专利名称：用于繁殖神经祖细胞的组合物和方法
技术领域：
本发明大体上涉及多能干细胞与神经祖细胞的繁殖和用途。本发明提供用于干细胞与神经祖细胞分离、制备、生长、冷冻保存、分化和移植的组合物和方法。所述干细胞和神经祖细胞可用于治疗、诊断和研究目的。
背景技术：
中枢神经系统(CNS)疾病包括许多和多种病症，诸如神经变性疾病(例如阿兹海默氏(Alzheimer’s)症和帕金森氏(Parkinson’s)症)、急性脑损伤(例如中风、头部外伤、大脑麻痹)和神经功能障碍(例如抑郁、癫痫、精神分裂症)。随着老年群体的增大，神经变性疾病成为日益重要的关注点，原因在于许多这些疾病的风险性会随年龄增加。这些包括阿兹海默氏症(AD)、多发性硬化(MS)、亨庭顿氏(Huntington’s)症(HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)和帕金森氏症(PD)在内的神经变性疾病与经鉴定的CNS位置处的神经细胞变性有关，从而导致这些细胞或相关脑区域无法行使其预期功能。
通过施予医药化合物治疗CNS病症具有若干缺点，包括能够穿过脑血屏障的药物范围有限和在接受长期治疗患者中形成的耐药性。例如，接受左旋多巴(levodopa或L-dopa，一种能够穿过脑血屏障的多巴胺前体)治疗的帕金森氏症患者会对左旋多巴作用产生耐药性，且需要用逐渐增加的剂量来维持其作用。此外，存在许多与左旋多巴有关的副作用，诸如增多的且不可控制的运动。
在美国有超过1,500,000人患有帕金森氏症(PD)。用于PD的药物治疗无法起效后，患者仅能求助于手术干预。目前的干预集中在遏制PD症状，但迫切需要尝试逆转该疾病的损伤。此种恢复有可能通过移植神经祖细胞来实现。
曾利用移植胎儿神经组织来治疗诸如帕金森氏症等神经疾病。胎儿神经移植物可避开对长期药物施予的需要，且还可用于经设计可用来避开脑血屏障的药物递送系统。然而，用于移植的细胞会在宿主接受者体内诱发免疫反应。此外，所述细胞必须处于其能够与邻近细胞形成正常神经连接的发育阶段。
移植也可为脱髓鞘病(诸如多发性硬化(MS))提供治疗方法。在人类脱髓鞘病和啮齿类模型二者中，有大量证据表明脱髓鞘神经元能够在活体内再髓鞘化。例如在MS中，似乎常常存在脱髓鞘和再髓鞘化循环。外源施用的细胞曾显示能够在众多实验条件下使脱髓鞘轴突再髓鞘化(参见Freidman等人，Brain Research，378142-146，1986；Raine等人，Laboratory Investigation 59467-476，1988)。已使用以下各物获得了成功由脊髓制备的经离解神经胶质细胞悬浮液(Duncan等人，J.Neurocytology，17351-360(1988)；由坐骨神经制备的Schwann细胞培养物(Bunge等人，1992，WO 92/03536；Blakemore和Crang，J.Neurol.Sci.，70207-223，1985)；来自经离解脑组织的培养物(Blakemore和Crang，Dev.Neurosci.101-11，1988)；少突细胞前体细胞(Gumpel等人，Dev.Neurosci.11132-139，1989)；O-2A细胞(Wolswijk等人，Development 109691-608，1990；Raff等人，Nature 3030390至396，1983；Hardy等人，Development 1111061-1080，1991)；和永生化的O-2A细胞系(Almazan和McKay，Brain Res.579234-245，1992)。
O-2A细胞是在活体外仅生成少突细胞和II型星形细胞的神经胶质细胞祖细胞。在活体内对O-2A表型呈免疫阳性的细胞已显示可成功地在活体内再髓鞘化脱髓鞘神经元(Godfraind等人，J.Cell Biol，1092405-2416，1989)。需要注射大量O-2A细胞方可在活体内充分再髓鞘化所有靶标神经元。尽管可使O-2A祖细胞在培养物中生长，但其仅能进行有限次数的分裂(Raff Science 2431450至1455，1989)。此外，分离技术采用低产率来源(视神经)并需要多个纯化步骤。
业已开发了多种神经移植方法来改善神经疾病，包括植入来自成人PNS的神经元以产生多巴胺(Notter等人，Cell Tissue Research 24469-76，1986)；将分离自成年大鼠松果体和肾上腺髓质的含单胺细胞移植入大鼠额皮质以缓解习得性无助感(一种抑郁症形式)(美国专利第4,980,174号)；将嗜铬细胞和肾上腺髓质植入大鼠脑干或脊髓以在诱发经植入组织或细胞释放儿茶酚胺时产生痛觉缺失(美国专利第4,753,635号)。然而，将肾上腺细胞植入CNS时不会获得正常神经表型，且因此限制了移植物在必须形成突触连接之处的使用。
另一种神经移植方法涉及使用基因改造细胞。使用此方法将外源基因或转基因引入细胞以使细胞表达所述基因。将经改造而含有转化基因的细胞移植到神经变性部位，并提供诸如神经递质和生长因子等产物(Rosenberg等人，Science2421575-1578，1988)，所述产物可起到缓解某些变性症状的作用。曾将基因改造细胞用于神经组织植入以替换受损细胞。例如，曾使用含有酪氨酸羟化酶(能够使成纤维细胞产生多巴胺)cDNA的逆转录病毒载体对成纤维细胞实施基因改造，并植入帕金森氏症动物模型中(美国专利第5,082,670号)。然而，使用普遍采用的细胞系存在诱发免疫反应的风险，且这些细胞在宿主组织内不会实现正常神经连接。
尽管曾尝试繁殖用于神经移植和药物筛选的神经祖细胞，但这些努力的成功率很有限。Neurobasal培养基可使经培养的神经祖细胞具有短倍增时间，但观察到这些倍增时间约为1个月，此段时间后所述细胞会分化并丧失其祖细胞表型。通常，即使用最佳培养条件，神经祖细胞在培养物中也仅存活约10代。此外，冷冻保存时仅有约1至2％的神经祖细胞存活。此外，目前在活体外保持神经祖细胞的研究工作需要使用饲养层及/或引入动物组份。即使使用饲养层，神经祖细胞也仅会保持约6个月。对于临床应用，需要获得并保持不含动物组份且不需要使用饲养层的人类神经祖细胞。
尚需要大量未分化的神经祖细胞与多能干细胞以供移植和药物筛选使用，特别需要人类祖细胞和干细胞。还存在对能够在活体外长期增殖并能够进行受控分化及/或基因改造的神经祖细胞的需求。特定而言，需要能够长时间保持和繁殖神经祖细胞的方法和可最优化冷冻保存后产率的方法。
发明内容
本发明提供用于培养、繁殖、冷冻保存和操作神经祖细胞(NPC)与多能干细胞的组合物和方法。本发明提供一种培养基，其中所述培养基的钙浓度不高于0.15mM，且在一些实施例中，不高于约0.06mM。在一些实施例中，所述培养基的钙浓度自约0.05mM至0.15mM。所述培养基进一步包含约20ng/ml(视情况，自约20至约100ng/ml)的表皮生长因子(EGF)、约10ng/ml(视情况，自约10至约50ng/ml)的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、和约10ng/ml(视情况，自约10至约150ng/ml)的转化生长因子-α(TGFα)且视情况包含约7至约30ng/ml的白血病抑制因子(LIF)。本发明还提供一种含有悬浮于所述培养基中的NPC的细胞培养物。所述细胞培养物可于不存在饲养层且不存在源自非人类动物来源的产物的情况下成功保持。
在一实施例中，所述细胞培养物进一步包含约0.03至约0.09mM的氯化钙，其中使所述培养基在不含钙的最低必需培养基中达到全体积且具有低于0.1mM的总钙浓度。在另一实施例中，总钙浓度为约0.05至0.06mM。对于冷冻保存，所述低钙培养基补充有B27(通常约2％)和二甲亚砜(DMSO通常约10％)，且在扩增培养基中使用营养因子。根据本发明冷冻保存的NPC展现出高于50％的存活率。在一实施例中，冷冻-解冻后的存活率高于75％。曾观察到超过90％的冷冻保存后存活率，其中用本发明培养基冷冻保存的NPC通常具有高于95％的存活率。
较佳地，所述培养基不含血清且不含非人类动物产物。所述培养基可进一步包含2％B27补充物。通常，生长因子EGF、bFGF、LIF和TGFα是重组生长因子，且NPC和生长因子来自人类。
在一实施例中，NPC来源于胎儿前脑。根据本发明培养的NPC具有少于12天，通常为约5天的倍增速率。NPC可在活体外持续增殖至少1年。曾观察到本发明NPC可持续增殖2.5年以上且在超过250代后仍可增殖。
