专利名称：一种鱼类的雌核发育方法
技术领域：
本发明涉及鱼类的培育，具体涉及鱼类的雌核发育技术。
背景技术：
雌核发育技术在鱼类提纯育种、探讨鱼类的性别决定和鱼类单性养殖方面等方面具有重要的作用。国内外关于鱼类雌核发育研究已有不少的报道，如鲤鱼、草鱼、鲢鱼、虹鳟、罗非鱼、红鲫、白鲈鱼等鱼的雌核发育均有研究报道。一般雌核发育鱼的培育是采用鱼类单倍体卵子经遗传物质灭活的精子激活，再经过染色体的加倍处理，形成主要依靠卵子的遗传物质来发育的二倍体后代。用来激活卵子的精子，一般是异源精子，虽然异源精子经过灭活处理，但还是存在“异精效应”，这种“异精效应”对雌核发育后代可能产生好的作用。在鱼类提纯育种中，一般认为1代雌核发育鱼的纯合效应能够相当于多代鱼的自交提纯的效应，通过选育可以在雌核发育后代中获得遗传性状改良的个体。在鱼类雌核发育过程中，用到的卵子一般都是单倍体卵子，单倍体卵子在雌核发育过程中必需有一个染色体加倍处理的过程，而该处理过程对卵子发育有不利影响，降低了后代的存活率。
探索一种不经染色体加倍处理过程的雌核发育方法，以提高后代的存活力是极具应用价值的。
发明内容
本发明旨在提供一种二倍体卵子的雌核发育技术，不仅提高后代存活力，改良鱼类性状，而且还能提供二倍体卵子资源。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种鱼类雌核发育方法，以四倍体鲫鲤产生的二倍体成熟卵子为材料，用经紫外线灭活的散鳞镜鲤或团头鲂的精子与其混合，混合1～2分钟后，被精子激活的二倍体卵子置于20～21℃水温条件下孵化，孵化出的鱼苗在池塘中养殖，获得了产生二倍体卵子的第一代雌核发育二倍体鲫鲤G1，以雌核发育二倍体鲫鲤G1产生的二倍体卵子为材料，又经上述方法获得产生二倍体卵子的第二代雌核发育二倍体鲫鲤G2，经同样方法获得G3，培育出产生二倍体卵子的雌性二倍体鲫鲤品系。
下面结合附图进一步详述本发明
图1第1代雌核发育二倍体鲫鲤(G1)染色体(2n＝100)
图2第2代雌核发育二倍体鲫鲤(G2)染色体(2n＝100)四倍体鲫鲤(4n＝200)的原始母本为红鲫(Carassius auratus red var.)，原始父本为湘江野鲤(Cyprinus carpio)。四倍体鲫鲤的体色为青灰色，其外形上有些特征介入鲤鱼与红鲫之间，如有两对很短的须(湘江野鲤有2对明显的须，而红鲫无须)，雌、雄四倍体鲫鲤能分别产生二倍体卵子和二倍体精子，但是四倍体鲫鲤在抗逆性、生长速度等方面有待改良。
本发明以四倍体鲫鲤产生的二倍体卵子为原始材料，用散鳞镜鲤或团头鲂的精子激活四倍体鲫鲤、G1及G2产生的二倍体卵子进行雌核发育。具体方法为挤出达到性成熟的雄性散鳞镜鲤(Cyprinus carpio var.)或团头鲂(Megalobrama amblycephala)的精液于培养皿中，用Hank’s液稀释精液，Hank’s液与精液的比例为4∶1，稀释的精液在培养皿中以薄层分布，把盛精液的培养皿放在垫有冰袋的摇床上(旋转速度为30～40转/分)，并置于2支功率分别为15瓦的紫外灯下照射处理，紫外灯与精液的距离为10～12厘米，照射时间为30分钟。Hank’s液配方如下KCL 0.40g，NaCL 8.00g，NaHCO30.35g，KH2PO40.06g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，Na2HPO4·12H2O 0.10g，MgSO4·7H2O 0.10g，MgCL2·6H2O0.10g，CaCL20.14g，Glucose 1.00g；加蒸馏水配至1升。
