专利名称：在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物的制造方法以及因此所产生的转基因哺乳动物的制作方法
背景技术：
在过去十年已经由制药工业通过提取或通过重组技术来普遍地生产涉及人保健的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遗传构建体在细菌、酵母或哺乳动物细胞系中成功地得到了表达。然而，使用哺乳动物细胞培养物来获得复杂的蛋白质，如需要适当糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。
在过去十年已经日益增长地使用重组DNA技术来生产商业上重要的生物材料。为此，已经克隆了编码各种医学上重要的人蛋白质的DNA序列。这些包括胰岛素、纤溶酶原激活剂、α1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新出现的重组DNA技术，通常也从血液和组织中纯化这些蛋白质，这是昂贵而费时的方法，可能带有传播感染物质如导致ADIS和肝炎的那些的风险。
尽管在细菌中表达DNA序列来生产所需的医学上重要的蛋白质看起来是有吸引力的提议，实际上通常证明细菌作为宿主不能令人满意，因为外源蛋白在细菌细胞中不稳定并且没有得到正确地加工。
认识到这个问题，已经尝试了在哺乳动物组织培养物中表达所克隆的基因并已经在一些情况下证明了是可行的策略。然而，动物细胞的批量发酵是昂贵的且需要技术的过程。
因此存在对用于生产生物物质如正确修饰的真核多肽的高产量，低成本方法的需要。在该方法中不存在对人感染性的物质将是一个优势。
为了在奶中获得大量的人蛋白质，获得所需基因的转基因动物如牛的可能性已经引起了工业的极大兴趣。文献中的几个小组报道了生产人血清清蛋白、α抗胰蛋白酶的成功以及在转基因牛或山羊中的一些其它实例。
之前已经在小鼠或大鼠中进行了许多实验，通常优选将转基因表达限制于乳腺中，因为使用β酪蛋白或乳清蛋白启动子，其只响应哺乳期雌性中的乳腺转录因子。
异源蛋白专门在奶中的表达意欲避免对宿主动物健康的不利影响并提供容易的纯化方法。
目前人们致力于建立几个系统来提高细胞转染或选择的产量，并选择同源胎儿体细胞的来源来提高克隆动物的存活和免疫状况。
另一方面，出于农业和生物药物的目的，存在对体细胞核移植的巨大兴趣，主要是使原种家畜的繁殖和转基因动物的工程化变成可能。简要地，核移植(NT)包括受体卵母细胞的去核，接着将供体细胞移植至受体胞质体紧密并置的卵周隙中，并使它们融合。通过化学或物理激活来人工诱导发育。通过体细胞核移植来产生克隆的后代已经在绵羊(Campbell，K.H.等，Nature 38064-66(1996)，1996；Wells，D.N.等，Biol Reprod 57385-393(1997)；Wilmut，I.等，Nature385810-813(1997))；山羊(Baguisi，A.等，Nat Biotechnol17456-461(1999))和牛(Cibelli，J.B.等，Science 2801256-1258(19981)；Kato，Y.等，Science 2822095-2098(1998)；Wells，D.N.等，Reprod Fertil Dev 10369-378(1998))中获得了成功。
存在几个影响NT结果的因素，包括去核、融合、激活和供体-受体细胞周期同步性的方法。已经获得了受体卵母细胞去核的高效率，使用DNA特异性活体染料来显现染色质(Stice，S.L.和Keefer，C.L.，Biol Reprod 48715-719(1993)；Westhusin，M.E.等，J ReprodFertil 95475-480(1992))。供体细胞和受体卵母细胞的融合取决于脉冲场中细胞对准的准确度、供体细胞和受体卵母细胞的接触和供体细胞的大小(Collas，P.等，Anal Biochem 2081-9(1993))。NT重建胚胎的激活已经得到精心的改进并且发育成胚泡的速度等于体外授精的卵母细胞(Liu，L等，Mol Reprod Dev 49298-307(1998))。
已经实现NT胚胎的成功发育，使用成熟的卵母细胞(Willadsen，S.M.，Nature 32063-65(1986))、合子(McGrath，J.和Solter，D.，Dev Biol N Y 437-55(1985))和卵裂期的胚胎(Tsunoda，Y.等，J Reprod Fertil 96275-281(1992))作为受体胞质体；然而，这取决于供体核的来源。受体胞质体和供体细胞之间的细胞周期的相容性是影响NT胚胎发育的一个重要因素。需要适当的同步化来保持重建胚胎的倍性。
有丝分裂的细胞周期具有以下连续的期复制前间期(G1)、DNA合成(S)、有丝分裂前间期(G2)和有丝分裂(M)。在单个细胞周期过程中，在有丝分裂前所有基因组DNA复制一次。移植至去核成熟卵母细胞(中期II)中的间期供体核经历几次形态改变。融合后，但在供体核包膜分解(NEBD)之前，染色体浓缩(PCC)。这些改变通过促成熟/有丝分裂/减数分裂因子(MPF)和有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活性来诱导(Collas，P.和Robl，J.M.，Biol Reprod45455-465(1991))。在所有减数分裂和有丝分裂的细胞中发现了MPF和MAPK活性且在中期最高，这些高含量在哺乳动物卵母细胞中还诱导了停止于中期II。通过授精或用钙离子载体激活来减少MPF和MAPK是完成减数分裂、第二极体发射、精核解凝和前核形成的信号。
NEBD和PCC对供体染色质的直接作用取决于移植时供体核的细胞周期。二倍体G0/G1核浓缩成单染色单体，但是四倍体G2核浓缩成双染色单体。然而，S期的核在移植时显示出特征性的“粉碎”外观；PCC产生大范围的DNA破坏。因此，可以在激活时或激活之前将G1或G0的核移植至中期II的卵母细胞中来产生正确的倍性。第二种方法是将核移植至之前激活的S期的卵母细胞中，这种情况中，可以使用G1、G0或S期的供体细胞。因为MPF和MAPK是低的；染色质解凝，并经历DNA复制没有PCC和NEBD。
已经在小鼠中报道了第三种同步化方案，其中通过胚胎重建来产生活的后代的发育，使用G2或中期供体细胞和去核的中期2卵母细胞(Cheong，H.T.等，Biol Reprod 48958-963(1993)；Kwon，O.Y.和Kono，T.，Proc Natl Acad Sci USA 9313010-13013(1996))。报道了从NT重建胚胎中极体的挤出，导致单个二倍体胚胎和二倍体极体(Kwon，O.Y.和Kono，T.，Proc Natl Acad Sci USA 9313010-13013(1996))。然而，没有报道在牛、绵羊或猪中NT进入去核MII卵母细胞后极体的形成，提示物种之间在完整纺锤体的力学控制形成和极体的挤出中的差异。
已经提出供体细胞和受体细胞周期的阶段对于为供体细胞核重编程度也是重要的。增加供体核移植和合子转录之间的时间可以促进核重编程序。为此，几位作者在融合后几小时激活了卵母细胞(Cibelli，J.B.等，Science 2801256-1258(1998))；Wakayama，T.等，Nature394369-374(1998)；Wells，D.N.等，Biol Reprod 60996-1005(1999))。其它报道应用了顺序核移植(Stice，S.L.和Keefer，C.L.，Biol Reprod 48715-719(1993))。
增加供体核重编程序时间的未考察过的方法是在间期II之前通过核移植。在生发泡破裂(GVBD)后，通过卵母细胞胞质MPF和MAPK的实质性增加来调控所有的核事件，其防止了核被膜的重建和进入S期直至授精或激活。因此，成熟卵母细胞可以是用于间期或G2供体细胞的通用受体。如果激活在细胞分裂之前诱导了S期，甚至G1或G0也可以用作供体细胞。
当G2或M的卵裂球用作供体细胞时，核重编程序是可能的(Cheong，H.T.等，Biol Reprod 48958-963(1993)；Kwon，O.Y.和Kono，T.，Proc Natl Acad Sci USA 9313010-13013(1996)；Liu，L.等，Mol Reprod Dev 47255-264(1997))。一种解释是作为染色体浓缩的结果置换了染色质中的一些因子。实际上，对于核移植，已经认为NEBD和PCC是核重编程序的形态学征兆。此外，授精时精子染色质极端浓缩，它的体积比体细胞核的体积小得多，且卵母细胞具有除去精核蛋白的能力。在精子-卵母细胞融合的过程中，卵母细胞染色体也被浓缩。可能是浓缩的染色质构象具有一些生物关联。因而，通过中期核移植模拟这种情况，中期去核的受体可以提高NT结果。然而，少数研究者已经在家畜中使用该方法并使用卵裂球作为供体细胞(Liu，L.，等，Mol Reprod Dev 47255-264(1997))。
本发明的一个目的是表征现有的体细胞核移植并将其精心改进成用于从成体供体细胞生产遗传上相同的牛的可靠而经济的技术。
发明内容
本发明涉及非人转基因哺乳动物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平产生重组生长激素。重组生长激素可以是，但不限于，人生长激素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。