本发明进一步提供一种繁殖神经祖细胞的方法，该方法包括在本发明培养基中培养原代人类胎儿脑组织。本发明额外提供一种冷冻保存NPC和最优化解冻时NPC存活率的方法。本发明还提供一种向宿主体内移植人类NPC的方法。在一实施例中，在移植之前将L-谷氨酰胺和白血病抑制因子(LIF)加入所述培养基中以使神经元生长超过神经胶质。在另一实施例中，将所述细胞培养物移植到宿主体内的多个部位。在又一实施例中，对NPC进行基因改造以在移植之前表达一治疗剂。
本发明额外提供一种繁殖多能干细胞(PSC)的方法。所述方法包括在本发明培养基中培养原代人类胎儿前脑组织。可监测培养物中Oct4的表达，Oct4是一种干细胞标记物，曾显示Oct4的表达会在由本发明方法培养数月时间的细胞中普遍增加。
图1是显示培养在补充有(“E+”)EGF(E)、bFGF(F)、TGFα(T)和LIF(L)各种组合的低钙(0.06mM)EMEM中的NPC生长的图示。E+EFT提供NPC在悬浮液中的最佳生长。
图2是显示培养在补充有(N+)EGF(E)、bFGF(F)、TGFα(T)和LIF(L)各种组合的NeurobasalTM培养基中的NPC生长的图示。N+EFT提供附着细胞的最佳生长。然而，在活体外培养3至4个月后生长速率逐渐降低。
图3是显示T和M脑祖细胞系免疫组织化学特征的显微照片。138代后在M5系细胞中观察到强BrDU阳性反应。20×放大率。
图4是显示M5 NPC细胞汇合生长的相差显微照片。几乎所有细胞保持未分化状态。10×放大率。
图5是显示脑祖细胞形成且是干细胞/祖细胞特征所在的典型“胚状体”的相差显微照片。10×放大率。
图6是显示来自以小漂浮细胞簇形式生长的第5代T5系脑祖细胞的相差显微照片。10×放大率。
图7是显示NPC的小漂浮细胞簇和因培养基Ca++浓度由0.05mMol增加到0.1mMol而正附着至培养瓶的众多NPC细胞的相差显微照片。10×放大率。
图8是显示来自T5系的生长成胚状体的NPC的相差显微照片。第154代。10×放大率。
图9是显示来自M5系的NPC的扁平细胞簇的显微照片。培养基的Ca++浓度为0.1mMol。所述细胞的46％呈BrDU-阳性。20×放大率。
图10是显示来自T5系的细胞的大漂浮细胞簇的显微照片，在其中央具有有丝分裂图像。姬姆萨染色(Giemsa stain)。40×放大率。
图11是显示受6-OHDA损伤的大鼠纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)阳性NPC的显微照片。20×放大率。
图12是显示来自T5系的未分化NPC超微结构的电子显微照片。13,000×放大率。
图13是显示来自M5系的NPC超微结构的电子显微照片。其胞质中含有多个线粒体。13,000×放大率。
图14是显示M5系悬浮液中呈溴脱氧尿嘧啶核苷(BrDU)免疫阳性的NPC的显微照片。免疫反应性细胞用二氨基联苯胺(DAB)染色。40×放大率。
图15是显示M3单细胞悬浮液中呈溴脱氧尿嘧啶核苷(BrDU)免疫阳性的NPC的显微照片。免疫反应性细胞用荧光素标记。20×放大率。
图16是显示M3单细胞悬浮液中呈巢蛋白免疫阳性的NPC的显微照片。免疫反应性细胞用荧光素标记。20×放大率。
图17是显示巢蛋白和Oct-4在相同NPC中共表达的显微照片，绿色荧光代表Oct-4而红色荧光代表巢蛋白。20×。
图18是显示大鼠脑核中具有分支延伸的琥珀褐色人类神经元(图片中央)和神经胶质细胞(图片右下角)的显微照片。这些细胞由在脑室内注射500,000个未分化神经祖细胞4个月后显示其旋转行为有70％改善的动物的脑室迁移而来。抗人类线粒体抗体。40×。
具体实施例方式
本发明基于对经最优化可用于长期生长人类神经祖细胞(NPC)和成功冷冻保存NPC的培养基的发现。根据本发明培养的NPC能够在活体外存活1年以上，且可存活长达3年。根据本发明实施的NPC冷冻保存可使解冻时存活率超过95％。此外，本发明提供可使对经培养NPC的操作在需要时达成附着和分化的培养基变化。已成功地将根据本发明培养的NPC移植入脑内，使帕金森氏症动物模型的结构和功能得到恢复。此外，用于繁殖NPC的相同培养条件也已显示能够培养表达干细胞标记物Oct4的多能干细胞(PSC)。
定义除非另有说明，否则用于本申请案的所有科学和技术术语均具有业内通常使用的含义。如本申请案中所用，下列词语或短语具有所指定的含义。
本文所用“低钙”培养基指钙低于0.15mM(终浓度)，且通常为约0.03至0.09mM。低钙培养基并不包括无钙培养基。“高钙”培养基指钙高于0.15mM。
本文所用“神经祖细胞”(NPC)指对巢蛋白呈免疫阳性、能够在悬浮液培养物中持续生长且当暴露于适宜条件中时可分化成神经元或神经胶质细胞的细胞。如本文所提及的神经祖细胞能够在活体外存活至少2至3年。
本文所用“多能干细胞”(PSC)指对干细胞标记物Oct4呈免疫阳性的细胞。
本文所用“基因改造的”指已通过天然或重组方法加以操作而含有转基因的细胞。例如，可通过引入能够编码期望多肽的核酸分子来对NPC或其后代进行基因改造。
本文所用“转基因”意指被插入细胞中并编码对应于一蛋白质氨基酸序列的DNA。通常，经编码蛋白质能够对CNS细胞起到治疗或调节作用。
本文所用“蛋白质”或“多肽”包括蛋白质、蛋白质功能片段和肽，不管其是分离自天然来源还是通过重组技术产生或以化学方式合成。本发明多肽通常含有至少约6个氨基酸，且长度足以起到生物学或治疗作用。
本文所用“载体”意指一构造，该构造能够递送且较佳可在宿主细胞中表达一或多个受关注的基因或序列。载体实例包括但不限于病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、密封于脂质体中的DNA或RNA表现载体和某些真核细胞，诸如生产细胞。
本文所用“表达控制序列”意指可指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子(诸如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达控制序列可以可操作方式连至拟转录的核酸序列上。
术语“核酸”或“多核苷酸”指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另加限制，否则其涵盖可以类似于天然存在的核苷酸的方式杂交核酸的天然核苷酸的已知类似物。
本文所用“医药上可接受的载剂”包括当与活性成份组合时可使该成份保留生物活性且不会与受试者免疫系统发生反应的任一物质。实例包括但不限于任一标准医药载剂，诸如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液(诸如油/水乳液)以及各种类型的润湿剂。用于气溶胶或非经肠施予的较佳稀释剂是磷酸缓冲盐溶液或生理(0.9％)盐水。
通过业内熟知的常规方法调配含有此等载剂的组合物(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编辑，Mack Publishing公司，Easton，PA，1990)。
除非另外明确说明，否则本文所用“一”或“一个”表示至少一个。
神经祖细胞本发明提供可在培养物中无限保持、染色时呈溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和巢蛋白阳性且具有多能性的神经祖细胞(NPC)。本发明NPC能够形成神经元(例如，MAP2，神经元特异性烯醇化酶或神经丝阳性细胞)和神经胶质细胞(例如，GFAP或半乳糖脑苷脂阳性细胞)。本发明NPC可在细胞培养物中(通常作为悬浮培养物)保持至少一年。本文所述NPC曾保持长达2.5年，其中某种NPC曾培养3年。
本发明NPC在最初2天内于培养物中展现出50％生长，且倍增时间低于10天，通常为约6天。曾观察到短至5天的倍增时间。此外，这些细胞可在培养物中长时间持续生长。然而与培养在常规培养基(诸如NeurobasalTM培养基)的NPC不同，这些培养物在3至4个月后并未显示衰退，而是继续存活并扩增数年且多达数百代。
此外，本发明NPC展现出祖细胞通常具有的正常结构和功能。如图5中所示，NPC在培养物中形成胚状体。图4显示保持未分化状态的NPC的汇合生长，且图6显示NPC呈漂浮细胞簇的生长。图12和13是电子显微图片，显示本发明NPC的正常超微结构。
