专利名称：制备植物单倍体胚和单倍体植株的方法
技术领域：
本发明属植物栽培领域，具体涉及一种制备植物单倍体胚和单倍体植株的方法。
背景技术：
将只具有配子体染色体组分的个体、组织或细胞在离体条件下培养，使其发育成完整的植物体，这种具有单套染色体的植物称为单倍体植物(Haploid Plant)。单倍体在植物遗传育种具有重要意义①通过单倍体培养和染色体加倍可快速获得异花授粉作物的自交系和无性系。②通过单倍体培养中的变异创造新的种质资源。③诱变单倍体可迅速发现隐性突变。④在植物生殖机理的理论研究有重要作用，如单倍体与二倍体杂交得到的非整倍体有助于解决测定连锁群，二倍体的染色体组成分，基因剂量的作用等一些问题，也为现代基因工程研究提供了很好的受体材料(张丽，王静，十字花科作物单倍体育种研究进展.安徽农业科学，2003 31(2)231～234)。
然而，自然界中，单倍体自发产生的频率极低，仅为0.001～0.01％，这大大地限制了单倍体的应用。为了高频率诱导单倍体，人们尝试了多种方法(孙志栋，王学德，毛根富等，作物单倍体研究和应用进展.种子，2000.(6)37～39)。长期以来，利用花药、花粉作外植体进行组织培养，从小孢子经愈伤组织或胚状体产生植株，一直是产生单倍体植物的重要要途径。而利用花药、花粉诱导单倍体的孤雄生殖方法，采用花药、花粉作外植体进行组织培养，从小孢子经愈伤组织或胚状体产生植株，程序复杂，培养条件要求苛刻，操作繁琐，费用高昂。
San Noeum(San Noeum L H，Haploids d’Hordeum vulgare L.par culture in vitro d’ovaries non fecondes.Ann Amelior Plant，1976.24751～754)首次通过大麦(Hordeumvulgare)未授粉子房培养得到单倍体植株，并采用“离体孤雌生殖(in vitro gynogenesis)”的术语来说明在离体条件下未受精胚囊细胞产生单倍体植株的现象，开辟了植物离体孤雌生殖这一获取单倍体植物的途径。随后，相继从多种植物的未授粉子房或(和)胚珠离体培养得到单倍体(杨江义和李旭锋，2002)。植物离体孤雌生殖最初主要是未授粉胚珠或子房的培养，但根据对这方面研究的统计，近年来有越来越多的研究者通过培养花蕾甚至花序来获得雌性单倍体。近年来离体孤雌生殖研究取得了很大进展，在一些植物品种上筛选出了重复性较好的培养程序，但总体来说诱导频率都还偏低，有必要进一步改进培养技术，提高诱导频率(杨江义，李旭锋，2002.植物雌性单倍体的离体诱导.植物学通报，19(5)552～559)。研究表明，影响雌性单倍体离体诱导频率高低的因素很多，涉及供体植株的基因型、供体植株的生理状态、胚囊发育时期、培养基、接种方式、花器附属物影响、培养条件等多个因素。此外，以上因素之间还存在着复杂的相互作用(杨江义，李旭锋，植物雌性单倍体的离体诱导.植物学通报，2002.19(5)552～559)。而且由于影响因素多，所以难于找到一个普遍适用的操作流程，每一种植物要能成功地进行雌性单倍体离体诱导都需要反复的摸索和大量的实验。
到1995年，通过未受精子房和胚珠培养成功的植物仅有7个科的19个种(孟金陵等，植物生殖遗传学1995.北京科学出版社)，而且相关研究多集中在禾本科、茄科及菊科，占全部培养成功种的2/3，尤以禾本科植物研究最多，占全部种的1/3(马三梅张改生，刘宏伟等，异源细胞质诱导小麦单倍体的研究与进展.陕西农业科学，1998.(4)3～9)。目前离体孤雌生殖应用得最成功的植物是甜菜，其次是洋葱、非洲菊、烟草等非木本的植物(杨江义，李旭锋，2002.植物雌性单倍体的离体诱导.植物学通报，19(5)552～559)。木本植物离体孤雌生殖的研究仅在核桃上有相关报道。
目前所采用的利用未授粉子房或(和)胚珠离体培养得到单倍体的离体孤雌生殖方法，存在程序复杂，培养条件要求苛刻，操作繁琐，费用高昂等不足之处。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种制备植物单倍体胚的方法。
该方法包括以下步骤a、在植物开花前，剪去花中的1～(n-1)个柱头；b、在花瓣开放时，给保留的柱头进行人工授粉；c、当植物果实即将转入成熟时，从未受精的胚囊中取出单倍体胚；步骤a中所述的n为该植物花中的柱头数。
进一步的，在上述的步骤a中，在剪去柱头时，应使保留的柱头均匀分布。
进一步的上述的植物是蔷薇科Rosaceae植物。
更进一步的上述的蔷薇科植物是枇杷属Eriobotrya Lind1植物。
本发明的第二个目的是提供使用上述的方法所制备得到的植物单倍体胚。
