专利名称：柠檬马鞭草的组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种芳香植物柠檬马鞭草的组织培养快速繁殖方法，更具体地说本发明涉及一种腋芽诱导组织培养快速繁殖柠檬马鞭草的方法。
背景技术：
柠檬马鞭草原产于热带南美洲的智利、阿根廷和秘鲁等地，在北非的摩洛哥也有栽培。我国只有几株由日本引进栽种于本实验组的大棚内。它含有丰富的挥发油，提取的精油可用于化妆品中，还有很高的药用价值；因其特有的柠檬芬芳倍受人们的青睐，广泛用于食品、茶饮料中；又因其叶色、叶型美观，也可作为庭园绿化、净化空气的建植用材料，这不仅使柠檬马鞭草需求量大增，而且经济价值也倍增，因此对柠檬马鞭草进行快速大量繁殖迫在眉捷。
柠檬马鞭草用种子繁殖困难，扦插繁殖又受环境温度、湿度及土壤酸碱性等诸多因素影响，成活率低，直接影响了其推广种植，而且扦插繁殖系数又低，很难满足市场需求。
柠檬马鞭草叶子、叶腋密生软毛，在进行组织培养时对外植体的灭菌处理相当困难；芳香植物产生精油等次生代谢物质，在组织培养时易造成材料和培养基褐化，而柠檬马鞭草精油含量高，又属于木本芳香植物，较其它芳香植物更容易褐化，给组织培养带来不便。
国内外尚无有关对柠檬马鞭草进行组织培养报道。没有现成的培养模式可供参考，对其培养基的选择相当重要。
发明内容
本发明的目的在于针对柠檬马鞭草种子繁殖困难而扦插繁殖成活率偏低的问题，提供一种柠檬马鞭草的组织培养快速繁殖方法，提高柠檬马鞭草繁殖系数，保证柠檬马鞭草遗传稳定性。
为实现这一目的，本发明采用柠檬马鞭草的幼嫩含节茎段为外植体，灭菌时采取在灭菌液中用软毛刷不断刷拭材料尤其是腋芽部位的方法控制污染，接种初期采用转换培养基和暗培养的方法控制材料的褐化，然后依次在经筛选的腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中培养，腋芽能正常萌发生长并迅速进入增殖状态，获得完整试管苗，将该试管苗移栽在蛭石和腐殖质土的苗床上，一个月后便可植入大田。
本发明的方法具体包括如下步骤1、外植体灭菌选取柠檬马鞭草主干基部幼嫩枝条，去除叶片，放在洗洁精水中浸洗，再经自来水冲洗后放入70％的酒精中搅拌15～20秒，取出立即转入含吐温-80的饱和漂白精溶液中浸泡9～10分钟，其间不断用软毛刷刷拭腋芽部位，取出用无菌水冲洗3～4次后用灭菌吸水纸将水吸干，继而切取邻近顶芽的幼嫩含节茎段作外植体，迅速接种在MS培养基上，放入暗处培养，第二天将材料转接到新的MS培养基上；2、腋芽诱导将在MS培养基上不再褐化的外植体转入诱导培养基MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8，培养温度为25±2℃、光照周期12h.d-1、光强度为1200lux；3、腋芽增殖切取诱导培养中单个芽，去除2/3叶片，切取含节的茎段接种到增殖培养基MS+6-BA0.25～0.5mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8，培养温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000lux；4、生根诱导剪取增殖培养中长度为1.5～2.0cm的健壮的芽接种到生根培养基1/2MS+IBA0.5mg/L+琼脂6.0g/L+蔗糖25g/L，pH5.8，培养温度为20±2℃、光照周期10h.d-1、光强度为1000lux；5、炼苗移栽选择根长2～5cm、苗高3～5cm的小苗，打开培养瓶，加少许无菌水炼苗5-7天，然后小心用水洗掉根部琼脂培养基，移栽于装有高温灭菌过的蛭石和腐殖质土(比例1∶1)的苗床上，浇足水，上罩以薄膜，在温室内继续培养，前期湿度控制在70％左右，温度20±2℃，光照周期10h.d-1，光照强度1000lux，后期逐渐恢复自然状态下温湿度。一个月后移入大田。
本发明繁殖柠檬马鞭草与现有技术相比，具有实质性的进步
1、提高了繁殖效率柠檬马鞭草用种子繁殖困难，采用扦插方法不仅繁殖系数低，劳动力成本高，管理复杂，而且成活率低。本发明取柠檬马鞭草含节的幼嫩茎段，用组织培养法进行腋芽诱导的快速繁殖，不受外界条件的影响，四季皆可进行，不仅节约育苗占地，降低生产成本，并且保存了母体的全部优良性状，遗传性状稳定。这种方法可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。
2、有效地控制了污染柠檬马鞭草因其表面密布腺毛，客观上存在着需要长时间消毒而又不耐药杀的矛盾，现有用消毒液浸泡外植体的消毒方法很容易杀伤材料，难以保证有效外植体的数量。本发明在消毒操作时严格控制消毒时间，采取在消毒液中用软毛刷不断刷拭材料尤其是腋芽部位的方法，不仅使消毒效果明显提高，污染率控制在8.94％以下，还保证了足够的有效外植体数量。
3、抑制了培养基和外植体褐化芳香植物产生精油等次生代谢物质，按现有将外植体直接接种到诱导培养中培养的方法易造成材料和培养基褐化，而柠檬马鞭草精油含量高，又属于木本芳香植物，较其它芳香植物更容易引起材料和培养基的褐化。本发明选用柠檬马鞭草主干基部新抽出枝条上邻近顶芽含节的幼嫩茎段为外植体，在接种后放入暗处培养，并于第二天将材料转接到新的培养基上，至不褐化再转接到诱导培养上，有效地控制了材料和培养基的褐化。