NPC自胎儿脑的中脑及/或端脑制备，如下文实例1中所述。通常，在无菌条件下于通用无血清培养基(诸如含有0.25μg/ml两性霉素B(Fungizone)和10μg/ml庆大霉素(Gentamicin)的汉克氏(Hank’s)平衡盐溶液(HBSS))中解剖所述组织。
多能干细胞本发明提供可在培养物中无限保持且染色时呈细胞标记物Oct4阳性的多能干细胞(PSC)。本发明PSC可共表达Oct4和巢蛋白，表明这些细胞能够形成神经元和神经胶质。本发明PSC可在细胞培养物中(通常作为悬浮培养物)保持至少一年。本文所述祖细胞/干细胞培养物最初会包括少量百分比的Oct4-阳性细胞，而大部分为巢蛋白阳性NPC细胞。培养数个月的时间内，Oct4-阳性细胞百分比显著增加。例如，在4个月内典型培养物中从含有5％Oct4-阳性细胞变成含有多达30％Oct4-阳性细胞。
本发明PSC可用于本文所述用于NPC的所有方面。这些细胞的Oct4-阳性状态表明，所述细胞能够起到许多超越神经环境的额外作用。这些细胞的多能性质使其具有置于多种组织环境中的吸引力，其中局部细胞因子(天然及/或外源提供)和其它信号可诱发适当分化和迁移。应了解，在后续方法的阐述中NPC指NPC及/或PSC。
用于细胞培养的培养基和方法经由培养基对培养中NPC的结构和功能加以操作。例如，将培养基的钙浓度由0.05mM升高至0.1mM会使祖细胞附着至培养瓶上(参见图7)。向培养基中添加LIF会延长倍增时间，但会产生较大神经元群体。添加LIF还有助于防止形成NPC的大细胞簇。培养基中TGFα可用来显著降低倍增时间(例如，由14天降至5天)。因此，需根据特定目标选择培养基，其中一些成份有助于生长和扩增而另一些成份有助于附着和分化。
对于一般目的，细胞培养需要低钙基础培养基(例如，补充有氯化钙的无Ca++EMEM)，通常需要补充有B27或等效补充物和生长因子(例如，EGF、FGF、TGFα)。可选成份包括可促进神经元生长的L-谷氨酰胺和LIF。
下文实例3提供有关NPC扩增和分化培养基最优化的详细阐述。一般而言，长期生长和扩增需要低钙浓度。此通常可借助向不含钙的最低必需培养基(EMEM)中添加钙来达成。曾在0.05至0.06mM钙浓度下观察到最佳生长和扩增。随着钙浓度的升高(例如，超过0.15mM)，观察到培养物中神经元之间形成网络结构，同时其呈现分化程度更高的神经元表型。在这些钙含量较高的培养物中，仅有1至2％的细胞对星形细胞标记物GFAP呈免疫阳性，即使不向培养基中加入LIF也如此。
NPC通常生长在悬浮液培养物中。以30,000至50,000个细胞/cm2进行原代细胞初始铺板最佳。可通过将细胞取出置于试管中并离心(例如，5min，1,500rpm)每6天更换一次培养基。通常，除保留2ml原始培养基外弃去其它培养基，然后将剩余的2ml原始培养基与额外的3ml新鲜培养合并且将细胞沉淀悬浮于其中。当密度超过400,000细胞/ml时，可将细胞分开装入两个培养容器中(例如，T75培养瓶)。在放入培养基中时可将细胞捣散以帮助打散NPC细胞簇并使其在培养基中保持悬浮状态。所属技术领域的技术人员会了解，允许改变这些参数且可对其进行最优化以适用于特定目标和条件。
本发明NPC可用于治疗和诊断应用以及药物筛选和基因操作。本发明NPC及/或培养基可以套组形式提供，视情况所述套组包括容器及/或注射器和其它材料，以使其可立即用于这些应用中的任一用途。
NPC的冷冻保存本发明提供用于冷冻和解冻NPC的最优化方法和培养基。保存和成功解冻NPC的能力对其在临床应用中的使用和确保适宜NPC的持续和一致性供应很有价值。尽管大部分用祖细胞群进行研究的专家观察到在冷冻-解冻后仅有1至2％的细胞存活，但本发明提供可使冷冻-解冻后有50％以上存活的方法，其中存活率通常高于95％。
对于冷冻保存，将NPC悬浮于补充有B27和DMSO的低钙培养基中，且在扩增培养基中使用营养因子。通常，冷冻保存培养基中的生长因子包含约20至100ng/ml表皮生长因子(EGF)、约10至50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和约1至150ng/ml转化生长因子-α(TGFα)。对于解冻，需将培养基和培养瓶二者或可NPC生长于其中的其它容器预热至15至40℃，较佳地预热至25至37℃。通常在与用于细胞生长相同或类似的气体、湿度和温度条件下预热培养瓶(或其它容器)。例如，典型温度为约37℃且典型CO2含量为约5％(且剩余的95％为O2)。
NPC的治疗用途可用常规技术将本发明NPC植入宿主的中枢神经系统(CNS)。神经移植或“植入”涉及细胞向实质、向脑室腔或经硬膜下向宿主脑表面的移植。成功移植的条件包括1)植入细胞的存活率；2)适当连接及/或适当表型表达的形成；和3)移植部位处最低量的病理反应。
NPC的治疗用途可应用于CNS的变性、脱髓鞘、兴奋毒性、神经性和外伤病症。可通过植入NPC得到治疗的病症实例包括但不限于帕金森氏症(PD)、亨庭顿氏症(HD)、阿兹海默氏症(AD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、癫痫、中风、局部缺血和其它CNS外伤。
向宿主脑移植各种神经组织的方法业已阐述于Neural TransplantationAPractical Approach，S.B.Dunnett & A.Bjorklund(编辑)Irl Pr；1992中，其以引用方式并入本文中。这些程序包括实质内移植，即宿主脑内移植(与脑外或实质外移植相比较)，此可通过在宿主脑内注射或置入组织以与移植时的脑实质相反来实现。
用于实质内移植的程序涉及以立体定位方式将供体细胞注射入宿主脑内。若需要使移植物成为宿主脑的组成部分并为宿主生命存活则此具有重要作用。通常，实质内移植涉及细胞的预分化。然而所述细胞分化限制了其迁移和形成连接的能力。当目标是实现在植入部位处产生神经化学物质时，预分化细胞的实质内移植通常较佳。
或者，可将移植物置于室内(例如脑室)或置于硬膜下，即通过插入软脑膜或蛛网膜和软脑膜置于可与宿主脑实质分开的宿主脑表面上。对于硬膜下移植，可将细胞注射在脑表面的周围。在一些实施例中，经静脉内注射NPC。经脑室内或经静脉内引入的NPC可迁移至宿主脑的适当区域。当目标是恢复回路和功能时脑室内(或静脉内)移植较佳。
向宿主脑选定区域的注射可通过钻孔和刺穿硬膜使微量注射器的针头插入来进行。微量注射器较佳安装在立体定位架上并对三维立体定位坐标加以选择以便将针头置于脑或脊髓的期望位置。对于移植，细胞悬浮液吸入注射器内并施予至经麻醉的移植物接受者体内。可使用此程序进行多次注射。其中可引入NPC的CNS部位的实例包括脑的脑核、基底核、海马皮质、纹状体或尾状区以及脊髓。
所述细胞悬浮液程序允向脑或脊髓内预先确定的任何部位植入NPC；相对无外伤；允许同时在若干不同部位或相同部位用相同细胞悬浮液进行多次植入；并允许使用具有不同特征细胞的混合物。多次植入可由若干细胞类型的混合物及/或插入细胞的转基因混合物构成。较佳地每次植入可引入约104至约108个细胞。视情况，NPC可作为未分化细胞的细胞簇植入。或者，可在植入前诱发NPC分化。
对于较佳用于脊髓植入的向腔内移植，例如通过去除覆盖于脊髓上的神经胶质癍痕并用诸如明胶海绵等材料使流血停止来去除靠近CNS外表面的区域的组织以形成移植腔。可使用抽吸形成腔。然后将干细胞悬浮液置于腔内。
NPC向受外伤脑的移植需要不同的程序。例如，尝试植入之前必须清洗损伤部位并使流血停止。此外，供体细胞应具有足够的生长潜力以填补宿主脑内的任何损伤或腔以防止移植物在受损伤脑的病理环境下发生分离。
基因改造的NPC本发明提供基因改造用于植入目标组织部位的NPC的方法。在一实施例中，将细胞植入CNS以治疗有缺陷、患病及/或受损伤的CNS细胞。本发明方法还涵盖转基因NPC植入联合其它治疗程序治疗CNS或其它目标组织疾病或外伤的用途。因此，基因改造的NPC及/或本发明PSC可与对CNS细胞起到有益作用的其它细胞(基因改造和非基因改造细胞均可)一同植入。因此基因改造细胞可用来支持一起植入的非基因改造细胞的存活和功能。
此外，本发明基因改造细胞可与有用于治疗CNS(或其它组织)缺陷、外伤或疾病的治疗剂(诸如生长因子，例如神经生长因子(NGF)、神经节苷脂、抗生素、神经递质、神经肽、毒素、促轴突分子和抗代谢物及这些分子的前体，诸如多巴胺前体，左旋多巴)一起施予。