本发明进一步涉及提供目标蛋白在哺乳动物乳房细胞中表达的质粒，其中表达受到β酪蛋白启动子的调控。目标蛋白可以是，但不限于，人生长激素。
本发明还涉及制造在其奶中产生重组生长激素的非人转基因哺乳动物的不同方法。重组生长激素可以是，但不限于，人生长激素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。
本发明还涉及生产目标蛋白的方法，包括制造在其奶中产生所述蛋白的非人转基因哺乳动物，从所述非人转基因哺乳动物获得所述奶并从奶中纯化所述蛋白质。目标蛋白可以是，但不限于，人生长激素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。
本发明还涉及从转基因哺乳动物奶中生产和纯化重组生长激素的方法。重组生长激素可以是，但不限于，人成长激素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。
图1A-1B显示了从转基因奶牛收集的每日奶体积，该转基因奶牛是通过融合去核的卵母细胞和之前用质粒转染的成纤维细胞而获得的，该质粒含有编码人生长激素(hGH)的基因和指导其表达至乳房细胞的启动子。
图2A-2C显示了从相同转基因奶牛收集的奶中发现的细菌计数。
图3A-3B显示了在相同转基因奶牛的奶中含有的hGH的生物活性。
图4A显示了在相同转基因奶牛的奶中产生的hGH的每日质量。该量值和从转基因奶牛收集的每日奶体积一起作图表示图4B中。
图5A显示了在相同转基因奶牛的血清中的hGH和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的浓度，和在相同转基因奶牛的奶中产生的hGH的每日质量。将转基因奶牛的血清中的hGH浓度和转基因奶牛的奶中产生的hGH的每日质量一起作图表示于图5B中。在图5C中，将转基因奶牛的hGH和IGF-1血清浓度的时间特征一起作图。
图6A和6B显示了在通过在其奶中产生hGH的转基因奶牛的亚克隆而获得的两个转基因小牛中hGH和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的血清浓度。在图6C和6D中，对这些转基因小牛中每个的hGH和IGF-1血清浓度的时间特征一起作图。
发明详述本发明涉及非人转基因哺乳动物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平产生重组生长激素。该哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。转基因哺乳动物的其它物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、山羊物种或啮齿动物物种。
重组生长激素可以是，但不限于，人生长激素。该分子，也称为促生长素，是由191个氨基酸构成的蛋白质，具有约22kD的分子量。它对于线性生长是必要的且其应用得到了很好地建立。
本发明还涉及转基因动物，其特征在于为了产生更多的含有所述激素的奶在其奶中产生的重组生长激素自我刺激了动物乳腺的事实。
本发明还涉及质粒，该质粒包含可操作地连接于β酪蛋白启动子和β内酰胺酶基因的编码目标蛋白的基因。该目标蛋白可以是，但不限于，人生长激素。该质粒可以是pRβhGH。
进一步的实施方案中，质粒另外包括新霉素抗性基因用于遗传霉素抗性细胞的选择。这样质粒的实例是pRNeo。
进一步的实施方案中，质粒包括编码绿色荧光蛋白如GFP的基因，其在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下。这样质粒的实例是pRNeoGreen。
本发明进一步涉及质粒如上述的那些，其已经通过限制酶消化而线性化。尤其是，使用限制酶ApaLI并切除β内酰胺酶基因。
根据布达佩斯条约正在进行上述质粒的保藏程序。保藏单位的名称和地址是DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德国微生物保藏中心)，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，德国。在适当的时候将提供相应的保藏号。
本发明进一步涉及基于含有Neo抗性基因的质粒而构建的质粒，其中在hGH编码区上游插入了修饰的较短的β酪蛋白启动子区，如pVEβcashGH。通过切除β内酰胺酶基因可以从质粒pVEβcashGH获得线性片段。
本发明进一步涉及用于遗传构建体转染的方法，使用用于脂质体应用的阳离子脂质的组合。
还描述了在合适培养基中选择新霉素抗性细胞的方法，如选择绿色荧光转基因细胞的方法。小心地挑选这些细胞，使得避免细胞损伤。
本发明还涉及将停止于G0或细胞周期不同时间的细胞核移植至去核牛卵母细胞中的方法。
本发明涉及将转基因胚胎移植至激素刺激的奶牛子宫中的方法。
根据本发明，公开了测定动物健康参数的方法。为了测定这些参数，对动物的血清和奶两者进行了分析。
本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括获得编码生长激素的基因，将基因克隆进质粒中，借此将基因可操作地连接至指导基因在乳房细胞中表达的启动子，形成表达质粒，用该表达质粒转染体细胞使得质粒掺入到细胞的基因组中，形成转基因体细胞，将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞，将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合形成单细胞胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括从雌性哺乳动物中提取体细胞，任选地为成纤维细胞，该哺乳动物是转基因的以在其奶中产生重组生长激素，将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞，将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合形成单细胞胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括使雌性非人哺乳动物超排卵，该哺乳动物是转基因的以在其奶中产生重组生长激素，将该哺乳动物用从雄性非人非转基因哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎，收集胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括使雌性非人哺乳动物超排卵，该哺乳动物是转基因的以在其奶中产生重组生长激素，将该哺乳动物用从雄性非人哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎，从中获得精子的哺乳动物是转基因的以产生重组生长激素，收集胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明进一步涉及制造非人转基因哺乳动物的方法，包括使雌性非人非转基因哺乳动物超排卵，将该哺乳动物用从雄性非人哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎，从中获得精子的哺乳动物是转基因的以产生重组生长激素，收集胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
重组生长激素可以是，但不限于，人生长激素。非人转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。
本发明进一步涉及生产蛋白质的方法，包括制造在其奶中以意想不到的高产量产生目标蛋白的非人转基因哺乳动物，从该非人转基因哺乳动物获得奶，并从奶中纯化目标蛋白。
本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产目标蛋白的方法，该哺乳动物是通过包括以下步骤的方法制得的获得编码所述目标蛋白的基因，将基因克隆进质粒中，借此将基因可操作地连接至指导基因在乳房细胞中表达的启动子，形成表达质粒，用表达质粒转染体细胞，任选地为成纤维细胞，使得质粒掺入到所述体细胞的基因组中，形成转基因体细胞，将成熟卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞，将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合形成单细胞胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产目标蛋白的方法，该哺乳动物通过包括以下步骤的方法制得从雌性哺乳动物提取体细胞，任选地为成纤维细胞，该哺乳动物是转基因的以在其奶中产生，将成熟的卵母细胞去核，形成去核的卵母细胞，将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合形成单细胞胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产目标蛋白的方法，该哺乳动物通过包括以下步骤的方法制得使雌性非人哺乳动物超排卵，该哺乳动物是转基因的以在其奶中产生所述的目标蛋白，将该哺乳动物用从雄性非人非转基因哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎，收集胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产目标蛋白的方法，该哺乳动物通过包括以下步骤的方法制得使雌性非人哺乳动物超排卵，该哺乳动物是转基因的以在其奶中产生所述的目标蛋白，将该哺乳动物用从雄性非人哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎，从中获得精子的哺乳动物是转基因的以产生所述的目标蛋白，收集胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