本发明的第三个目的是提供一种制备植物单倍体植株的方法。
该方法包括以下步骤
a、直接将上述的植物单倍体胚接种于培养基上，培养成苗；b、对苗进行炼苗，以适应外界环境。
进一步的上述的a步骤中的培养基为含有6-BA 0.1～0.5mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L和IBA 0.02～0.1mg/L的MS培养基。
优选的上述的a步骤中的培养基为含有6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L和IBA0.02mg/L。
上述a步骤中的培养基还可含有0.1～0.5％的活性炭。
更进一步地，上述a步骤中的培养基含有0.2％的活性炭。
更进一步的上述的a步骤中的培养条件为温度25±1℃，黑暗条件下培养5～15天后，在光照2000±500lux、14～18h/d下，培养一个月。
本发明的第一个目的所提供的制备植物单倍体胚的方法，其适用范围广泛。在该方法的操作过程中要注意以下事项1、步骤a要选取发育健壮的花序并疏花，每花序留2～5朵花，以便日后果实能获得充足的营养供应。
2、去柱头须在开花前，也就是指一般所说的花尚未开放的灯笼花期(即花已成熟，在当天或1～2天后将开放的时期)进行，以确保未发生授粉受精过程。
3、在步骤a中，在剪去柱头时，应使保留的柱头尽量均匀分布。比如在保留柱头较多的情况下应尽量间隔剪去；而在保留较少柱头的情况下应在使保留的柱头均匀分布的同时，保证中心区域(柱头区域的中心)留有至少一个柱头。
4、给其余的柱头授以足量花粉，使柱头粘满花粉，确保其完成受精过程，形成足量正常种子，以创造适宜的激素和营养环境，诱发去掉柱头的胚珠孤雌生殖。
5、步骤c中的植物果实即将转入成熟时是指果实即将转入成熟却尚未完全成熟的时期，是可以根据常识判断得出的，如对于枇杷Eriobotrya japonica Lindl.、桃Prunuspersica(L.)Batsch、苹果Malus pumila Mill和芸香科Rutaceae的柑桔类等等一般果树来说是指果皮较绿且果肉较硬的时期。
该方法中与被去掉的柱头相连的胚珠，由于未完成双受精过程，不能形成正常的2倍体种子，但在同一朵花中的其他正常发育种子所创造的激素和营养条件的环境下，能诱发孤雌生殖，形成一定频率的单倍体胚，进而发育成完整的单倍体种子(频率约为1％以上，远大于自然发生的频率)。由于这样生长出的完整单倍体种子体积远小于正常种子，又叫“小种子”，该“小种子”内的胚即为单倍体胚，因此非常容易与正常种子相区别。本方法中，去除柱头、人工授粉、从单倍体种子中取出单倍体胚等单个步骤均能用常规操作方法完成。其中，人工授粉应授予同种植物的花粉，并且所述同种植物的花粉既可以是相同品种的花粉，也可以是不同品种的花粉，也可以是几个品种的混合花粉。
本发明的第二个目的所提供的植物单倍体胚，是从发育完整的单倍体种子中取得，这些单倍体胚可以使用现有的培养方法培育成为植株，其中的单倍体植株可通过各种常规单倍体检测方法鉴别。
本发明的第三个目所提供的制备植物单倍体植株的方法，在用于将本发明所提供的制备植物单倍体胚的方法所制备的单倍体胚培养成为单倍体植株的同时，也可以将其他方法制备得到的植物单倍体胚培养成为植株，尤其是适合于对自然生成的单倍体胚的培养。
根据本发明的第三个目的，该制备植物单倍体植株的方法可以采取如下具体方法进行将上述植物单倍体胚直接接种于含有6-BA0.1～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，IBA0.02～0.1mg/L和0.1～0.5％活性炭的灭菌MS培养基上，置于25±1℃，黑暗条件下培养5～15天(子叶变绿，胚开始萌发)，然后在光照2000±500lux、14～18h/d的条件下，培养约一个月，待其长成完整苗株。随后，对单倍体枇杷苗株进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(15～25℃)条件下2～5天，让培养的单倍体苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使单倍体苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，3～7天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭11混合基质的盆中，置于密封环境条件下，培养过程保持自然光照、100％相对湿度、室温，每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。