可使用携带功能基因插入物(转基因)的载体来改造NPC及/或PSC以产生能够直接或间接影响CNS细胞从而修复所述细胞因缺陷、疾病或外伤而遭受的损伤的分子。在一实施例中，为治疗CNS细胞的缺陷、疾病或损伤，通过引入含有一个转基因或多个转基因(例如编码神经生长因子(NGF)蛋白的基因)的逆转录病毒载体来改造NPC。将基因改造的NPC植入中枢神经系统(例如脑)以通过复原或恢复受损神经元的功能(自基因改造NPC产生经表达转基因产物的结果)治疗缺陷、疾病(诸如阿兹海默氏症或帕金森氏症)或来自物理性外伤的损伤。NPC还可用于向CNS中引入一或多种能够增强在活体内具有改善作用的内源分子产生的转基因产物。
所属技术领域的技术人员会了解多种可用于向NPC及/或PSC引入转基因的载体(病毒和非病毒载体均可)。转基因递送可通过熟知技术(包括直接DNA转染，诸如电穿孔、脂质转染法、磷酸钙转染法和DEAE-葡聚糖)达成。病毒递送系统包括(例如)逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒和腺相关病毒。
转基因的核酸可通过重组方法制备或用常规技术合成。转基因可包括一或多个全长基因或基因的一部分。用于本发明的由转基因编码的多肽包括但不限于生长因子、生长因子受体、神经递质、神经肽、酶、神经节苷脂、抗生素、毒素、促轴突分子、抗代谢物和这些分子的前体。特定而言，用于插入NPC的转基因包括但不限于酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶、ChAT、5-羟色胺、GABA-脱羧酶、多巴脱羧酶(AADC)、脑啡肽、双调蛋白(amphiregulin)、EGF、TGF(α或β)、NGF、PDGF、IGF、睫状神经元营养因子(CNTF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养素(NT)-3、NT-4和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
一般而言，本文所述多肽(包括融合蛋白质)和多核苷酸经分离得到。“分离的”多肽或多核苷酸是取自其原始环境的多肽或多核苷酸。例如，若天然存在的蛋白质与天然系统中一部分或全部的共存物质分开则其是分离的。较佳地，所述多肽至少约90％纯、更佳地至少约95％纯且最佳至少约99％纯。例如，若将多核苷酸克隆至并非天然环境一部分的载体中则认为其是分离的。
治疗包括预防性和治疗性治疗。预防或治疗可通过在单个时间点或多个时间点向单个或多个部位实施单次直接注射来达成。也可几乎同时向多个部位施予。患者或受试者包括哺乳动物。受试者较佳是人类。
施予和剂量组合物可以任何适宜方式施予，且常与医药上可接受的载剂一起施予。本发明范围内向受试者施予细胞的适宜方法可获得，而且尽管有不只一种途径可用来施予特定细胞组合物，但特定途径往往可较另一途径提供更直接和更有效的反应。
本发明范围内施予给患者的剂量应足以在整个时间内于患者体内实现有益治疗反应或可抑制疾病加剧。因此，需以足以诱发针对特异性抗原的有效免疫反应及/或可缓解、减轻、治愈或至少部分阻止疾病或病症症状及/或并发症的量将组合物施予给受试者。将足以达成此目的的量定义为“治疗有效剂量”。
本文揭示的治疗组合物的施予途径和频率以及剂量在个体与个体之间会有所变化且易于通过标准技术确定。通常，可通过注射施予医药组合物。较佳地，在52周时间内施予1至10剂量。替代方案可适于单独患者。
适宜剂量是当如上所述施予时能够促进治疗反应且相对于未经治疗水平至少有10至50％改善的化合物的量。一般而言，适宜的剂量和治疗方案可提供呈足以提供治疗及/或预防益处量的材料。此一反应可通过确立经治疗患者与未经治疗患者相比有改善的临床结果(例如，更常见的缓解、完全或部分或更长时间的无疾病存活)来监测。预先存在的对肿瘤蛋白质的免疫反应的增加一般与改善的临床结果有关。此等免疫反应一般可通过标准的增殖、细胞毒性或细胞因子分析来评估，所述分析可在治疗前后用自患者获得的样品实施。
医药组合物本发明提供包含NPC及/或PSC且视情况包含生理上可接受的载剂的医药组合物。本发明范畴内的医药组合物还可包含具有生物活性或不具活性的其它化合物。例如，所述组合物内可存在一或多种生物反应调节剂(或纳入融合多肽中或作为分开的化合物)。
尽管所属技术领域的技术人员已知的任一载剂均可用于本发明医药组合物，但载剂类型会随施予方式改变。本发明组合物可经调配以适于任一适宜的施予方式，包括例如颅内、脑室内或硬膜下施予。生物可降解微球体(例如，聚乳酸酯、聚乙二醇酸酯)也可用作本发明医药组合物的载剂。适宜的生物可降解微球体揭示于(例如)美国专利第4,897,268号和第5,075,109号。此等组合物也可包含缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸，诸如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如，氢氧化铝)及/或保存剂。
实例呈现下列实例以举例说明本发明并有助于普通技术人员制备和使用本发明。所述实例并非意欲以任何其他方式限制本发明范畴。
实例1祖细胞的制备本实例显示脑祖细胞(BPC)(也称作神经祖细胞(NPC))的制备。BPC来源于胎儿脑的端脑(T系)和中脑(M系)。利用美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)推荐的指南自局部地区医师处获得胎儿组织。只在实施选择性流产后向供体提出组织捐赠要求，且随后获得知情同意。未向患者、妇科医生或门诊部提供金钱补偿或其它鼓励。获取母亲血液样品并实施下列血清学测试HIV、A型、B型和C型肝炎、HTLV-1、VDRL以及CMV。胎儿脑组织在无菌条件下通过低压抽吸技术获得。程序间在流产适应症、计时或方法方面不存在变化。对刚好在中脑附近的胎儿组织进行针对需氧和厌氧细菌(HSV与CMV)的培养。还使用革兰氏染色实施显微镜诊断。排除来自具有生殖器疱疹、癌症、哮喘、狼疮、类风湿性关节炎、过敏症、自身免疫源血管炎、药物滥用或卖淫历史供体的胎儿组织。
胎儿尸体的妊娠期根据由超声波测量的冠臀长(CRL)确定。胎龄介于6至8周之间(CRL为20至24mm)。端脑和中脑样品由2个供体获得(CRL20和24mm)。解剖于4℃在层流净化罩(Environmental Air Control公司)中于解剖显微镜(Leica，Wild MJZ，Meerbrugg，Switzerland)下实施。使用添加有5mmol L-谷氨酰胺和10μg/ml卡那霉素与0.25μg/ml两性霉素B的通用无血清培养基(Ultraculture，Whittaker Bioproducts)。胎儿组织用所述培养基漂洗10次，且随后剥离掉脑的软骨颅和脑膜并转移至补充有10μg/ml硫酸卡那霉素和0.25μg/ml两性霉素B的的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中以用于显微解剖。沿旁矢状面去除来自两个大脑半球(端脑)的背侧皮质。进一步解剖腹侧中脑和顶盖的喙状一侧。用微型剪刀充分剪碎所采集的样品并使用无菌并用无菌的火焰磨光移液管将其捣散。之前未用胰蛋白酶消化处理。在将细胞铺于培养瓶或玻璃分室载玻片上之前，评定所述细胞的存活率(台盼蓝拒染试验)和密度。平均存活率为96％。发现最佳铺板密度是30,000至50,000个细胞/cm2。
实例2来源组织的表征本实例阐述用于上述BPC制备的经解剖组织的表征。以类似方式处理经解剖组织附近的胎儿脑组织区域并固定以用于免疫细胞化学和电子显微镜及光学显微镜检查。回顾分析这些相邻切片的存活率和功能特异性。
对于形态学分析，自胎儿体内取出皮质和中脑并经处理以进行免疫细胞化学或超微结构形态学检查。解剖后，将所述组织的一部分在4％经缓冲(pH 7.4)的PFA固定剂中固定，然后包埋于石蜡中并在旋转切片机上进行切片。按组织化学程序处理此组织的样品以使各种神经元和神经胶质标记物(AchE、TH、NSE、MAP2、BrDU、巢蛋白，等等)显现。