照射过的精液与四倍体鲫鲤产生的成熟卵子混合，并用干净的鸡毛充分搅拌精子和卵子，1～2分钟后把卵子平铺到盛有清水的培养皿中，无需染色体加倍处理，胚胎在20～21℃水温下孵化。孵化出的鱼苗在池塘中养殖。通过此方法，获得大量存活的第一代雌核发育二倍体鲫鲤鱼(G1)；G1具有大量产生二倍体卵子的特殊功能，他们产生的二倍体卵子在经紫外线灭活的散鳞镜鲤或团头鲂的精子激活下，无需染色体加倍处理，获得了大量的第二代雌核发育二倍体鲫鲤(G2)；G2也具有大量产生二倍体卵子的特殊功能，他们产生的二倍体卵子在经紫外线灭活的散鳞镜鲤或团头鲂的精子激活下，无需染色体加倍处理，获得了大量的第三代雌核发育二倍体鲫鲤(G3)。观察实验鱼的胚胎发育情况，并记录胚胎发育至原肠胚的百分比和孵化率的情况。用肾细胞直接制片法对二倍体鲫鲤鱼体细胞染色体数目进行了检测。肾细胞直接制片法的方法为在18～22℃水温下培育实验鱼1～3天后，对实验鱼注射PHA 1～3次，每次剂量为2～8μg/克体重，间隔时间为12～24小时，在解剖取材前2～6小时，注射秋水仙素，剂量为2～4μg/克体重。取出肾组织，在生理盐水下剪碎肾组织，0.075mol/L KCL低渗处理，在20℃温度下低渗40～60分钟；用冰醋酸∶甲醇(1∶3)固定肾细胞1～3次；在冰冻载玻片上滴片；Giemsa染液染色。
实验证明，50％～60％雌核发育二倍体鲫鲤胚胎能发育到原肠胚，12％～15％雌核发育二倍体鲫鲤胚胎能脱膜形成存活的后代。肾细胞直接制片法的检测结果证明雌核发育二倍体鲫鲤鱼体细胞染色体数目为2n＝100，这种雌核发育二倍体鲫鲤鱼全部为雌性，他们的性成熟年龄一般为2年，比其原始母本-雌性四倍体鲫鲤的性成熟年龄(1年)推迟，但在生长速度和抗逆性方面明显比四倍体鲫鲤要强，雌核发育二倍体鲫鲤的生长速度比四倍体鲫鲤快20～30％，雌核发育二倍体鲫鲤最显著的繁殖特点在于他们能产生90～95％的二倍体卵子，这些二倍体卵子可以用来制备新型的四倍体和三倍体鱼。如利用雌核发育二倍体鲫鲤产生的二倍体卵子与普通四倍体雄性鲫鲤产生的二倍体精子受精培育的新型四倍体鲫鲤的生长速度比普通四倍体鲫鲤的生长速度要快10～20％，而且他们的抗病、抗逆能力以及繁殖能力都明显比普通四倍体鲫鲤要强。
通过细胞和分子生物学实验证明，二倍体鲫鲤杂交鱼产生二倍体卵子的特性可能与生殖细胞的核内复制有关。
本发明方法培育的雌核发育二倍体鲫鲤生长速度快，抗病力强，繁殖力高，且能产生大量的二倍体卵子，二倍体卵子的雌核发育中可以省略染色体加倍的处理过程，大大降低了对卵子发育不利的影响，从而大大提高了雌核发育个体的存活率。雌核发育二倍体鲫鲤鱼体系的形成创建了一种能够产生大量二倍体卵子的新型二倍体鲫鲤杂交鱼品系，为制备新型三倍体和四倍体鱼提供了重要的二倍体卵子资源。
权利要求
1.一种鱼类雌核发育方法，其特征在于以四倍体鲫鲤产生的二倍体成熟卵子为材料，用经紫外线灭活的散鳞镜鲤或团头鲂的精子与其混合，混合1～2分钟后，将被精子激活的二倍体卵子置于20～21℃水温条件下孵化，孵化出的鱼苗在池塘中养殖，获得了产生二倍体卵子的第一代雌核发育二倍体鲫鲤G1，以雌核发育二倍体鲫鲤G1产生的二倍体卵子为材料，又经上述方法获得产生二倍体卵子的第二代雌核发育二倍体鲫鲤G2，经同样方法获得G3，培育出产生二倍体卵子的雌性二倍体鲫鲤品系。
全文摘要
本发明涉及一种鱼类雌核发育技术。本发明以四倍体鲫鲤鱼的二倍体卵子为材料，用经紫外线灭活的散鳞镜鲤或团头鲂的精子使其激活，被激活的卵子孵化出的鱼苗经饲养，发育成能产生二倍体卵子的后代G
文档编号A01K61/00GK1709047SQ200510031690
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月10日 优先权日2005年6月10日
发明者刘少军, 刘筠, 周工健, 罗凯坤, 孙远东, 张纯 申请人:湖南师范大学