问题，同时应用脱毒种苗可解决目前生产上严重发生的“僵藕”问题。与目前普遍采用的从生长期即开始一直到种藕采收持续进行的长时间选留种相比，本发明通过培育组培(脱毒)苗，劳动强度小，持续时间短，脱毒效果好。
2.本发明所提供的莲藕组培(脱毒)种苗简易高效驯化的方法省略了组培苗应用前的生根培养阶段，无需常规组培苗驯化所要求的温室、遮荫和弥雾等设施条件和较高的管理技术，驯化成本低，生产者容易接受。
3.本发明所提供的莲藕组培(脱毒)种苗简易高效驯化的方法适用于各种藕莲品种的组培(脱毒)苗。
具体实施例方式
实施例11)组培脱毒试管苗的获得供试品种为“美人红”(Nelumbo muciferaGaertn)。取“美人红”茎尖为外植体，自来水冲洗后，用70％乙醇表面消毒1分钟，再用0.1％氯化汞溶液消毒15-20分种，无菌水冲洗4-5遍后，剥去外包叶鞘，切取茎尖(生长点)后接种于三角瓶中，以MS为基本培养基，附加3.0mg/l6-BA和4.0mg/lNAA获无菌(脱毒)苗。将上述试管苗切割成带节个体接种于MS基本培养基中，附加2.0mg/l 6-BA，1.0mg/lNAA，30g/l蔗糖的MS培养基中进行继代增殖。
2)试管内驯化将莲藕培养(脱毒)苗转入1.5倍B5基本培养基，附加6％蔗糖、300mg/l青霉素的培养基中，处理12天后，进入移栽驯化阶段，上述过程中，pH5.6-7.2，光照强度1800-2500lx，光照时间10-14h/d；3)移栽(试管外)驯化将经试管内驯化培壮后的莲藕组培(脱毒)苗，经自来水浸泡冲洗后，用200mg/L氯化胆碱处理1天，浸蘸200mg/LNAA后直接移栽于浅水大田。8天后成活率可达93.3％。
实施例21)脱毒试管苗的获得供试品种为“扬藕一号”(Nelumbo nucifera Gaertn)和“美人红”。取茎尖(或生长点)为外植体，自来水冲洗后，用70％乙醇表面消毒1分种，再用0.1％氯化汞溶液消毒15-20分种，无菌水冲洗4-5遍后，剥去外包叶鞘，切取茎尖后接种于三角瓶中，以MS为基本培养基，附加2.0mg/l ZRs和1.0mg/lNAA，获培养苗。将上述试管苗切割成带节个体，接种于B5基本培养基中，附加8.0mg/lZRs，2.0mg/lNAA，50g/l蔗糖的B5培养基中进行继代增殖，2)试管内驯化将莲藕组培(脱毒)苗转入2倍MS基本培养基，附加10％蔗糖、500mg/l青霉素的培养基中，处理6天后，进入移栽驯化阶段，上述过程中，pH5.6-7.2，光照强度1800-2500lx，光照时间10-14h/d；3)移栽(试管外)驯化将经试管内驯化后的莲藕组培(脱毒)苗，经自来水浸泡冲洗后，用800mg/l氯化胆碱处理12小时，浸蘸100mg/lNAA后直接移栽于浅水大田。5天后成活率可达95.2％。
供试莲藕品种为大紫红，取茎尖为外植体，按照以上方法，调整培养基成份后实施结果如下1)试管苗培养基MS+2.0mg/l 6-BA+0.5mg/lNAA；继代增殖培养基MS+3.2mg/l 6-BA+2.0mg/lNAA，30g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加12％蔗糖、200mg/l青霉素的培养基中，处理6天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用5000mg/L氯化胆碱处理2小时，浸蘸100mg/LNAA后直接移栽于浅水大田，成活率可达91.2％。
2)试管苗培养基MS+3.0mg/l 6-BA+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基MS+5.0mg/l 6-BA+3mg/lNAA，30g/l白糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加8％蔗糖、400mg/l青霉素的培养基中，处理8天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用1000mg/L氯化胆碱处理8小时，浸蘸500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率可达92％。
3)试管苗培养基MS+6.0mg/l 6-BA+1.0mg/lNAA；继代增殖培养基MS+6.0mg/l 6-BA+0.5mg/lNAA，30g/l白糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入2倍MS基本培养基，附加6％蔗糖、500mg/l青霉素的培养基中，处理12天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用2000mg/L氯化胆碱处理5小时，浸蘸800mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率可达96％。
4)试管苗培养基B5+1.0mg/lZRs+0.5mg/lNAA；继代增殖培养基B5+2.0mg/lZRs+0.2mg/lNAA，40g/l白糖；驯化途径将莲藕组培(脱毒)苗转入2倍MS基本培养基，附加6％蔗糖、250mg/l青霉素的培养基中，处理12天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用2000mg/L氯化胆碱处理5小时，浸蘸800mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率可达96％。