以过氧化物酶反应进行的免疫细胞化学标记用针对神经胶质标记物神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP；Iipshaw，Philadelphia，PA)、神经递质GABA(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)和多巴胺能标记物儿茶酚胺能合成酶TH(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)的抗体实施。简言之，使所述切片脱蜡并在浓度连续下降的乙醇浴中再水化，然后在3％过氧化氢封阻溶液(Signet Laboratories，Dedham，MA)中培育。将初级抗体加在载玻片上，且随后用磷酸缓冲盐溶液漂洗两次以将之去除。之后将载玻片在交联剂中培育且随后在标记试剂中培育，然后用AEC显色剂(SignetLaboratories，Dedham，MA)显像。对于电子显微镜检查，组织在Karnovsky’s固定剂中固定，在1％四氧化锇中进行后固定，通过一系列乙醇和环氧丙烷进行脱水，然后包埋于Medcast树脂(Ted Pella，Redding，CA)中。在铜网上收集超薄切片，用铅和铀染色并用JEOL-100CX电子显微镜观察。
2至4代后，收集大部分培养细胞并于液氮中冷冻。冷冻培养基含有补充有10％DMSO、4％B-27补充物和5至7μl/ml MEM非必需氨基酸溶液(Gibco，NY)的扩增培养基。
实例2A神经胶质原纤维关联蛋白(GFAP)的染色用Cytospin(ThermoSliandon，Pittsburgh，PA)将细胞铺于Superfrost Plus载玻片上且随后于室温在4％低聚甲醛中固定20min。所述细胞用1×PBS，pH 7.4(Gibco)洗涤2次每次5min。细胞用70％甲醇在4℃下过夜渗透处理。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min，然后用SuperBlockTM封阻缓冲液(PierceBiotechnology，Rockford，IL)在室温处理60min以封阻非特异性结合。抖掉载玻片上的SuperBlock，并将细胞制备物与抗人类特异性神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的初级单克隆鼠源抗体(VectorLaboratories公司，Burlingame，CA)一起在室温下培育过夜，其中所述抗体稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液中。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min。用ImmunoPure Peroxidase SuppressorTM(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)在室温处理20min以封阻细胞内源过氧化物酶活性。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温与对源自小鼠宿主的初级抗体具有特异性、稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液中的生物素化次级抗体(生物素化抗小鼠IgG，亲和纯化，大鼠吸附)(VectorLaboratories公司，Burlingame，CA)一起培育120min。然后将所述细胞在0.1M中洗涤2次每次5min并在室温与对生物素具有特异性的第三过氧化物酶偶联的链霉抗生物素(Vectastain Elite ABC试剂，VectorLaboratories)一起培育60min。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温与二氨基联苯胺(VectorLaboratories公司)一起培育2min。所有这些步骤均使用恒温恒湿箱来实施。将所述细胞在室温自来水中洗涤3次每次1min并用苏木精QS(VectorLaboratories公司，Burlingame，CA)复染30sec。将所述细胞在室温自来水中洗涤3次每次1min，用上蓝剂(Richard-Allen Scientific，)在室温处理30sec，在温自来水中洗涤3次每次1min并用Glycergel(DakoCytomation，Carpinteria，CA)封片且在室温下于暗处保存。
实例2B5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrDU)的染色用Cytospin(Thermo Shandon，Pittsburgh，PA)将所述细胞铺于SuperfrostPlusTM载玻片上且随后于室温在4％低聚甲醛中固定20min。将所述细胞用1×PBS，pH7.4(Gibco)洗涤2次每次5min，在4℃下用70％甲醇过夜渗透处理，在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温用SuperBlockTM封阻缓冲液(Pierce Biotechnologies公司，Rockford，IL)处理60min以防止非特异性结合。抖掉每一载玻片上的SuperBlock，随后以1×PBS对其进行过夜培育。在室温用ImmunoPure PeroxidaseSuppressorTM(Pierce Biotechnologies)淬灭内源过氧化物酶活性20min。在1×室温中用稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液的初级单克隆小鼠源抗BrDU抗体(VectorLaboratories公司)将载玻片洗涤2次每次5min。然后将所述载玻片在PBS中洗涤2次每次5min并在室温与稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液中并对初级抗体具有特异性的次级生物素化抗小鼠IgG、亲和纯化、大鼠吸附抗体(VectorLaboratories公司)一起培育120min。此步后，将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温与对生物素具有特异性的第三过氧化物酶偶联的链霉抗生物素(Vectastain Elite ABC试剂，购自VectorLaboratories)一起培育60min。然后将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温与二氨基联苯胺(VectorLaboratories公司)一起培育2min。最后，将所述细胞在室温自来水中洗涤3次每次1min；用苏木精QS(Vector)复染30sec；在室温自来水中洗涤3次每次1分钟；用上蓝剂(Richard-Allen Scientific)在室温处理30sec；在温自来水中洗涤3次每次1min；用Glycergel封片(DakoCytomation，Carpinteria，CA)并在室温下于暗处保存。
实例2C神经元特异性烯醇化酶(NSE)的染色用Cytospin(Thermo Shandon公司，Pittsburgh，PA)将所述细胞铺于SuperfrostPlusTM载玻片上且随后于室温在4％低聚甲醛中固定20min。将载玻片用1×PBS，pH 7.4(Gibco)洗涤2次每次5min；在4℃下用70％甲醇过夜渗透处理；在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温用SuperBlockTM封阻缓冲液(Pierce Biotechnology公司，Rockford，IL)处理60min以防止非特异性结合。使SuperBlock自载玻片上流掉，然后将载玻片与稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液的初级单克隆小鼠源抗人类NSE抗体(Chemicon)在室温一起培育30min。