采用常规染色体检测方法从苗中鉴定出单倍体植株。
本发明制备植物单倍体胚的方法与直接通过组织培养方法离体培养未受精胚囊或胚珠的现有方法相比，优点在于操作简单、费用低廉、不需要特别的仪器设备和试剂，并且适用面广、成功率高、能很好地克服植物种属差异的影响，适用于大田推广。本发明制备植物单倍体胚的方法能够使植株单倍体种子产生频率提高到1％～2％，远远地高于自然发生的频率。本发明单倍体胚对培养条件要求低，更容易培养成苗，苗的生长也更为健康，培养得到的单倍体苗株的移栽存活率可达96％以上。本发明制备植物单倍体植株的方法，在保证培养效果的同时，对仪器设备要求更低、步骤简便，费用低廉，具有很好的的实际应用前景。
图1为本发明制备的枇杷单倍体胚的外观图，圆圈标注的即为枇杷单倍体胚，图中标尺的最小刻度为1mm。
图2为本发明制备的枇杷植株的染色体图(放大1000倍)，其中图2A为枇杷单倍体植株的染色体图，图2B为枇杷二倍体植株的染色体图。
具体实施例方式下面通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明。但这种说明不应理解为是对本发明的限制，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变型，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。
实施例1单倍体胚的制备1、选取生长良好的枇杷植株20株(品种均为大五星)，随机分为2组4株为对照组、16株为实验组，在枇杷即将开花前1-2天，从各植株长势良好的花序上每花序选取1～4朵球型花(处于这一时期的花尚未开放，花粉尚未成熟，故未发生授粉受精过程)，其余花朵全部摘除。拨开选留的球型花，用眼科剪剪去5个柱头中的1～4个(随机剪去1个，或间隔1个柱头剪掉2～3个，或只保留花中心的一个，剪去4个)。
2、待花瓣开放时(去柱头2～3天后)，给保留的1～4个柱头授以足量混合花粉(大五星∶龙泉1号＝1∶1)。
3、摘除未进行人工去除柱头、授粉的花蕾。让进行了人工处理的花继续发育，长出果实，分批疏去发育不正常及多余的果实，最后每个果穗留2～5个果子，以便果实能充分发育。
4、四月初到四月中旬，当枇杷果实直径2～3cm、表面绒毛蜕去，果实即将转入成熟却尚未成熟(果皮为绿色果肉硬)时，将实验组再均分为A、B、C、D组，在对照组和4个实验组的每株枇杷处理过的果穗上各随机采摘100个果实，每组共采摘400个果实，在流水中将果皮洗净。在超净工作台上的无菌条件下，将果实剥开，用无菌的镊子取出未受精的胚囊(未受精的胚囊直径2～3mm，扁平状。而正常种子直径为1～3cm)，置于无菌培养皿中。用无菌手术刀剥开胚囊，取出单倍体胚。
用公式单倍体胚获得率＝获得单倍体胚数/(获得正常种子数+获得单倍体胚数)*100％计算单倍体胚获得率，结果见表1。单倍体胚的外形及大小见图1。
表1枇杷单倍体胚的制备结果
实施例2单倍体植株的制备将实施例1中由A组所制备的单倍体胚，分别直接接种于灭菌MS培养基上，直接接种于添加6-BA 0.5mg/L，NAA 0.1mg/L，IBA 0.1mg/L和0.5％活性炭的灭菌MS培养基上，置于25±1℃黑暗条件下培养15天，25±1℃，光照18h，黑夜6h，1500lux光强下培养成苗(约培养一个月后)。
待长成完整苗株后，对单倍体枇杷进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(15～25℃)条件下2天，让培养的单倍体苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使单倍体苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，5天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1∶1混合基质的盆中，置于封闭环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100％相对湿度、25±1℃。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。
采用常规染色体检测方法鉴别单倍体苗株和单倍体植株(结果见表2)。单倍体枇杷的染色体图见图2A，二倍体枇杷的染色体图见图2B。
实施例3单倍体植株的制备将实施例1中由B组所制备的单倍体胚，直接接种于灭菌MS培养基上，直接接种于添加6-BA 0.3mg/L，NAA0.05mg/L，IBA0.05mg/L和0.3％活性炭的灭菌MS培养基上，置于25±1℃黑暗条件下培养7天后，于25±1℃，光照18h，黑夜6h，2000lux光强下培养成苗(约培养一个月后)。