5)试管苗培养基MS+7.0mg/lZRs+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+4.0mg/lZRs+1.0mg/lNAA，40g/l白糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入2倍B5基本培养基，附加10％蔗糖、600mg/l青霉素的培养基中，处理6天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用1000mg/L氯化胆碱处理8小时，浸蘸800mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率可达92.7％。
6)试管苗培养基B5+3.0mg/lZRs+3.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+6.0mg/lZRs+1.0mg/lNAA，30g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入1.5倍MS基本培养基，附加15％蔗糖、1000mg/l青霉素的培养基中，处理5天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用3000mg/L氯化胆碱处理8小时，浸蘸1000mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率91.5％。
7)试管苗培养基MS+2.0mg/l 6-BA+1.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+3.0mg/lZRs+0.5mg/lNAA，40g/l白糖；驯化途径将莲藕组培(脱毒)苗转入MS倍基本培养基，附加12％蔗糖、800mg/l青霉素的培养基中，处理5天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用4000mg/L氯化胆碱处理4小时，浸蘸1000mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率93.5％。
8)试管苗培养基B5+2.0mg/l 6-BA+0.2mg/lNAA；继代增殖培养基MS+4.0mg/lZRs+1.0mg/lNAA，40g/l白糖；驯化途径将莲藕组培(脱毒)苗转入3倍MS倍基本培养基，附加9％蔗糖、600mg/l青霉素的培养基中，处理8天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用3000mg/L氯化胆碱处理4小时，浸蘸2000mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率93.5％。
9)试管苗培养基MS+7.0mg/l 6-BA+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基MS+5.0mg/l 6-BA+1.0mg/lNAA，50g/l白糖；驯化途径将莲藕组培(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加8％蔗糖、500mg/l青霉素的培养基中，处理8天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用1000mg/L氯化胆碱处理10小时，浸蘸1500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率95％。
10)试管苗培养基B5+3.0mg/lZRs+1.5mg/lNAA；继代增殖培养基MS+6.0mg/lZRs+1.5mg/lNAA，30g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入1.5倍MS基本培养基，附加10％蔗糖、700mg/l青霉素的培养基中，处理12天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用3000mg/L氯化胆碱处理12小时，浸蘸100mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率91.6％11)试管苗培养基B5+2.0mg/lZRs+0.2mg/lNAA；继代增殖培养基MS+5.0mg/lZRs+1.0mg/lNAA，30g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入1.5倍MS基本培养基，附加12％蔗糖、500mg/l青霉素的培养基中，处理8天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用800mg/L氯化胆碱处理24小时，浸蘸500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率94.6％。
12)试管苗培养基MS+2.0mg/l 6-BA+0.1mg/lNAA；继代增殖培养基B5+5.0mg/lZRs，40g/l白糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入2.5倍B5基本培养基，附加15％蔗糖、1000mg/l青霉素的培养基中，处理6天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用1500mg/L氯化胆碱处理24小时，浸蘸200mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率95％。
13)试管苗培养基B5+3.0mg/l 6-BA+1.0mg/lNAA；继代增殖培养基MS+6.0mg/lZRs+3.0mg/lNAA，40g/l蔗糖；驯化途径将莲藕组培(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加10％蔗糖、800mg/l青霉素的培养基中，处理6天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用3000mg/L氯化胆碱处理12小时，浸蘸1500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率92.5％。