所述细胞用1×PBS漂洗2次每次5min，然后在室温用ImmunoPure PeroxidaseSuppressorTM(Pierce Biotechnology)抑制内源过氧化物酶活性20min。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温与对源自小鼠宿主的初级抗体具有特异性且稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液中的次级生物素化抗体(生物素化抗小鼠IgG，亲和纯化，大鼠吸附)一起培育120min。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min并在室温与对生物素具有特异性的第三过氧化物酶偶联的链霉抗生物素(Vectastain Elite ABC reagent fromVectorLaboratories)一起培育60min。此步后，将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min；与二氨基联苯胺(VectorLaboratories公司)在室温一起培育2min；在室温自来水中洗涤3次每次1分钟；用苏木精QS(VectorLaboratories公司)复染30sec；再在室温自来水中洗涤3次每次1min；用上蓝剂(Richard-Allen Scientific)在室温处理30sec；在温自来水中洗涤3次每次1min；用Glycergel(DakoCytomation，Carpinteria，CA)封片且在室温下于暗处保存。
实例2DCD 34的染色用Cytospin(Thermo Shandon)将细胞铺于Superfrost PlusTM载玻片上且随后于室温在4％低聚甲醛中固定20min。将所述细胞用1×PBS，pH 7.4(Gibco)洗涤2次每次5min。细胞在4℃下用70％甲醇过夜渗透处理。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min。细胞用SuperBlockTM封阻缓冲液(Pierce)在室温处理60min以封阻非特异性结合并盖好。使SuperBlock流掉，并在室温将细胞制备物与稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液的抗人类CD 34的初级抗体(人类特异性CD 34单克隆小鼠源抗体；DakoCytomation，Carpinteria，CA)一起过夜培育。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min。
用ImmunoPure Peroxidase SuppressorTM(Pierce)在室温抑制内源过氧化物酶活性20min然后在1×PBS中洗涤2次每次5min。细胞制备物与对源自小鼠宿主的初级抗体具有特异性且稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液的生物素化次级抗体(生物素化抗小鼠IgG，亲和纯化，大鼠吸附；Vector)在室温一起培育120min并盖好。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min。将细胞制备物与对生物素具有特异性的第三过氧化物酶偶联的链霉抗生物素(Vectastain Elite ABCreagent；Vector)在室温一起培育60min并盖好。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min。将细胞制备物与过氧化物酶底物溶液(二氨基联苯胺；Vector)在室温一起培育2min。将所述细胞在室温自来水中洗涤3次每次1min。细胞用苏木精QS(Vector)复染30sec。将所述细胞在室温自来水中洗涤3次每次1min。为提高清晰度，将细胞与上蓝剂(Richard-Allen Scientific)在室温一起培育30sec。将所述细胞在温自来水中洗涤3次每次1min。所述细胞制备物用Glycergel(DakoCytomation，Carpinteria，CA)封片且在室温下于暗处保存。
实例2E白细胞共同抗原(CD 45)的染色用Cytospin(Thermo Shandon)将所述细胞铺于Superfrost PlusTM载玻片上且随后于室温在4％低聚甲醛中固定20min。将所述细胞用1×PBS，pH 7.4(Gibco)洗涤2次每次5min；在4℃下用70％甲醇过夜渗透处理；并在1×PBS中洗涤2次每次5min。用SuperBlockTM封阻缓冲液(Pierce)在室温处理60min以封阻非特异性结合，然后在室温与稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液中的初级人类特异性抗白细胞共同抗原单克隆小鼠源抗人类CD 45抗体(DakoCytomation)一起培育30min。
将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min，然后用ImmunoPure PeroxidaseSuppressorTM(Pierce)在室温淬灭内源过氧化物酶活性20min。此步之后，将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min，并在室温与稀释于含有0.1％Triton-X-100的SuperBlockTM缓冲液中且对源自小鼠宿主的初级抗体具有特异性的生物素化次级抗体(生物素化抗小鼠IgG，亲和纯化，大鼠吸附，购自Vector Laboratories公司)一起培育120min。将所述细胞在1×PBS中洗涤2次每次5min；与对生物素具有特异性的第三过氧化物酶偶联的链霉抗生物素(Vectastain Elite ABC试剂，购自VectorLaboratories公司)在室温一起培育60min；在1×PBS中洗涤2次每次5min；并在室温与二氨基联苯胺(Vector Laboratories公司)一起培育2min。最后，将所述细胞在室温自来水中洗涤3次每次1min；用苏木精QS(Vector Laboratories公司)复染30sec；在室温自来水中洗涤3次每次1分钟；用上蓝剂(Richard-AllenScientific)在室温处理30sec以提高清晰度；在温自来水中洗涤3次每次1min；用Glycergel(DakoCytomation，Carpinteria，CA)封片且在室温下于暗处保存。
此染色方案也用于抗Oct-4抗体(Chemicon)、III类β微管蛋白(Serotec)、巢蛋白(R&D Systems)、酪氨酸羟化酶(Chemicon)和人类线粒体(Chemicon)。
实例3培养基的最优化本实例阐述各种培养基组份，测试其对BPC扩增和分化的影响。比较端脑源和中脑源BPC在三种标准培养基中的生长速率Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)、不含钙的Eagle氏最低必需培养基(EMEM)(Biowhittaker)、Neurobasal(GibcoBRL)、Ultraculture(Biowhittaker)和PFMR-4+8F(BRF)；其中含有有丝分裂素bFGF、EGF、TGFα、LIF的至少25种不同组合、卡斯蛋白酶3和8抑制剂以及B-27补充物。每一组合的功效通过短期和长期扩增过程中的细胞存活率和倍增时间以及经纹状体内移植后大鼠PD模型中的行为影响加以测试。以EMEM为基础并添加有bFGF、EGF、TGFα、LIF和B-27的低钙培养基获得了最佳结果。
测试众多成份后，也许最令人惊讶的结果是添加卡斯蛋白酶-1抑制剂(乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp(Ac-YVAD)或乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp氯甲基酮(Ac-YVAD-CMK))(Calbiochem)并未起到有益作用。事实上，卡斯蛋白酶抑制剂在生长培养基中的存在与细胞数降低有关。此外，使用白介素-1(IL-1)时也未观察到有益作用。发现神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)和睫状神经营养因子(CTNF)二者均可促进快速分化和细胞死亡。
发现转化生长因子α(TGFα)会显著缩短倍增时间(例如，由14天缩短至5天)。白血病抑制因子(LIF)对神经元细胞有促进作用且阻碍NPC大细胞簇的形成。即使在不存在其它营养因子的情况下使用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)也可引起良好增殖。单独的表皮生长因子(EGF)未能支持快速生长，但当与bFGF和TGFα组合使用时，观察到最佳生长。