本发明还涉及在非人转基因哺乳动物中生产目标蛋白的方法，该哺乳动物通过包括以下步骤的方法制得使雌性非人非转基因哺乳动物超排卵，将该哺乳动物用从雄性非人哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎，从中获得精子的哺乳动物是转基因的以产生所述的目标蛋白，收集胚胎，将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中，并监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
其特征在于在其奶中以意想不到的高水平产生目标蛋白的转基因哺乳动物可以是，但不限于，牛物种的动物。转基因哺乳动物的其它物种可以是，但不限于，猪物种、绵羊物种、山羊物种或啮齿动物动物。目标蛋白可以是，但不限于，人生长激素。
本发明进一步涉及在其奶中产生重组人生长激素的牛物种的非人转基因哺乳动物，它的基因组包含整合的质粒，所述的质粒包含人生长激素基因和指导所述基因在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。
本发明进一步涉及以意想不到的高水平产生hGH的转基因哺乳动物，但没有显示以这样高水平的hGH产生所期望的自然生长。由于转基因牛受到人生长激素存在的影响，预期动物生长将超过非转基因的生长速率，并患病如糖尿病、高血压、心血管疾病提高的风险和身体器官的扩大，包括肝脏、脾脏、肾脏和心脏。理论上，这样高含量的hGH应使得动物不能存活。然而，情况并非如此。哺乳动物，如奶牛，在其血液中含有令人担忧的高水平的外源激素，但是其完全健康并产生显著的重组蛋白生产力，构成意想不到的和创新的贡献。
本发明的重组人生长激素以意想不到的高水平产生。所产生的人生长激素的含量高于约1.0g/L奶。hGH的含量可以高于约2.0g/L奶。所产生的hGH的含量还可以高于约3.0g/L奶。另一实施方案中，所产生的hGH的含量可以高于约4.0g/L奶。仍然另一实施方案中，所产生的hGH含量可以高于约5.0g/L奶。进一步的实施方案中，所产生的hGH含量可以高于约6.0g/L奶。仍然进一步的实施方案中，所产生的hGH含量为约1.0g/L奶至约7.0g/L奶。进一步的实施方案中，所产生的hGH含量为约2.0g/L奶至约6.0g/L奶。仍然另一实施方案中，所产生的hGH含量为约2.0g/L奶至约5.0g/L奶。
此外，本发明涉及从转基因哺乳动物的奶中纯化重组生长激素的方法，以及所述激素的测定法。纯化方法可以包括色谱和浓缩步骤。可以使用不同类型的色谱，包括离子交换色谱、反相色谱、分子排阻色谱或亲和色谱。离子交换色谱可以是阴离子交换色谱。亲和色谱可以是免疫亲和色谱。此外，可以进行多个色谱步骤。
本发明进一步涉及从产生重组生长激素的非人转基因哺乳动物的奶中纯化重组生长激素的方法，包括将非人转基因哺乳动物的奶澄清，得到澄清的奶，并对澄清的奶进行色谱，得到纯化的重组生长激素。
本发明进一步涉及从产生重组生长激素的非人转基因哺乳动物的奶中纯化重组生长激素的方法，包括将非人转基因哺乳动物的奶澄清，得到澄清的奶，并对澄清的奶进行膨胀床阴离子交换色谱，得到阴离子交换色谱过的物料，对阴离子交换色谱过的物料进行反相色谱，得到反相色谱过的物料，对反相色谱过的物料进行阴离子交换色谱，得到阴离子交换色谱过的物料，对阴离子色谱交换过的物料进行分子排阻色谱，得到分子排阻色谱过的物料，将分子排阻色谱过的物料浓缩，得到浓缩的物料，并对浓缩的物料进行分子排阻色谱，得到纯的重组生长激素。
本发明还涉及从产生重组生长激素的非人转基因哺乳动物的奶中纯化重组生长激素的方法，包括将非人转基因哺乳动物的奶澄清，得到澄清的奶，并对澄清的奶进行免疫亲和色谱，得到免疫亲和色谱过的物料，对免疫亲和色谱过的物料进行反相色谱，得到反相色谱过的物料，对反相色谱过的原料进行阴离子交换色谱，得到阴离子交换色谱过的物料，对阴离子交换色谱过的物料进行分子排阻色谱，得到分子排阻色谱过的物料，对分子排阻色谱过的物料进行浓缩，得到浓缩的物料，并对浓缩的物料进行分子排阻色谱，得到纯的重组生长激素。
上述纯化方法的重组生长激素可以是，但不限于，人生长激素。转基因动物可以是，但不限于，牛物种的哺乳动物。
具体实施例方式
以下实施例是本发明方法和组合物的说明，而不是限制。在化学物质的酶生产和蛋白质纯化方法中通常遇到的各种条件和参数的其它合适的本领域技术人员显而易见的修改和改进在本发明的精神和范围内。
实施例1表达质粒的构建我们生产了带有大部分牛β酪蛋白基因启动子的构建体，包括5’-非编码β酪蛋白基因区的短片段，与人生长激素基因的编码序列融合。不同构建体中所用的β酪蛋白区从3.8kbp减小至约1.3kbp。根据是否包括内在的poly A信号，hGH基因包括约2至2.2kbp。
在pUC或pBS类型的通常的克隆载体的多接头中容纳表达盒。
该启动子确保基因的组织特异性和发育可调型表达在其控制下，如β酪蛋白，和这种情况中的异源hGH。
最具代表性的质粒是pRβhGH，其携带全长牛β酪蛋白启动子，与人生长激素基因的编码序列融合。
公开的其它构建体主要源自如所述的原始的构建体，来提高转染细胞的选择或DNA进入牛细胞基因组的整合效率。
第一阶段中，用含有遗传霉素抗性基因的质粒进行共转染来帮助选择，但是接着，使用其它构建体，在含有hGH表达盒的相同载体中带有用于新霉素抗性的NPT基因。这样质粒的实例是pRNeo。
获得用于组成型表达绿色荧光蛋白的另一种质粒，其包括CMV启动子，植物来源(苜蓿)的增强子和来自水母A.victoria的绿色荧光蛋白基因。这样质粒的实例是pRNeoGreen。
此外，生产了另一种质粒。这是基于含有Neo抗性基因的质粒来构建的，其中在hGH编码区上游插入了修饰的较短的β酪蛋白启动子区。该质粒是pVEβcashGH。
生产了其它构建体，其中通过ApaLI限制酶切除了β内酰胺酶区，并在琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取后纯化含有完整表达盒的线性片段。
通过限制酶和DNA测序来分析构建体，并预先在乳腺细胞系中通过荧光抗体识别测试它们进行hGH表达的能力。
将作为涉及遗传构建体这部分的实例来详细描述质粒pVEβcashGH的制备。
pVEβcashGH的制备该构建体的目的是提供β酪蛋白启动子区的最小延伸以指导下游立即融合的hGH基因，与其在宿主生物中的poly A信号一起的特定可调型转录。
使用pVEX作为原始载体允许使用通过已经存在于该质粒中的tk启动子调控的新霉素抗性基因。通过用StuI和NdeI限制来消除包括554bp的早期SV40启动子，最后的位点用Klenow填补，且自我连接所得到的载体。
PCR扩增来自3.8kbp原始基因启动子区的1.3kbp片段后获得了β酪蛋白短的启动子，使用以下寡聚物作为引物PB1 5’TCTACTCGAGGATCATCTATCTGTCCCAAAG(SEQ ID NO1)和PB2 5’CTAGGATCCAATGATCTGATTTTGTGG(SEQ ID NO2)该片段包括1230bp的规范启动子加49bp的β酪蛋白基因的第一个非编码外显子。
通过PCR技术获得了hGH基因片段，基于原始的牛基因组hGH克隆，使用以下的寡聚物作为引物PB4 5’CTAGGATCCATGGCTACAGGTAAGCGCC(SEQ ID NO3)和GHTE 5’ATGCTGTGTCTGGACGTCCT(SEQ ID NO4)。
用Klenow酶将β酪蛋白启动子片段平截并插入pVEX的BamHI填补的位点。选择重组克隆后，我们选择适于使用位于pVEX下游的唯一HindIII位点的特定方向来插入hGH编码区。
为此，将hGH片段也平截了并填补了质粒HindIII位点。选择含有β酪蛋白启动子和恰当融合的hGH的克隆使得只在该启动子的控制下表达hGH。
该质粒的大小约为8.5kbp。
体细胞的转染然后将质粒pRβhGH(与另一带有遗传霉素抗性基因的质粒一起)、pRNeo、pRNeoGreen或pVEβcashGH用于转染体细胞的初级培养物，使用磷酸钙或脂质体方法。通常使用胎牛成纤维细胞来待转染。
将遗传霉素加入培养物中来选择转染的细胞。2至8周后，对遗传霉素具有抗性的细胞适于用作供体细胞来获得转基因克隆。通过PCR分析转染的所选择的细胞含有表达盒，以确保合适的核移植来产生转基因胚胎。
实施例2卵母细胞的去核和成熟去核卵母细胞中的中期核移植牛卵母细胞的收集和体外成熟从屠宰场卵巢中吸出牛的卵母细胞并在TCM-199+5％FCS中于39℃成熟24小时。在使用前用CO2平衡成熟培养基至少2小时。在含有1mg/ml牛睾丸透明质酸酶的温热TL-HEPES中涡旋2分钟使成熟的卵母细胞裸露。