4、筛选出有效的培养基配方迄今国内外尚无有关对柠檬马鞭草组织培养的报道，选用培养基是最关键的一个环节。本发明用MS培养基中附加6-BA1.0mg/L和NAA0.1mg/L进行腋芽诱导，外植体腋芽正常萌发生长；用MS培养基中附加6-BA0.50mg/L和NAA0.1mg/L进行增殖培养，迅速进入增殖状态，20天转接1次，增殖系数在3倍以上；用1/2MS中附加IBA0.5mg/L进行生根诱导，生根率高达99％，而且生根条数多，在短期内就可得到大量的组培苗。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1.外植体灭菌 去除叶片的柠檬马鞭草幼嫩枝条，在洗洁精水中浸洗20分钟，后用自来水冲洗2小时，沥干，放入70％的酒精中搅拌15秒，取出转入含吐温-80的饱和漂白精溶液中浸泡10分钟，其间用软毛刷不断刷拭材料尤其是腋芽部位，然后在洁净工作台上取出，用无菌水冲洗3～4次，再用灭菌吸水纸将水吸干，切取顶芽下端的幼嫩含节茎段，迅速接种在MS培养基上，放入暗处培养，并于第二天转入新的MS培养基中。
2.腋芽诱导 将没有污染、褐化的茎段转入培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。培养温度25±2℃，光照周期12h.d-1，光强度1200lux。
3.腋芽增殖 切取诱导培养中单个芽，去除2/3叶片，切取含节茎段接种到培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，PH5.8。培养温度25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000lux。
4.生根诱导 剪取增殖培养中长度为1.5～2.0cm的健壮的芽接种到培养基1/2MS+IBA0.5mg/L+琼脂6.0g/L+蔗糖25g/L，PH5.8。培养温度为20±2℃，光周期10h.d-1，光强度为1000lux。
5.炼苗移栽 选择根长2～5cm、苗高3～5cm健壮的小苗，打开培养瓶，加少许无菌水，在培养室锻炼5～7天，使其适应外部环境条件。然后小心用水洗掉根部琼脂培养基，移栽于装有高温灭菌过的蛭石和腐殖质土(比例1∶1)的苗床上，浇足水，上罩以薄膜，在温室内继续培养。前期控制湿度在70％左右，温度在20±2℃，光周期10h.d-1，光照强度1000lux，后期逐步接近自然状态下的温度、湿度、光照条件，20天后苗开始长出新根。30天后，将苗移入事先做畦、施肥的大田，浇足水，罩遮阴网。一周后去掉遮阴网，按一般苗圃管理，二周后统计成活率达89％。
权利要求
1.一种柠檬马鞭草的组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤1)外植体灭菌选取柠檬马鞭草主干基部幼嫩枝条，去除叶片，放在洗洁精水中浸洗，经自来水冲洗后放入70％的酒精中搅拌15～20秒，取出立即转入含吐温-80的饱和漂白精溶液中浸泡9～10分钟，其间不断用软毛刷刷拭腋芽部位，取出用无菌水冲洗3～4次后用灭菌吸水纸将水吸干，继而切取邻近顶芽的幼嫩含节茎段作外植体，迅速接种在MS培养基上，放入暗处培养，第二天将材料转接到新的MS培养基上；2)腋芽诱导将在MS培养基上不再褐化的外植体转入诱导培养基MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8，培养温度为25±2℃、光照周期12h.d-1、光强度为1200lux；3)腋芽增殖切取诱导培养中单个芽，去除2/3叶片，切取含节的茎段接种到增殖培养基MS+6-BA0.25～0.5mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.0g/L+蔗糖30g/L，pH5.8，培养温度为25±2℃，光照周期14h.d-1，光强度为2000lux；4)生根诱导剪取增殖培养中长度为1.5～2.0cm的健壮的芽接种到生根培养基1/2MS+IBA0.5mg/L+琼脂6.0g/L+蔗糖25g/L，pH5.8，培养温度为20±2℃、光照周期10h.d-1、光强度为1000lux；5)炼苗移栽选择根长2～5cm、苗高3～5cm的小苗，加无菌水炼苗5-7天，然后洗掉根部琼脂培养基，移栽于装有高温灭菌过的蛭石和腐殖质土比例为1∶1的苗床上，浇足水，上罩以薄膜，在温室内继续培养，湿度控制在70％，温度20±2℃，光照周期10h.d-1，光照强度1000lux，逐渐恢复自然状态下温湿度，一个月后移入大田。
全文摘要
一种柠檬马鞭草的组织培养快速繁殖方法，采用柠檬马鞭草的含节幼嫩茎段为外植体，灭菌时采取在灭菌液中用软毛刷不断刷拭材料尤其是腋芽部位的方法控制污染，接种初期采用转换培养基和暗培养的方法控制材料的褐化，然后依次在经筛选的腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中培养，腋芽能正常萌发生长并迅速进入增殖状态，获得完整试管苗，将该试管苗移栽在蛭石和腐殖质土的苗床上，一个月后便可植入大田。采用本方法繁殖柠檬马鞭草，不受外界条件的影响，四季皆可进行，不仅节约育苗占地，降低生产成本，并且保存了母体的全部优良性状，遗传性状稳定。这种方法可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。
文档编号A01H4/00GK1685808SQ20051002639
公开日2005年10月26日 申请日期2005年6月2日 优先权日2005年6月2日
发明者张艳玲, 姚雷 申请人:上海交通大学