将在生长于bFGF为唯一营养因子的培养基中的细胞与生长于含有EGF+bFGF+TGFα的培养基(E+F+T)中的NPC加以比较。按每只动物2,000,000个细胞的量将细胞移植入PD大鼠(帕金森氏症动物模型)。移植后6天时，仅用bFGF培养的细胞显示密度下降12％，而用E+F+T培养的细胞显示密度增加167％。
祖细胞扩增培养基基础培养基不含钙的Eagle氏最低必需培养基(EMEM)，BioWhittaker公司，Walkersville，MD，目录号06-1746。
补充物B27(2％)，Gibco BRL，目录号17504r-hEGF(20ng/ml)，Peprotech，目录号100-15r-hFGF碱性(bFGF，FGF2)，(20ng/ml)，Peprotech，目录号100-18B丙酮酸钠(0.11mg/ml)，Sigma，目录号S-8636氯化钙2H2O(0.1mM)，Sigma，目录号C-7902可选组份庆大霉素(50μg/ml)，Sigma，目录号G-1272两性霉素B(1.25ng/ml)，Sigma，目录号A-2942或Sigma的100×抗生素/抗霉菌素，目录号A-9909
祖细胞分化培养基基础培养基PFMR-4+8F，Biological Research Faculty and Facility公司(BRFF)，目录号SF-240或DMEM、Neurobasal或不含钙的EMEM(调至0.1mM CaCl2)分化因子神经胶质细胞源神经营养因子(GDNF)(10ng/ml)，Sigma，目录号G-1777IL-1α，(100pg/ml)，Sigma，目录号1-2778IL-11(1ng/ml)，Sigma，目录号1-3644白血病抑制因子(LIF)，(1ng/ml)，Sigma，目录号L-52833’，5’-环单磷酸N6，2’-O-二丁酰基腺苷(db-cAMP)，(100μM)，Sigma，目录号D-0627Forskolin(福斯高林)(5μM)，Calbiochem-Behring公司，目录号344270可选组份0.25μg/ml两性霉素B10μg/ml硫酸卡那霉素培养基制备当向培养基中添加谷氨酸时，谷氨酸仅用来供给初始铺板，而随后供料使用不含谷氨酸的培养基。
扩增培养基调配物 配方注意事项95.5ml基础培养基97.5ml基础培养基不含钙的EMEM对于祖细胞增殖较佳；对于分化可使用EMEM、DMEM或Neurobasal0.05mM CaCl2120μl/100ml仅加入含钙EMEM中；调节量以用于扩增而非分化2％B27补充物2.0ml B270.5mM L-谷氨酰胺0.25ml 200mM L- 使神经元生长超过神经胶质谷氨酰胺(29.2 细胞(对于神经胶质细胞2mMmg/ml) L-谷氨酰胺较佳)，0.5mM L-谷氨酰胺＝73mg/L×100ml培养基＝7.3mg＝0.25ml 200mM L-谷氨酰胺2μg EGF(20 2×25μl等份(40ng/ml) ng/μl EGF)1μg FGF(10 1×25μl等份(40
ng/ml)ng/μl FGF)1μg TGFα(101×25μl等份(40ng/ml)ng/μl TGFα)分化培养基配方 调配物 注意事项97.5ml基础培养基 97.5ml不含钙的EMEM BioWhitaker目录号06-174G2.0ml B27 2％B27补充物1ml 11mg/ml丙酮酸钠 0.11mg/ml丙酮酸钠40μl 25mM CaCl20.1mM CaCl250μl EGF(2等份，浓度为 2μg EGF；20ng/ml EGF40ng/μl)50μl bFGF(2等份，浓度2μg FGF；20ng/ml FGF为40ng/μl)25μl TGFα(1等份，浓度 1μg TGF；10ng/ml TGF为40ng/μl)100μl LIF1μg LIF；10ng/ml LIFNeurobasal培养基调配物配方注意事项97.5ml Neurobasal 97.5ml Neurobasal培养基培养基2％B27补充物 2.0ml B270.5mM L-谷氨酰胺 0.25ml 200mM L-谷 使神经元生长超过神经胶氨酰胺(29.2mg/ml) 质细胞(对于神经胶质细胞2mM L-谷氨酰胺较佳)25M L-谷氨酸 184μl 2mg/ml L-帮助细胞附着谷氨酸(20mgL-Glu+10ml ddH2O)2μg EGF(20ng/ml) 2×25μl等份，浓度为40ng/μl1μg FGF(10ng/ml) 1×25μl等份，浓度为40ng/μl1μg TGFα (10 1×25μl等份，ng/ml)浓度为40ng/μl
制备后可将此培养基冷冻保存1至2周。
实例4培养于本发明培养基中的NPC的特征培养于本发明培养基中的NPC已显示出具有神经祖细胞的特征其可在EMEM培养物中无限保持；对BrDU显现阳性染色；表达巢蛋白；在低[Ca++]条件下其能够产生多巴胺能(35至60％)和血清素能(24至40％)神经元以及许多其它MAP2阳性细胞(10至12％)和神经胶质(GFAP阳性细胞15至23％)。其也会偶尔在活体外形成具核红细胞(2至3％)且当注射入局部缺穴大鼠心脏可形成成肌细胞。
相比之下，当培养于本发明低钙培养基EMEM中时NPC会保持悬浮状态且不会分化。随着钙浓度升高(例如升至0.1mM)，NPC则会形成网络结构并展现神经元表型。即使未添加能够有利于神经元超过神经胶质的LIF，这些经培养细胞中仍仅有1至2％对神经胶质标记物GFAP呈免疫阳性，表明该群体主要为神经元。
实例5NPC向帕金森氏症动物模型脑内的移植本实例证明，根据本发明制备的NPC可成功植入大鼠脑内。本实例表明，植入的细胞可展现向酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞的正常分化。此外，所述结果表明，植入的NPC可改善此帕金森氏症动物模型的行为缺陷特征。
对于移植，自培养瓶中取出自由漂浮的NPC并如更换培养基时的操作进行旋转离心。将沉淀重新悬浮于剩余的2ml培养基中，并在血球计数器上对此浓缩悬浮液进行计数。添加额外培养基以使细胞终浓度达350,000个细胞/μl。
通过用Hamilton注射器(Hamilton公司，NV)注射4μl(8μg)6-羟基多巴胺(6-OHDA，Research Biomedicals International，MA)来引起黑质损伤。所述注射在2分钟内实施，注射后等待3分钟以使注射物在拔出针头前扩散。
黑质损伤后两周，对大鼠实施常规麻醉(氯胺酮(Ketamine)87mg/kg和甲苯噻嗪(Xylazine)10mg/kg；或4％异氟烷气体)并固定于立体定位器上。按纹状体坐标在头皮上造一切口并在头颅上钻一洞。用Hamilton注射器将祖细胞(每只动物70,000个细胞/2μl)植入与6-OHDA损伤同侧的纹状体中，立体定位坐标为A＝-0.11；L＝3.8；V＝4.5。然后缝合切口并用聚维酮碘(Betadine)处理。所有NPC未进行预处理即植入。
对于旋转行为测试，经皮下向大鼠注射安非他明(amphetamine)或媒剂。注射一结束即将动物置于3英尺×3英尺的运动测量室(Columbus Instruments，Columbus，OH)中。2分钟调整期后，通过安装于所述室上方的CCD照相机追踪所有旋转并通过Videomex VTM视频图像分析仪(Columbus Instruments，Columbus，OH)加以分析。对运动活动和旋转记录60分钟。
接受T5或M5细胞的两组动物在其旋转行为方面均表现出显著且可比的降低。在两组动物中，有约14至24％的NPC分化成TH-阳性细胞。
实例6植入黑质的NPC成为酪氨酸羟化酶阳性用类似于上述实例5中所述的方法植入NPC(M5和T5细胞二者)。植入前源自脑干的M5细胞群中有24至30％呈酪氨酸羟化酶(TH)阳性。植入后，54％的M5 NPC呈TH阳性。培养物中源自前脑的T5细胞均呈TH阴性。植入后，32％的植入NPC呈TH阳性。
实例7NPC的分化对上述培养条件加以改动和操作以确定诱发NPC分化的最佳条件。所得最优分化培养基含有0.15mM Ca++、0.5mM L-谷氨酰胺、10ng/ml GDNF、15ng/ml视黄酸。