使用卵丘细胞进行核移植去核使用Narishige液压显微操作器和Nikon Diaphot显微镜将卵母细胞机械去核。用20μm斜角的和削尖的吸管进行去核。之前用5μg/ml的bisbenzimidine(Hoechst 333421)染料将卵母细胞染色20分钟。在紫外线下通过观察被染色的染色体将中期去核。在吸管之内抽吸后评估中期染色体。将转基因体细胞移植至卵周隙中并严格地与去核的卵母细胞相对。
融合将转基因体细胞和去核的卵母细胞在融合室中人工对准使得待融合的膜平行于电极。使用玻璃的胚胎操作吸管来进行。
通过电方式进行融合使用180伏特/cm的一个电脉冲进行融合15μs(BTX ElectroCell Manipulator 200)2并用BTX Optimizer-Graphic Pulse Analyzer来监控。用于脉冲胚胎的室由相隔0.5mm放置于玻璃的显微镜载玻片上的两个0.5mm的不锈钢丝电极组成。监控假定合子的融合、溶胞和断裂。
发育能力的评估在授精后48小时评价合子的断裂并在7至9天后评价发育成桑椹胚或胚泡。
1Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA2BTX Inc.，San Diego，Ca，USA实施例3细胞和胚胎培养在实验中测试不同的供体细胞、培养系统和卵母细胞受体处理，目的在于简化牛克隆程序中的方法并提高胚胎的存活率。当成体成纤维细胞用作供体细胞时，使用了重建胚胎的三种培养系统TCM-199+5％FCS，Menezo+5％FCS(两者都含有VERO细胞作为共培养物)和无共培养物但是具有较低O2浓度的SOF。当供体细胞是遗传上和非遗传上修饰的胎儿成纤维细胞时，也将SOF培养基用于培养重建的胚胎。最后，当遗传上修饰的胎儿成纤维细胞用作供体细胞时，之前用roscovitine(R)处理受体卵母细胞来中止减数分裂并最佳化受体的适用性。从屠宰场卵巢中吸出卵母细胞并在TCM-199+5％FCS中于39℃成熟24小时。对于R处理的组，在成熟之前，在TCM-199+5％FCS中将卵母细胞与25μM R在39℃温育24小时。在含有1mg/ml牛睾丸透明质酸的TL HEPES中涡旋3分钟使成熟的卵母细胞裸露。评估中期并在紫外线下(＜6秒)通过用Hoechst 33342(5μg/ml)观察将卵母细胞去核。将来自Augus公牛的成体成纤维细胞和来自45天大的Jersey雌性胎儿的胎儿成纤维细胞用作供体细胞。使用脂质体进行用含有新霉素抗性基因的构建体的转染。用遗传霉素选择10-15天后，通过电脉冲将G0/G1期的供体细胞与去核的卵母细胞融合。3小时后，通过在TL-HEPES中与5μM离子霉素孵育4分钟和与2mM 6-DMAP孵育3小时来诱导激活。然后用TL-HEPES洗涤卵母细胞并在TCM-199+5％FCS+10g/l清蛋白中或在Menezo+2％FCS中(两者都含有VERO细胞)，或在SOF培养基和5％CO2+5％O2+90％N2中共培养。通常，每个受体奶牛非外科手术地移植两个胚泡，并通过超声波在30-35天测定怀孕。记录卵裂(48小时)、发育成胚泡(第7至9天)并通过Chi-square来分析。在SOF中培养胚胎时，卵裂率和发育成胚泡较高。然而，没有观察到由于不同培养条件或供体细胞来源的怀孕率的差异。中止减数分裂成熟24小时没有损害受体卵母细胞的发育能力。因此，用roscovitine处理可以用于提高NT方法中的卵母细胞的有效性。参见以下的表1。
表1
栏中具有不同上标的百分数是有差异的(P＜0.05)。
使植入的奶牛正常通过怀孕直至自然分娩。最后，chirurgic方法(Caesarea)可以用于分娩。在头48小时期间给新生儿喂养富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(所有都不含动物来源的化合物)。
实施例4对转基因小牛和所产生的重组蛋白进行的测试该实施例中，我们呈现了对特定的转基因小牛及其产生的重组蛋白所进行测试的完整描述，该转基因小牛是作为实施例1至3中所述方法的结果而获得的。尽管如此，尚须清楚的是对作为其它获得转基因小牛方法，如以下实施例5和6中所述的那些方法的结果而出生的动物进行了同一套的测定。
通过对从小牛白细胞中纯化得到的DNA进行PCR反应，使用非转基因jersey小牛的DNA作为负对照，证明了在转基因小牛细胞的基因组中包括牛β酪蛋白启动子和hGH编码基因。可以作为不同于动物的同源β酪蛋白基因的单一DNA片段一起发现它们。
使用Pharmacia自动测序仪，证实了插入的基因序列100％对应于hGH编码基因。其包括内含子、分泌信号和终止子。将控制在我们的小牛中相同hGH基因表达的牛β酪蛋白启动子也进行了测序。所有那些元件与其预期的理论序列精确地一致，该理论序列来自用于转化细胞的遗传构建体，从该细胞产生了克隆。
一旦已知该实验遗传阶段的正确性，我们便转向证明所产生的重组蛋白是所期望的并在每一个物理和化学特性方面都与天然hGH相一致。
为此，我们不得不从小牛获得奶，由于当动物处于产奶时间时，β酪蛋白启动子使得重组蛋白只在乳腺中表达。
然后通过激素处理来诱导转基因小牛使其到满十个月时产奶。到那个时间小牛称重为240kg(约530lbs)。
所述处理的第一阶段包括通过皮下途径，联合给予雌激素(雌二醇苯甲酸酯，Histeren，Instituto Rosenbusch)和孕激素(甲孕酮醋酸酯，Pronal，Aton)，包括5次连续应用每种药物，剂量分别为0.1mg/kg和0.25mg/kg，每48小时(即，第1、3、5、7和9天，假定处理开始于第一天)。
第二个阶段包括通过皮下途径，给予地塞米松(Decadron，Sidus)和催产素(Orasthin，Hoechst Marion Roussel)；将总量为20mg的前者在第18至20天的时间段内进行注射(每天为所述总量的三分之一)，而在第21至23天应用三次50IU的后者。
上述信息总结于表2中表2
*每天给予总量(20mg)的约三分之一如所期望的，在处理结束后奶牛开始产生初乳，然后所产生流体的品质逐渐变成奶。将收集的流体适当地保存并彻底地分析。
对初乳和奶(为了简化，初乳和奶在下文中都称为“奶”，除了当应该进行区分时)进行了几个测试，其结果显示于图1-4中。首先，测量所收集奶的体积。开始的奶生产力(头五个泌乳日)约为1,650mL/天。在第一个产奶月中，每天进行两次手工挤奶，一次在上午，一次在下午(可以注意每个乳房对终体积的贡献)；而从第二个月起，因为奶的产生开始增加，每天进行三次挤奶(在上午、中午和下午)。每天的体积以或多或少的连续方式增加，直至头次挤奶后三个月达到接近于10,000mL。在每日奶体积对日期的曲线(图1B)中可以观察到关于该主题的详细信息(图1A)。
与奶体积的测量平行，对奶进行了微生物学测定，其结果(图2A)显示于每ml CFU(菌落形成单位)对日期的相应曲线中(图2B-2C)。
还通过在NB2细胞培养物中的体外生物活性测定评估了(hGH的)生物活性(图3A-3B)。证明了小母牛的奶中产生的重组hGH的生物活性在母亲的误差等级内，处于人天然hGH的正常值。此外，通过蛋白质印迹研究了所获得的奶，检测了其中主要的条带，对应于完整hGH。还发现了对应于断裂变体和聚集体的其它次要条带，如在这些生产系统中所预期的。
利用关于生物活性和每日体积的信息，可以使用公式1来计算hGH的日产量，其中mhGH是以毫克计的每日产生的hGH质量；BA，以国际单位表示的生物活性；SA，hGH的比活性(3IU/mg)；和V，每日收集奶的体积。数据显示于图4A中。hGH每日质量的曲线显示于图4B中。为了建立hGH每日质量和每日奶体积之间的直观关联，也将后者作图表示于图4B中。
mhGH=BASA×V]]>(公式1)可以从该信息观察到，奶中hGH的每日质量和每日奶体积随着奶牛的发育趋于增加(尽管，前者以更大的比例)，其构成重组激素生产力(每升奶中的hGH克数)的上升趋势。可以注意到该生产力从产物是初乳时的约每升2g hGH(头次挤奶)至从第二个泌乳月起的每升奶5g hGH的平均量。因此，随着生产力的提高获得了意想不到高产量的人生长激素，随着流体的品质从初乳变成奶以或多或少连续的方式。
尽管目前每天产生的hGH质量是相当显著的，但是应该注意到，因为奶牛还没有完全生长，每天产生的重组蛋白的质量上升趋势应该会在将来持续，直至达到最大值。
对奶进行测试的同时，对奶牛的血清进行了一套不同的测定，其结果显示于图5A-5C中。首先，进行奶牛血清中hGH浓度的测量。将结果(图5A)与奶中hGH的每日质量一起作曲线于图中，使得可以比较两个量值(图5B)。
(人)血清中GH的参考范围是0.06-5ng/ml。假定对于牛是假设的相似范围，可以注意到，除了开始时，转基因奶牛血清中hGH对日期的整个曲线完全超过所述范围的上限。尽管该事实，必须考虑尽管对于它们的氨基酸序列和3D-结构，hGH和相应的牛激素(bGH)非常相似，前者，尽管是完全功能性的，但在牛中不是完全活性的。
因此，为了评估由于在其血清中这些高含量的hGH对奶牛健康的潜在风险，同时进行了IGF-1(胰岛素样生长因子1，也称为促生长因子C)血清浓度的测量(图5A)。生长激素主要通过在肝脏中形成的IGF-1执行其功能。因为IGF-1介导许多体内细胞分裂和生长激素的代谢作用，所以IGF-1评估对于可疑的生长激素失调的间接评价是有价值的诊断工具。因此，IGF-1代表生物可利用的生产激素的可靠指示物。这些分析的结果与对应于hGH的结果一起显示于图5C中，可以同时观察两个量值。