14)试管苗培养基MS+5.0mg/l 6-BA+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+4.0mg/lZRs+0.1mg/lNAA；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加10％蔗糖、600mg/l青霉素的培养基中，处理6天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用200mg/L氯化胆碱处理12小时，浸蘸1500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率90.5％。
15)试管苗培养基MS+3.0mg/l 6-BA+0.5mg/lNAA；继代增殖培养基MS+3.0mg/lZRs+0.1mg/lNAA，30g/l蔗糖；驯化途径将莲藕组培(脱毒)苗转入2倍MS基本培养基，附加9％蔗糖、300mg/l青霉素的培养基中，处理8天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用200mg/L氯化胆碱处理24小时，浸蘸1500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率95％。
16)试管苗培养基B5+3.0mg/lZRs+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+6.0mg/lZRs+0.5mg/lNAA，50g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入2倍MS基本培养基，附加6％蔗糖、100mg/l青霉素的培养基中，处理12天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用200mg/L氯化胆碱处理24小时，浸蘸500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率91.5％。
17)试管苗培养基MS+8.0mg/l 6-BA+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基+6.0mg/lZRs+1.0mg/lNAA，50g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加6％蔗糖、200mg/l青霉素的培养基中，处理15天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用500mg/L氯化胆碱处理24小时，浸蘸500mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率93％。
18)试管苗培养基B5+3.0mg/lZRs+1.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+6.0mg/lZRs+0.5mg/lNAA，40g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入1.5倍MS基本培养基，附加6％蔗糖、1000mg/l青霉素的培养基中，处理12天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用2000mg/L氯化胆碱处理24小时，浸蘸1000mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率96.5％。
19)试管苗培养基MS+8.0mg/lZRs+2.0mg/lNAA；继代增殖培养基B5+6.0mg/lZRs+0.5mg/lNAA，50g/l蔗糖；驯化途径将莲藕培养(脱毒)苗转入3倍B5基本培养基，附加15％蔗糖、800mg/l青霉素的培养基中，处理8天后，将莲藕组培(脱毒)苗取出，经自来水浸泡冲洗后，用5000mg/L氯化胆碱处理4小时，浸蘸1000mg/lNAA后直接移栽于浅水大田，成活率91.5％。
权利要求
1.一种莲藕组培脱毒苗的驯化方法，其实施步骤如下1.1)取莲藕茎尖为外植体，将茎尖外包叶鞘剥除后接种在附加0.01-8.0mg/l 6-BA或ZRs和0-10mg/l NAA的MS或B5培养基获无菌苗；后转接于附加0.01-10mg/l 6-BA，0-8.0mg/l NAA，30-50g/l蔗糖的MS或B5培养基中继代增殖，1.2)试管内驯化组培苗经增殖后，将莲藕培养脱毒苗转入1-3倍MS或B5基本培养基，附加4％-15％蔗糖、0-1000mg/l青霉素的培养基中，处理7-15天后，进入移栽驯化阶段，上述过程中，pH5.6-7.2，光照强度1800-2500lx，光照时间10-14h/d；1.3)试管外移栽驯化将经试管内驯化培壮后的莲藕组培脱毒苗，经自来水浸泡冲洗后，用50-5000mg/l氯化胆碱处理2小时-2天，浸蘸50-1000mg/LNAA后直接移栽于浅水大田。
全文摘要
本发明一种莲藕组培脱毒苗的驯化方法，属于蔬菜种苗生产技术领域。包括取莲藕茎尖为外植体，接种培养无菌苗；后转接培养基中继代增殖。组培苗无须进行生根培养，直接将培养(脱毒)苗转入1－3倍MS或B
文档编号A01H4/00GK1631075SQ20041006533
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者李良俊, 曹碚生, 赵有为, 孙磊, 谢科, 何小弟, 张晓冬 申请人:扬州大学