实例8NPC的冷冻保存对培养基成份加以改动和操作以确定用于NPC冷冻保存的最佳条件。除DMSO以外，B27似乎也可提供显著的保护性作用，此促成了在解冻NPC中所观察到的格外高的存活率。
对于冷冻保存，将NPC悬浮于补充有2％B27、LIF(15ng/ml)、EGF(50ng/ml)、FGF和TGF(25ng/ml)以及10％DMSO的低钙培养基(0.06mM Ca++EMEM)中。首先将所述细胞置于约-40℃的冰箱中，放置1至1.5小时，其后将其保存在液氮中。细胞可保存在约-80℃以下，通常为约-200℃。用于这些研究的液氮保存罐保持在-197℃。
对于解冻，将培养基和培养瓶二者在37℃水浴中预热至37℃。用此冷冻保存方法，在NPC解冻时一直观察到95％以上的存活率(用排染法细胞计数确定)。通常，解冻后的头5至7天所述细胞看起来有所缩小且具有异常形态。尽管有此种外观，但所述细胞仍能够排除台盼蓝染料。约1周后，所述细胞恢复到其冷冻前状态，展现出典型形态、生长和倍增时间。
实例9本发明培养物中的多能干细胞已对NPC评估了如上所述培养的细胞中干细胞标记物Oct4的表达。Oct4是在胚胎与成年干细胞和肿瘤细胞中特异表达但不在已分化组织细胞中表达的转录因子(Tai等人，Carcinogenesis，于2004年10月28日在线发表)。Oct4-阳性细胞也能够在培养物中发育成卵原细胞，所述卵原细胞可参与减数分裂、募集邻近细胞以形成卵泡样结构且随后发育成胚泡(Hubner，K.等人，Science，2003，300(5623)1251-6)。此种可在培养物中进行卵子发生的能力使其能够用于生殖系的核转移与操作，而且能够用于构建研究生育力治疗及生殖细胞与体细胞相互作用和分化的模型。
对于NPC如上所述培养的细胞在培养到6周时会显示有某些干细胞(OCT4-阳性)且主要是巢蛋白阳性祖细胞。培养4个月的时间内，该群体从含有约5％Oct4-阳性细胞变成含有约30％Oct4-阳性细胞。此种观察结果表明，这些细胞在长期培养过程中发生了去分化。或者，此可能反映了干细胞在长期培养过程中的选择性存活。
还观察到Oct4-阳性细胞可共表达NPC标记物(巢蛋白)，如图17中所示。巢蛋白阳性细胞从而能够分化成神经细胞，但并非一定依照此途径进行。
实例10脑室内NPC可恢复帕金森氏症动物模型的功能如上述实例5中所述在大鼠中实施黑质损伤以在此帕金森氏症大鼠模型中形成旋转行为缺陷特征。将如上所述制备的500,000个人类NPC注射入脑室内。完成旋转行为研究(确认旋转行为得到成功改善)后，制备用于免疫组织化学检查的组织切片。发现来自植入NPC的人类细胞已迁移至包括纹状体、黑质和海马在内的神经结构中并已分化成神经元和神经胶质。
图18是一显微照片，其显示在大鼠脑核中具有分支延伸的琥珀褐色人类神经元(图片中央)和神经胶质细胞(图片右下角)。这些细胞由在脑室内注射500,000个未分化的神经祖细胞4个月后显示其旋转行为有70％改善的动物的脑室迁移而来。抗人类线粒体抗体。40×由上述人们应了解，尽管本文所阐述的本发明具体实施例是用于举例说明目的，但仍可进行多种改动且此并不偏离本发明精神和范畴。因此，本发明不受随附权利要求范围外的任何限制。
权利要求
1.一种细胞培养物，其包含(a)培养基，其中所述培养基的钙浓度不高于0.15mM；(b)约20至100ng/ml的表皮生长因子(EGF)；(c)约10至50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(d)约1至150ng/ml的转化生长因子-α(TGFα)；(e)悬浮于所述培养基中的神经祖细胞(NPC)及/或多能干细胞(PSC)。
2.如权利要求1所述的细胞培养物，其进一步包含(f)约0.03至约0.09mM的氯化钙，其中所述培养基是以不含钙的最低必需培养基达到全体积且具有低于0.1mM的总钙浓度。
3.如权利要求1所述的细胞培养物，其进一步包含(g)约7至30ng/ml的白血病抑制因子(LIF)。
4.如权利要求2所述的细胞培养物，其中所述总钙浓度为约0.05mM。
5.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述EGF为约20ng/ml。
6.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述bFGF为约10ng/ml。
7.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述TGFα为约10ng/ml。
8.如权利要求3所述的细胞培养物，其中所述LIF约10ng/ml。
9.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述培养基不含血清。
10.如权利要求1所述的细胞培养物，其进一步包含2％B27补充物。
11.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述生长因子EGF、bFGF和TGFα是重组生长因子。
12.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述细胞和所述生长因子来自人类。
13.如权利要求1所述的细胞培养物，其进一步包含约0.11mg/ml的丙酮酸钠。
14.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述细胞具有少于12天的倍增速率。
15.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述细胞具有约5天的倍增速率。
16.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述细胞可在活体外持续增殖至少1年。
17.如权利要求1所述的细胞培养物，其中所述细胞来源于胎儿前脑。
18.一种繁殖NPC及/或PSC的方法，其包括在培养基中培养原代人类胎儿脑组织，其中所述培养基包含(a)0.03至0.09mM的钙；(b)约20至100ng/ml的表皮生长因子(EGF)；(c)约10至50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；和(d)约1至150ng/ml的转化生长因子-α(TGFα)。
19.如权利要求18所述的方法，其进一步包括(e)约7至30ng/ml的白血病抑制因子(LIF)。
20.一种将人类NPC及/或PSC移植到宿主的方法，其包括(a)获得如权利要求1所述的细胞培养物；和(b)将所述细胞培养物移植到所述宿主。
21.如权利要求20所述的方法，其中在所述移植之前将谷氨酰胺(至浓度为0.5mM)和LIF(7至30ng/ml)加入所述培养基中。
22.如权利要求20所述的方法，其中将所述细胞培养物移植到所述宿主体内的多个部位。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述NPC及/或PSC经基因改造以在所述移植之前表达治疗剂。
24.一种冷冻保存培养基，其包含(a)0.03至0.09mM的钙；(b)约20至100ng/ml的表皮生长因子(EGF)；(c)约10至50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(d)约1至150ng/ml的转化生长因子-α(TGFα)。(e)约2％B27；和(f)约10％的二甲亚砜(DMSO)。
25.一种冷冻保存NPC及/或PSC的方法，其包括在低于约-80℃的温度下将NPC及/或PSC保存在权利要求24所述的冷冻保存培养基中；其中50％以上的NPC及/或PSC在解冻时是存活的。
全文摘要
本发明提供用于培养、繁殖、冷冻保存和操作神经祖细胞(NPC)与多能干细胞(PSC)的组合物和方法。所述细胞展现出短倍增时间且可在活体外长时间保持。本发明还提供一种用于繁殖神经祖细胞的方法和一种用于将人类NPC及/或PSC移植入宿主体内的方法。所述细胞可经基因改造以在移植之前表达一治疗剂。
文档编号A01N1/02GK101065478SQ200480039675
公开日2007年10月31日 申请日期2004年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者奥列格·V·科佩奥夫 申请人:西部天主教会保健组织