待长成完整苗株后，对单倍体枇杷进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(15～25℃)条件下3天，让培养的单倍体苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使单倍体苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，3天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1∶1混合基质的盆中，置于密封环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100％相对湿度、25±1℃。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。
采用常规染色体检测方法鉴别单倍体苗株和单倍体植株(结果见表2)。
实施例4单倍体植株的制备将实施例1中由植株C组所制备的单倍体胚，直接接种于添加6-BA 0.1mg/L，NAA 0.01mg/L，IBA 0.02mg/L和0.1％活性炭的灭菌MS培养基上，置于25±1℃黑暗条件下培养5天，于25±1℃，光照14h，黑夜10h，2500lux光强下培养成苗(约培养一个月后)。
待长成完整苗株后，对单倍体枇杷进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(15～25℃)条件下3天，让培养的单倍体苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使单倍体苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，4天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1∶1混合基质的盆中，置于密封环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100％相对湿度、25±1℃。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。
采用常规染色体检测方法鉴别单倍体苗株和单倍体植株(结果见表2)。
实施例5单倍体植株的制备将实施例1中由D组所制备的单倍体胚，直接接种于添加6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L，IBA0.02mg/L和0.2％活性炭的灭菌MS培养基上，置于25±1℃黑暗条件下培养7天后(子叶变绿，胚开始萌发)，于25±1℃，光照16h，黑夜8h，2000lux光强下培养成苗(约培养一个月后)。
待长成完整苗株后，对单倍体枇杷进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(15～25℃)条件下3天，让培养的单倍体苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使单倍体苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，5天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1∶1混合基质的盆中，置于密封环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100％相对湿度、25±1℃。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。
采用常规染色体检测方法鉴别单倍体苗株和单倍体植株(结果见表2)。
用公式单倍体苗株获得率＝单倍体胚培养所得苗株数/获得单倍体胚数*100％分别计算A、B、C、D组单倍体苗株获得率，结果见表2。
用公式单倍体苗株存活率＝移栽存活的单倍体植株数/单倍体胚培养所得苗株数*100％分别计算A、B、C、D组单倍体植株存活率，结果见表2。
表2枇杷单倍体植株的制备结果
上述实例表明本发明制备植物单倍体胚的方法能够使植株单倍体种子产生频率提高到1％～2％。远远地高于自然发生的频率。同时本发明方法与直接通过组织培养方法培养未受精胚囊或胚珠以获得单倍体胚的方法相比的优点在于，采用此方法操作简单、不需要特别的仪器设备、费用低廉、且成功率高，适用于大田推广。本发明方法制备得到的单倍体胚更容易培养成苗，单倍体苗株获得率可达87％以上，苗的生长也极为健康，单倍体苗株的存活率可达96％以上。本发明单倍体植株的制备方法只使用了一种培养基，对仪器设备要求不高、步骤简便，费用低廉，并且具有很好的实际应用前景。