此外，为了具有对照组并因此建立与对应于转基因奶牛数据的比较，测量了非转基因奶牛组血清中的IGF-1和hGH。对于非转基因组和转基因奶牛的两种蛋白质测量的平均值显示于以下的表3中。
表3
值得注意的是非转基因组中hGH的平均血清浓度位于假设参考范围内，而转基因奶牛的平均值完全超过所述范围的上限。此外，无容置疑的是转基因动物血清中的IGF-1平均含量绝对高于对应于非转基因奶牛的，其构成根本的差异。
因此，尽管转基因奶牛血清中hGH的高浓度(已知其在人中导致具有严重后果的疾病，如糖尿病、高血压、心血管疾病提高的风险和身体器官的扩大，包括肝脏、脾脏、肾脏和心脏)理论上将使得动物不能存活，这明显地并不能代表对其健康和保持良好状态的障碍。在其血液中具有令人惊讶高含量的外源激素，但是其完全健康并产生突出产量的重组蛋白的奶牛构成意想不到的和创新的贡献。
本发明另一创新的方面是进入奶牛血流中的重组hGH，刺激乳腺产生更多的奶。该作用是间接获得的，即，通过IGF-1的作用。该分子提高了通过乳腺的血液流动，提供了用于合成乳脂、蛋白质和乳糖的关键前体物质。因此，IGF-1起指导营养物通过血液流向乳房细胞的作用，在乳房中它们帮助产生奶。因此，获得了自我刺激的动物，因为转基因奶牛的奶中产生的重组hGH通过乳腺刺激促进了动物产生的奶体积的持续增加，相应地在其奶中分泌更多的hGH。
实施例5通过亚克隆获得转基因小牛使用1.5mm直径的针从转基因小牛的耳朵取出五个组织样品，为了该目的之前已经将针的末端做成了斜角。将样品在含有抗生素和抗真菌剂的基于PBS的培养基中冷冻运送至实验室。
然后，将组织样品在含有10％胎牛血清和抗生素的MEM培养基中在39℃和5％CO2气氛下温育72小时。最终，取出组织样品，使平板周围的成纤维细胞生长直至连生。一旦达到连生，为了获得它们在G0期的同步化，将成纤维细胞至少孵育5天而没有改变培养基，通过用显微镜观察来评估。
胰蛋白酶作用后，将单个成纤维细胞与根据实施例2的去核牛卵母细胞融合，将因此获得的胚胎在SOF培养基中和5％CO2+5％O2+90％N2气氛下培养直至胚泡的阶段。然后，通常在每个受体奶牛中非外科手术地移植两个胚泡，并通过超声波在30-35天测定怀孕。
使植入的奶牛正常地从怀孕直至自然分娩。最终，可以使用chirurgic方法(Caesarea)来分娩。在头48小时给新生儿喂养富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它们都不含动物来源的化合物)。
图6A和6B显示了同时进行的通过亚克隆转基因奶牛获得的两个转基因动物的hGH和IGF-1血清浓度的测量，并将这些分析的结果分别作图于图6C和6D中，使得可以同时观察每个动物的两个量值。由于目前小牛是年轻的，hGH和IGF-1两者的值仍然位于各自的参照范围内，但是预期它们将与从中获得了这两个克隆的转基因奶牛一样升高。
实施例6通过将超排卵的转基因奶牛人工授精来获得转基因小牛该实施例中将公开获得转基因牛的可替换的方法。该方法包括通过激素处理使转基因奶牛超排卵；将所述的奶牛人工授精；收集因此产生的胚胎；将所述胚胎植入代孕奶牛中；并产生怀孕直至动物的出生。以下呈现了该方法的描述。
超排卵在第1天(即，方法开始的那天)的早晨，通过肌内途径将150μg的前列腺素(D(+)-clorprostenol，Arsaprost，Arsa)给药于转基因奶牛。使动物接受每天4kg的含有约15％蛋白质的膳食(在第1天之前，动物已经给予2kg食物，含有相同含量的蛋白质)。在第8天的早晨，阴道内放入黄体酮的CIDR(受控内部药物释放)装置。此外，通过肌内途径给予50mg黄体酮和雌二醇。喂养动物的食物量提高至6kg/天，含有相同含量的蛋白质。然后，在第12、13和14天两次肌内注射FSH和LH(PLUSET，Calier)(一次在早晨，另一次在下午)。接下来的一天(第15天)，通过肌内途径继续给药处理，两次注射PLUSET(一次在早晨，另一次在下午)和两次注射每次150μg前列腺素(相同给药方案)。在第16天的早晨，除去CIDR。整个超排卵期给予的PLUSET总量为350IU。
授精该阶段包括来自供体jersey公牛的精子的三次连续给予(第一次和第二次，各自在第17天的早晨和下午，最后一次，在第18天的早晨)，之前已经获得精子并冰冻保存以保持游动精子的存活力。
收集胚胎并将它们植入代孕奶牛中在第26天的早晨通过用1L DMPBS(Nutricell)冲洗奶牛子宫的两个角来收集胚胎。此后立刻在每个受体奶牛中非外科手术地移植两个胚胎，并通过超声波在30-35天测定怀孕。
使植入的奶牛正常地从怀孕直至自然分娩。最后可以使用chirurgic方法(Caesarea)来分娩。在头48小时给新生儿喂养富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它们都不含动物来源的化合物)。
由于生物后代的产生遵循孟德尔遗传定律，作为上述方法的结果出生的动物的一半是转基因的，这些中的一半是雄性，而另一半是雌性。因此，存在获得转基因雄性(起始动物)的高概率，为了扩大转基因畜群，其精子可以用于建立jersey转基因精子的母种库(MasterBank)，用于超排卵的转基因/非转基因奶牛的授精。
实施例7从奶中纯化重组hGH一旦证实近似分子量、蛋白质印迹的结果和小牛的奶中产生的重组hGH的生物活性是正确的，就进行彻底的纯化过程，因为当制造生物药物产品时，为了避免所述产品中存在可能的污染物，必不可少的是应该将目标蛋白纯化至均一性。该过程包括以下步骤通过离心获得奶的撇渣并将获得的上清液稀释以达到最终保留于酪蛋白胶束中的重组hGH更好的溶解度(澄清)；并使该溶液通过膨胀床阴离子交换色谱柱(该步骤可替换的方案是使用免疫亲和柱，参见以下的实施例8)；使所得到的溶液接受反相HPLC(C4)步骤；然后对富含重组hGH的级分进行阴离子交换色谱。
将纯化的物料脱盐、浓缩并接受分子排阻色谱。为了获得纯的重组hGH，通过分子量来分离。
从奶中纯化人生长激素(hGH)的方法包括以下步骤，依次为(a)澄清(b)膨胀床阴离子交换色谱，(c)反相色谱，(d)阴离子交换色谱，(e)分子排阻色谱(脱盐)，(f)浓缩和(g)分子排阻色谱。
澄清为了获得0.5％的溶液，将新鲜的奶与足量的吐温80混合。加入吐温80后，加入2M的Tris-HCl来获得7.3±0.1的pH。然后，将产物均化30分钟，然后为了分离脂肪层在14000g下离心。之后，将所得到的溶液用0.5％的吐温80稀释直至低于或等于1500μS/cm的传导率。用2M Tris-HCl将pH调节至7.3±0.1，然后将产物通过0.8μm孔的膜过滤并方便地保存。
膨胀床阴离子交换色谱根据以下参数，使用阴离子交换基质将前一步骤所获得的物料进行色谱1.设备A.柱子1)直径5cm2)床高30cm(压实的床)3)基质a)Streamline Q XL(Amersham)b)体积600ml2.溶液和缓冲液A.0.5N NaOHB.20％乙醇
C.缓冲液A20mM Tris.HCl，pH7.3D.缓冲液B500mM Tris.HCl，pH7.3E.缓冲液C20mM Tris.HCl，150mM NaCl，pH7.3F.缓冲液D20mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH7.33.待色谱的物料A.澄清的奶B.样品条件1)体积25±5L2)传导率≤1500μS/cm3)pH7.3±0.1为了平衡柱子，使1.5倍柱体积(“vc”)(900mL)的纯水通过柱子，流速为115±5cm/小时(下行流)。然后，使下列溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速为230±30cm/小时(上行流)3.0vc(1,800ml)的0.5N NaOH；3.0vc(1,800ml)的纯水；1.0vc(600ml)的缓冲液B；和最后，3.0vc(1,800ml)的缓冲液A。
一旦柱子得到了平衡，装载待色谱的物料。所述装载在12±3℃下和以230±30cm/小时的流速进行。此后，以115±15cm/小时的流速和在相同的温度下进行洗脱。首先，使足够量的缓冲液A通过柱子(上行流)，其次使下文中详述的溶液和缓冲液以下列次序通过柱子(下行流)1.5vc(900ml)的缓冲液A；2.0vc(1,200ml)的缓冲液C；和最后，2.0vc(1,200ml)的缓冲液D。
一旦完成该步骤，为了清洗柱子，使以下的溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子1.5vc(900ml)的纯水；1.5vc(900ml)的0.5N NaOH；2.0vc(1,200ml)的纯水；1.0vc(600ml)的缓冲液B；1.5vc(900ml)的纯水；和最后，1.5vc(900ml)的20％乙醇。
测定所选择的含有hGH级分的总蛋白(通过Bradford方法)和目标蛋白(通过RIA)，并保存于2-8℃。