附MS培养基(Murashige and Skoog medium)配方大量元素二水合氯化钙(CaCl2)440.0mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170.0mg/L、硝酸钾(KNO3)1900.0mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4.7H2O)370.0mg/L、硝酸铵(NH4NO3)1650.0mg/L；微量元素五水合硫酸铜(CuSO4.5H2O)0.025mg/L、铁盐(FeNaEDTA)36.7mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、一水合硫酸锰(MnSO4.H2O)16.9mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4.7H2O)8.6mg/L、四水合钼酸钠(Na2Mo4.4H2O)0.25mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L。有机物甘氨酸(Glycine)2.0mg/L、肌醇(Myo-inositol)100mg/L、烟酸(Nicotinic acid)0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L。
IBA吲哚丁酸(indolebutyric acid)NAA萘乙酸(α-naphthaleneacetic acid)6-BA6-苄基嘌呤(6-benzyladenine)
权利要求
1.一种植物单倍体胚的制备方法，它包括以下步骤a、在植物开花前，剪去花中的1～(n-1)个柱头；b、在花瓣开放时，给保留的柱头进行人工授粉；c、当植物果实即将转入成熟时，从未受精的胚囊中取出单倍体胚；步骤a中所述的n为该植物花中的柱头数。
2.根据权利要求1所述的植物单倍体胚的制备方法，其特征于所述步骤a中，剪去柱头时，应使保留的柱头均匀分布。
3.根据权利要求2所述的植物单倍体胚的制备方法，其特征于所述的植物是蔷薇科Rosaceae植物。
4.根据权利要求3所述的植物单倍体胚的制备方法，其特征于所述的蔷薇科植物是枇杷属Eriobotrya Lind1植物。
5.采用权利要求1～4任一项所述的方法制备得到的植物单倍体胚。
6.一种植物单倍体植株的制备方法，包括以下步骤a、将权利要求5所述的植物单倍体胚接种于培养基上，培养成苗；b、炼苗，移栽培养得植株。
7.根据权利要求6所述的单倍体植株的制备方法，其特征在于a步骤所述的培养基为含有6-BA 0.1～0.5mg/L，NAA 0.01～0.1mg/L和IBA 0.02～0.1mg/L的MS培养基。
8.根据权利要求7所述的单倍体植株的制备方法，其特征在于a步骤所述的培养基为含有6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L和IBA0.02mg/L的MS培养基。
9.根据权利要求7或8所述的单倍体植株的制备方法，其特征在于a步骤所述的培养基还含有0.1～0.5％的活性炭。
10.根据权利要求6～9任一项所述的单倍体植株的制备方法，其特征在于a步骤的培养条件为温度25±1℃，黑暗条件下培养5～15天，然后在光照2000±500lux、14～18h/d的条件下，培养一个月。
全文摘要
本发明提供了一种植物单倍体胚及单倍体植株的制备方法，属于植物栽培领域，该植物单倍体胚的制备方法包括以下步骤a.在植物开花前，剪去花中的1～3个柱头；b.在花瓣开放时，给保留的柱头进行人工授粉；c.当植物果实即将转入成熟时，从未受精的胚囊中取出单倍体胚。本发明植物单倍体植株的制备方法包括以下步骤a.将制备得到的单倍体胚接种于培养基上，培养成苗；b.炼苗，移栽培养。本发明方法优点在于操作简单、不需要特别的仪器设备、费用低廉、且成功率高，适用于大田推广，具有很好的实际应用前景。
文档编号A01H4/00GK1799332SQ20051002248
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月31日 优先权日2005年12月31日
发明者王永清, 李俊强, 邓群仙, 侯春霞, 周兰英, 王小蓉, 陈红 申请人:四川农业大学