反相色谱根据以下参数将前一步骤所获得的物料进行色谱1.设备A.柱子1)直径4cm2)床高48cm3)基质a.BakerBond Wide-Pore Butyl(C4)15μm prep LC Packing(Baker)b.体积600ml2.溶液和缓冲液A.移动相1(MP1)30mM NaHCO3，pH7.2∶纯水∶乙腈(35∶55∶10)B.移动相2(MP2)30mM NaHCO3，pH7.2∶纯水∶乙腈(20∶10∶70)C.50％甲醇3.待色谱的物料A.从前一步骤得到的所选级分的集合体B.样品条件1)体积30±15L2)pH7.3±0.3为了平衡柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速低于或等于478cm/小时0.3vc(180ml)50％甲醇；此后，运用50％甲醇-MP2的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在1.0vc(600ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；一旦完成梯度，使1.0vc(600ml)的MP2通过柱子；此后，运用MP2-MP1的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在1.0vc(600ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；和最后，使2.0vc(1,200ml)的MP1通过柱子。
一旦柱子得到了平衡，使待色谱的物料通过0.45μm孔的膜过滤，此后立即装载。所述装载在20±5℃和低于或等于238cm/小时的流速下进行。此后，在478±78cm/小时的流速和相同的温度下进行洗脱，使下文中详述的溶液和缓冲液以以下的次序通过柱子1.0vc(600ml)的MP1；MP1-MP2的梯度，从所述溶液65∶35的比例开始直至达到在18.0vc(9,000ml)的总体积中所述溶液45∶55的比例；1.0vc(600ml)45∶55比例的MP1-MP2；和最后，2.0vc(1,200ml)的MP2。
一旦完成该步骤，为了清洗柱子，运用MP2-50％甲醇的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在1.0vc(600ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；和最后，使2.0vc(1,200ml)的50％甲醇通过柱子。
通过SDS-PAGE测定该色谱所得到的级分，均质性为20％且对于氧化的hGH，根据结果，进行选择。此后，测定所选择的含有hGH级分的总蛋白(通过Bradford方法)，并保存于2-8℃。
阴离子交换色谱使用阴离子交换基质将前一步骤所获得的物料进行色谱，如下1.设备A.柱子1)直径5cm2)床高25cm3)基质a.Source 30Q(Pharmacia)b.体积500ml2.溶液和缓冲液A.20％乙醇B.溶液K0.5N NaOH，3M NaClC.溶液L50mM Tris，pH 7.50D.溶液M0.1N HCl，3M NaClE.移动相3(MP3)溶液L∶乙腈(70∶30)
F.移动相4(MP4)50mM Tris，0.1M NaCl，pH7.50∶乙腈(70∶30)3.待色谱的物料A.从前一步骤获得的所选级分B.样品条件1)体积4.5±1L2)pH7.2±0.2为了平衡和清洁柱子，使以下的溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速低于或等于183±20cm/小时1.0vc(500ml)纯水；1.0vc(500ml)的溶液K；1.0vc(500ml)的溶液L；和最后，1.0vc(500mL)的MP3。
一旦柱子得到了平衡，装载待色谱的物料。所述装载在20±5℃和低于或等于183cm/小时的流速下进行。此后，在183±20cm/小时的流速和相同的温度下进行洗脱，使下文中详述的溶液和缓冲液以以下的次序通过柱子1.0vc(500ml)的MP3；MP3-MP4的梯度，从所述溶液15∶85的比例开始直至达到在5.0vc(2500ml)的总体积中所述溶液25∶75的比例；和最后，使2.0vc(1000ml)的MP4通过柱子。
一旦完成该步骤，为了清洗柱子，将以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子MP4-纯水的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在0.5vc(250ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；0.5vc(250ml)的纯水；纯水-溶液K的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至所述达到在0.5vc(250ml)的总体积中溶液0∶100的比例；1.0vc(500ml)的溶液K；溶液K-纯水的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在0.5vc(250ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；0.5vc(250ml)的纯水；纯水-溶液M的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在0.5vc(250ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；1.0vc(500ml)的溶液M；溶液M-纯水的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在0.5vc(250ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；1.0vc(500ml)的纯水；纯水-溶液L的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在0.5vc(250ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；0.5vc(250ml)的溶液L；溶液L-纯水的梯度，从所述溶液100∶0的比例开始直至达到在0.5vc(250ml)的总体积中所述溶液0∶100的比例；和最后，1.5vc(750ml)的纯水。
测定所选的含有hGH级分的总蛋白(通过Bradford方法)，并保存于2-8℃。
分子排阻色谱使用分子排阻基质将前一步骤所获得的物料进行色谱，如下1.设备A.柱子1)直径5cm2)床高25cm3)基质a.Cellufine GH25(Millipore)b.体积500ml2.溶液和缓冲液A.0.5N NaOHB.20％乙醇C.缓冲液C150mM NaH2PO4，pH7.2D.缓冲液G320mM甘氨酸，10mM NaH2PO4，0.1％吐温80，pH6.93.待色谱的物料A.从前一步骤得到的所选级分B.样品条件1)体积0.5±0.2L2)pH7.5±0.5为了平衡和清洁柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速低于或等于180cm/小时1.0vc(500ml)的纯水；1.0vc(500mL)的0.5N NaOH；0.5vc(250ml)的纯水0.5vc(250ml)的缓冲液C；和最后，2.0vc(1000ml)的缓冲液G。
一旦柱子得到了平衡，装载待色谱的物料。所述装载在20±5℃和183±20cm/小时的流速下进行。此后，在相同流速和温度下进行洗脱，并使1.0vc(500ml)的缓冲液G通过柱子，运行所需进行的次数。
一旦完成该步骤，为了清洗柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子0.5vc(250ml)的纯水；1.0vc(500ml)的0.5N NaOH；0.5vc(250ml)的纯水；0.5vc(250ml)的缓冲液C；0.5vc(250ml)的纯水；和最后，1.5vc(750ml)的20％乙醇。
测定所选的含有hGH级分的总蛋白(通过Bradford方法)，并保存于2-8℃。
浓缩根据以下所述的条件将前一实施例中所得到的级分浓缩1.设备A.蠕动泵Watson Marlow-Cat.No.302SB.管道Watson Marlow-Cat.No.902.0080.016C.浓缩器Prep Scale Millipore-Cat.No.CDU F006LC2.溶液和缓冲液A.0.28％的十二烷基硫酸钠(SDS)B.0.06％的TritonC.0.125N NaOHD.缓冲液G320mM甘氨酸，10mM的NaH2PO4，0.1％的吐温80，pH6.93.待处理的物料A.从前一实施例获得的所选级分B.样品条件1)体积1.0±0.5L2)传导率1200±100μS/cm3)pH6.9±0.1首先清洗、清洁和平衡设备，并使以下次序的溶液和缓冲液流过设备2L的0.125N NaOH；10L的纯水；和最后，2L的缓冲液G。然后准备好设备以便用于按照通常的方法，浓缩所选的级分。进行浓缩程序直至达到15mg/ml的蛋白浓度(通过Bradford方法测得)。
使所选的级分通过0.22μm孔的膜过滤，测定总蛋白(通过Bradford方法)，并保存于4℃。
所选级分的传导率和pH分别为1,100-1,300μS/cm和6.9±0.1。
分子排阻色谱使用分子排阻基质将前一步骤所得到的物料进行色谱，如下1.设备A.柱子1)直径5cm2)床高92cm3)基质a.Sephacryl S-200 High Resolution(Amersham Pharmacia)b.体积1,800ml2.溶液和缓冲液A.0.5N NaOHB.20％乙醇C.缓冲液H320mM甘氨酸，2.2mM NaH2PO4，1.8mM Na2HPO4，pH7.303.待色谱的物料A.从前一步骤所选的，浓缩的级分B.样品条件1)体积40±20ml2)传导率1,200±100μS/cm3)pH7.3±0.1为了平衡和清洁柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速低于46cm/小时1.0vc(1,800ml)的纯水；1.0vc(1,800ml)的0.5N NaOH；和最后，2.0vc(3,600ml)的缓冲液H。
一旦柱子得到了平衡，装载待色谱的物料。所述装载在20±5℃和46±15cm/小时的流速下进行。此后，在相同流速和温度下进行洗脱，并使1.0vc(1,800ml)的缓冲液H通过柱子，运行所需进行的次数。
一旦完成该步骤，为了清洗柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子1.0vc(1,800ml)的纯水；和1.5vc(2,700ml)的20％乙醇。
将含有纯hGH的级分通过0.22μm孔的膜无菌过滤至无菌的、去热原的塑料瓶中，测定总蛋白，并保存于-20℃。
实施例8从奶中纯化hGH的可替换的方法替代之前所述的纯化方法，为了纯化奶中所含有的重组hGH，可以使用可替换的方案。实施例7中所述方法和该实施例中所呈现的可替换方法之间的主要差异在于前者的第二个步骤包括膨胀床阴离子交换色谱，而后者相应的步骤需要免疫亲和色谱。两种方法的澄清步骤也略有差别。因为两个纯化方案的其余部分是相同的，以下只描述可替换方法的头两个步骤。
澄清为了获得0.5％的溶液，将新鲜的奶与足量的吐温80混合。加入吐温80后，加入1M的Tris来获得7.3±0.3的pH。此后，将产物均化30分钟，然后为了分离脂肪层在14000g下离心。之后，用缓冲液S(50mM Tris.HCl，500mM NaCl，0.5％吐温80，pH7.3)将所得到的溶液稀释20倍，然后将产物通过0.45μm孔的膜过滤并方便地保存。
免疫亲和色谱根据以下参数使用免疫亲和相互作用基质(Affigel 10 EsterAgarose，BioRad制造，共价连接的抗-GH单克隆抗体，Bio Sidus制造)将前一步骤所获得的物料进行色谱1.设备A.柱子1)直径30cm2)床高15cm3)基质a)Affigel 10 Ester Agarose(BioRad)，共价连接的抗-GH单克隆抗体(Bio Sidus)b)体积10L2.溶液和缓冲液A.缓冲液A20mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH7.2B.缓冲液B100mM柠檬酸，pH3.0C.缓冲液C150mM NaH2PO4，pH7.2D.缓冲液D50mM Tris.HCl，500mM NaCl，500mM胍.HCl，pH7.2E.缓冲液E50mM Tris.HCl，500mM NaCl，pH7.2，0.2％叠氮化钠，0.1g/L庆大霉素3.待色谱的物料A.澄清的奶B.样品条件1)体积30-50L2)传导率45±15mS/cm3)pH7.3±0.3为了平衡和清洁柱子，如果在最近七天中没有使用过，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速低于51cm/小时1.0柱体积(“vc”)(10L)的缓冲液A；2.0vc(20L)的缓冲液D；2.0vc(20L)的缓冲液A；1.0vc(10L)的缓冲液B；2.0vc(20L)的缓冲液C；和最后，1.0vc(10L)的缓冲液A。
另一方面，如果在最近七天中已经用过柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子，流速低于51cm/小时1.0vc(10L)的缓冲液C；和最后，2.0vc(20L)的缓冲液A。
一旦柱子得到平衡，装载待色谱的物料。所述装载在5±3℃和低于51cm/小时的流速下进行。此后，在42±9cm/小时的流速和相同的温度下进行洗脱。将下文中详述的溶液和缓冲液以以下的次序通过柱子2.0vc(20L)的缓冲液A；和1.5vc(15L)的缓冲液B。
一旦完成该步骤，为了清洗柱子，使以下溶液或缓冲液以下文中详述的量按次序通过柱子2.0vc(20L)的缓冲液D；2.0vc(20L)的缓冲液A；和最后，2.0vc(20L)的缓冲液E。
测定所选的含有hGH级分的总蛋白(通过Bradford方法)和目标蛋白(通过RIA)，并保存于4℃。
实施例9纯的重组hGH的质量控制对两批纯的重组hGH进行一系列的测定来证实该产物与天然hGH没有差别。这样的方法包括，但不限于，SDS/PAGE、蛋白质印迹、体外(细胞nb2)和体内(切除垂体的大鼠)的生物活性、肽图谱、完整氨基酸序列的测定、等电聚焦(IEF)，以及反相和大小排阻HPLC分析。对于重组的和天然的hGH，所有那些测定中所获得的结果完全相同，其证明了纯的重组hGH完全对应于天然hGH，因此适用于制造生物药物产品。
现在已经充分地描述了本发明，本领域普通技术人员将理解可以在宽和相等范围的条件、配制和其它参数下进行相同的发明而不会影响本发明或其任何实施方案的范围。在此所引用的所有专利和出版物在此以其整体全部引入作为参考。
序列表<110>Sterrenbeld Biotechnologie NorthMelo，Carlos AlbertoBaranao，Lino<120>在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物的制造方法以及因此所产生的转基因哺乳动物<130>1909.011PC02<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物PB1<400>1tctactcgag gatcatctat ctgtcccaaa g31<210>2<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物PB2<400>2ctaggatcca atgatctgat tttgtgg 27<210>3<211>28<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物PB4<400>3ctaggatcca tggctacagg taagcgcc28<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物GHTE<400>4atgctgtgtc tggacgtcct 20
权利要求
1.一种质粒，包含可操作地连接于β酪蛋白启动子和β内酰胺酶基因的编码目标蛋白的基因。
2.权利要求1的质粒，其中所述目标蛋白是生长激素。
3.权利要求2的质粒，其中所述生长激素是哺乳动物生长激素。
4.权利要求3的质粒，其中所述哺乳动物生长激素是人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、绵羊生长激素、山羊生长激素或啮齿动物生长激素。
5.权利要求4的质粒，其中所述哺乳动物生长激素是人生长激素。
6.权利要求5的质粒，是pRβhGH。
7.权利要求6的质粒，进一步包括新霉素抗性基因。
8.权利要求7的质粒，是pRNeo。
9.权利要求8的质粒，进一步包含可操作地连接于巨细胞病毒(CMV)启动子的编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。
10.权利要求9的质粒，是pRNeoGreen。
11.权利要求5的质粒，其中β酪蛋白启动子包含1230bp的全长β酪蛋白启动子和49bp的β酪蛋白基因的第一个非编码外显子。
12.权利要求11的质粒，进一步包含新霉素抗性基因。
13.权利要求12的质粒，是pVEβcashGH。
14.根据权利要求8的质粒的线性片段，其中通过用ApaLI消化切除所述的β内酰胺酶基因。
15.根据权利要求10的质粒的线性片段，其中通过用ApaLI消化切除所述的β内酰胺酶基因。
16.根据权利要求13的质粒的线性片段，其中通过用ApaLI消化切除所述的β内酰胺酶基因。
17.质粒pRβhGH。
18.质粒pRNeo。
19.质粒pRNeoGreen。
20.将根据权利要求1至19的遗传构建体转染至哺乳动物细胞中的方法，包括用于脂质体应用的阳离子脂质的组合。
21.在其奶中产生重组生长激素的非人转基因哺乳动物。
22.权利要求21的非人转基因哺乳动物，其中所述的哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物种、山羊物种或啮齿动物物种。
23.权利要求22的非人转基因哺乳动物，其中所述的哺乳动物属于牛物种。
24.权利要求21的非人转基因哺乳动物，其中所述的生长激素是哺乳动物生长激素。
25.权利要求24的非人转基因哺乳动物，其中所述的哺乳动物生长激素是人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、绵羊生长激素、山羊生长激素或啮齿动物生长激素。
26.权利要求25的非人转基因哺乳动物，其中所述的哺乳动物生长激素是人生长激素。
27.权利要求26的非人转基因哺乳动物，其中以高于约1.0g hGH/L奶的水平产生所述的人生长激素。
28.权利要求27的非人转基因哺乳动物，其中以高于约2.0g hGH/L奶的水平产生所述的人生长激素。
29.权利要求28的非人转基因哺乳动物，其中以高于约3.0g hGH/L奶的水平产生所述的人生长激素。
30.权利要求29的非人转基因哺乳动物，其中以高于约4.0g hGH/L奶的水平产生所述的人生长激素。
31.权利要求30的非人转基因哺乳动物，其中以高于约5.0g hGH/L奶的水平产生所述的人生长激素。
32.权利要求31的非人转基因哺乳动物，其中以高于约6.0g hGH/L奶的水平产生所述的人生长激素。
33.权利要求21的非人转基因哺乳动物，其中通过所述哺乳动物所述重组生长激素的产生刺激了所述哺乳动物产生更多的包含所述生长激素的奶。
34.权利要求21的非人转基因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，其中所述的质粒包含可操作地连接于启动子的生长激素基因，该启动子指导所述基因在所述哺乳动物的乳房细胞中的表达。
35.权利要求34的非人转基因哺乳动物，其中所述哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物种、山羊物种或啮齿动物物种。
36.权利要求35的非人转基因哺乳动物，其中所述的哺乳动物属于牛物种。
37.权利要求34的非人转基因哺乳动物，其中所述的生长激素基因是人生长激素基因、牛生长激素基因、猪生长激素基因、绵羊生长激素基因、山羊生长激素基因或啮齿动物生长激素基因。
38.权利要求37的非人转基因哺乳动物，其中所述的生长激素基因是人生长激素基因。
39.权利要求38的非人转基因哺乳动物，其中启动子是β酪蛋白启动子。
40.权利要求39的非人转基因哺乳动物，其中质粒是pRβhGH。
41.权利要求40的非人转基因哺乳动物，其中所述的质粒进一步包含新霉素抗性基因。
42.权利要求41的非人转基因哺乳动物，其中所述质粒是pRNeo。
43.权利要求34的非人转基因哺乳动物，其中通过所述哺乳动物所述重组生长激素的产生刺激了所述哺乳动物产生更多的包含所述生长激素的奶。
44.在其奶中产生重组人生长激素的牛物种的非人转基因哺乳动物，其基因组包含整合的质粒，其中所述质粒包含人生长激素基因和指导所述基因在所述哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。
45.权利要求44的非人转基因哺乳动物，其中所述质粒是pRβhGH。
46.权利要求45的非人转基因哺乳动物，其中所述的质粒进一步包含新霉素抗性基因。
47.权利要求46的非人转基因哺乳动物，其中所述质粒是pRNeo。
48.权利要求44的非人转基因哺乳动物，其中在所述哺乳动物的体细胞和生殖细胞中发现了所述的整合质粒。
49.权利要求44的非人转基因哺乳动物，其中通过所述哺乳动物重组生长激素的产生刺激了所述哺乳动物产生更多的包含所述生长激素的奶。
50.制造非人转基因哺乳动物的方法，包括a)获得编码生长激素的基因；b)将所述基因克隆进质粒中，借此将所述基因可操作地连接至指导所述基因在乳房细胞中表达的启动子，得到表达质粒；c)用所述表达质粒转染体细胞，使得所述质粒掺入到所述细胞的基因组中，得到转基因体细胞；d)将成熟卵母细胞去核，得到去核的卵母细胞；e)将一个所述的转基因体细胞与所述的去核卵母细胞融合，得到单细胞胚胎；f)将所述胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和g)监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
51.权利要求50的方法，其中所述的启动子是β酪蛋白启动子，而其中所述的生长激素是人生长激素。
52.权利要求51的方法，其中表达质粒是pRβhGH。
53.权利要求52的方法，其中所述表达质粒进一步包含新霉素抗性基因。
54.权利要求53的方法，其中所述表达质粒是pRNeo。
55.权利要求50的方法，其中所述哺乳动物是在其奶中产生重组人生长激素的牛，其基因组包含整合的质粒，其中所述质粒包含人生长激素基因和指导所述基因在所述哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。
56.权利要求55的方法，其中所述质粒是pRβhGH。
57.权利要求56的方法，其中所述质粒进一步包含新霉素抗性基因。
58.权利要求57的方法，其中所述质粒是pRNeo。
59.权利要求50的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。
60.权利要求50的方法，其中经从在其奶中产生所述重组生长激素的转基因雌性中分离来获得所述的转基因体细胞。
61.权利要求60的方法，其中所述的转基因体细胞是成纤维细胞。
62.制造非人转基因哺乳动物的方法，包括a)使在其奶中产生重组生长激素的转基因雌性非人哺乳动物超排卵；b)将所述哺乳动物与从雄性非人非转基因哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎；c)收集所述胚胎；d)将所述胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和e)监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
63.制造非人转基因哺乳动物的方法，包括a)使在其奶中产生重组生长激素的转基因雌性非人哺乳动物超排卵；b)将所述哺乳动物与从产生所述重组生长激素的转基因雄性非人哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎；c)收集所述胚胎；d)将所述胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和e)监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
64.制造非人转基因哺乳动物的方法，包括a)使雌性非人非转基因哺乳动物超排卵；b)将所述哺乳动物与从产生重组生长激素的转基因雄性非人哺乳动物获得的精子人工授精来产生胚胎；c)收集所述胚胎；d)将所述胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和e)监控怀孕直至转基因哺乳动物的出生。
65.权利要求50、60、62、63或64任一项的方法，其中所述哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物种、山羊物种或啮齿动物物种。
66.权利要求65的方法，其中所述哺乳动物属于牛物种。
67.权利要求50、60、62、63或64任一项的方法，其中所述生长激素是哺乳动物生长激素。
68.权利要求67的方法，其中所述的哺乳动物生长激素是人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、绵羊生长激素、山羊生长激素或啮齿动物生长激素。
69.权利要求68的方法，其中所述哺乳动物生长激素是人生长激素。
70.权利要求69的方法，其中所述哺乳动物以高于约1.0g hGH/L奶的水平产生人生长激素。
71.权利要求70的方法，其中所述哺乳动物以高于约2.0g hGH/L奶的水平产生人生长激素。
72.权利要求71的方法，其中所述哺乳动物以高于约3.0g hGH/L奶的水平产生人生长激素。
73.权利要求72的方法，其中所述哺乳动物以高于约4.0g hGH/L奶的水平产生人生长激素。
74.权利要求73的方法，其中所述哺乳动物以高于约5.0g hGH/L奶的水平产生人生长激素。
75.权利要求74的方法，其中所述哺乳动物以高于约6.0g hGH/L奶的水平产生人生长激素。
76.权利要求50、60、62、63或64任一项的方法，其中通过所述哺乳动物所述重组生长激素的产生刺激了所述哺乳动物产生更多的包含所述生长激素的奶。
77.权利要求50、60、62、63或64任一项的方法，其中在所述哺乳动物的体细胞和生殖细胞中发现了编码所述重组生长激素的基因，该基因可操作地连接至指导所述基因在乳房细胞中表达的启动子。
全文摘要
本发明涉及生产目标蛋白的方法，包括制造在其奶中产生所述蛋白的非人转基因哺乳动物，从非人转基因哺乳动物获得所述奶，并从奶中纯化所述目标蛋白。方便地克隆产生了转基因牛动物，其能够在乳腺中产生人生长激素。该方法包括在表达载体中方便地克隆编码hGH基因和β酪蛋白启动子的遗传构建体。还包括胎牛体细胞，通常是成纤维细胞的转染过程，并核移植进去核的牛卵母细胞，因此产生转基因胚胎。该方法还包括产生转基因胚胎的其它过程用于进一步扩大转基因畜群，如亚克隆转基因雌性牛，使转基因奶牛超排卵并与来自非转基因或转基因雄性牛的精子授精，以及使非转基因奶牛超排卵并与来自转基因雄性牛的精子授精。然后，转基因胚胎产生在其奶中大量产生人生长激素的转基因牛，从奶中完全纯化激素并分析以满足制造纯的生物药物产品的所有要求。
文档编号A01K67/027GK1930287SQ200480031569
公开日2007年3月14日 申请日期2004年9月29日 优先权日2003年9月30日
发明者C·A·梅洛, L·巴拉瑙 申请人:斯特林贝尔德生物技术北美公司