专利名称：一种抗灰霉病的生物杀菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种农用生物杀菌剂及其加工方法，确切地说是一种抗灰霉病的生物杀菌剂及其制备方法。
背景技术：
由灰葡萄孢(Botrytis cinerea PersexFr)所致的灰霉病(Botrytis cinerea Pers)，不但是我国草莓危害较严重的病害之一，而且殃及其他园艺作物，也是世界性的重要的园艺作物病害。目前又出现单抗、双抗甚至多抗的灰霉病菌菌株，防止该类病害的任务艰巨。化学防治草莓病除带来环境污染和病原菌产生抗生以外，重要的是草莓作为一种鲜果品，因对农药的残留问题特别敏感，给人的健康带来心理影响。当前无公害农产品的生产和消费热潮正在兴起，随着化学物质在农业生产中应用的限制越来越多，对于农业生产中减少植物病虫害病发挥重要增产作用的农药，无疑提出了更高要求，各国研究者正在寻求天然生物源农药，通过筛选和利用抗灰霉菌的有益微生物及其代谢产物的生物防治方法，已成为灰霉病控制的一条重要而有效的途径。
木霉菌(Trichoderma spp)属于半知菌类的丛孢菌纲，丛梗孢目丛梗孢科，广泛存在土壤、根围、叶围、种子和球茎等生态环境中。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性及多机制性，一直是植病生防学家研究的重点对象，目前研究的热点是通过生物技术方法有目的地改造从自然界分离筛选到的木霉菌，以获得新型菌株，例如用紫外线照射诱变、原生质体融合和基因转化技术等研制开发新型木霉菌株。
发明内容
本生物杀菌剂根据木霉良好的生物防治特性，采用木霉为出发菌株，通过发酵培养获得具有抗灰霉菌活性的生物杀菌剂，所要解决的问题是培养基的筛选和发酵过程的控制。
本生物杀菌剂是将木霉接种在液体培养基(培养液)上进行发酵培养后经分离得到的(即发酵液)。
所述的培养液以麦麸或/和稻糠或/和马铃薯为基料(碳源)，几丁质为诱导物，辅之其他基础营养成分和水配制而的。麦麸或/和稻糠经干燥粉碎后加适量水煎煮，分离，取其汁液配制培养液，而马铃薯是鲜品去皮后粉碎，取鲜粉配制培养液，麦麸、稻糠、马铃薯以下简称碳源粉。各组份有以下重量百分比碳源粉 1～5％几丁质 0.5～3.5％FeSO40.01～0.03％KH2PO40.02～0.2％K2HPO40.05～0.25％MgSO40.05～0.35％水 余量。
优选碳源粉 2～4％几丁质 1～3％FeSO40.015～0.025％KH2PO40.05～0.15％K2HPO40.1～0.2％MgSO40.1～0.3％水 余量。
最佳碳源粉 3％几丁质 2％FeSO40.02％KH2PO40.1％K2HPO40.15％MgSO40.2％水 余量。
将配制好的培养液调pH5.7～6.5，高压灭菌后接种，于25～40℃条件下发酵培养5～10天。发酵结束后过滤分离，若发酵终止时pH＞4，则调pH≤4，沉降过滤，滤液调pH5.8～6.2，即是具有抗灰霉病活性的生物杀菌剂。
优选培养液pH6.0～6.2，高压灭菌后接种，于26～28℃条件下发酵培养6～8天。后处理过程同上。
所述的几丁质是由蟹、虾、贝类、昆虫等甲壳动物的外壳经酸解、洗涤、干燥得到的甲壳质，主要成分是线性高分子多糖和少量的蛋白质。酸解一般使用稀盐酸，也可以使用工业盐酸。
本发酵液经江苏省疾病预防控制中心进行毒性试验(试验编号20020571)，大鼠急性经口LD50＞4640mg/Kg，属低毒级。
本发酵液作为杀菌剂使用需兑水稀释50倍以上，50倍稀释液亩用量20～30Kg，叶面喷施，三天后防效为80％，五天后防效达99％，与此同时对作物生长有显著的刺激作用。
本发明原料易得、价格低廉、工艺简单，使用方便，对环境无污染，无发酵物残留，是名副其实的绿色无公害杀菌剂。但产品热稳定性较差，不同温度贮藏半年，10℃以下防效95％以上，15℃以下防效80％以上，25℃以下防效65％以上，宜10℃以下低温贮藏。
具体实施例方式
1、碳源粉的制备取麦麸或稻糠干燥后粉碎，或者鲜马铃薯去皮后粉碎，备用。
2、几丁质的制备取蟹壳、虾皮或贝壳剔除残余(剩)腐肉，洗净后烘干、粉碎，投入工业盐酸中浸泡24小时，并不断搅拌，水洗至中性，再蒸馏水洗去氯离子，干燥后粉碎，备用。
3、培养液配制与发酵培养取麦麸或稻糠粉25～30g，加入200～350ml，煮沸0.5～1小时，过滤，待滤液冷却后加入0.2g FeSO4、1g KH2PO4、1.5g K2HPO4、2g MgSO4和20g几丁质，或者取鲜马铃薯粉25～30g、加入200～350ml水中，然后加入0.2g FeSO4、1g KH2PO4、1.5g K2HPO4、2g MgSO4和20g几丁质，用蒸馏水稀释定容至1000ml，最后用柠檬酸钠溶液调pH至6.0～6.2。
将培养液高压灭菌后接种，加入无杂菌木霉孢子悬浮液1ml，含孢子1×106个/ml。于26～28℃条件下发酵1周左右，测定终点pH，当pH≤5.3时过滤分离，并用草酸调pH≤4，沉降过滤分离，用三聚磷酸钠溶液调pH5.8～6.2，即是生物杀菌剂。10℃以下低温贮藏。
权利要求
1.一种抗灰霉病的生物杀菌剂，其特征在于由木霉接种在含麦麸或/和稻糠汁液或/和马铃薯以及几丁质的液体培养基上经发酵培养、分离得到的pH5.8～6.2的发酵液即是生物杀菌剂。
2.一种抗灰霉病的生物杀菌剂的制备方法，包括液体培养基的配制、灭菌、接种、发酵培养和分离，其特征在于木霉接种在pH5.7～6.5的液体培养基上于25～40℃条件下发酵5～10天；所述的液体培养基含碳源粉1～5％、几丁质0.5～3.5％、FeSO40.01～0.03％、KH2PO40.02～0.2％、K2HPO40.05～0.25％、MgSO40.05～0.35％、水余量；分离后的发酵液调pH5.8～6.2。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于木霉接种在pH6.0～6.2的液体培养基上于26～28℃条件下发酵6～8天；所述的液体培养基含碳源粉2～4％、几丁质1～3％、FeSO40.015～0.025％、KH2PO40.05～0.15％、K2HPO40.1～0.2％、MgSO40.1～0.3％、水余量。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于液体培养基含碳源粉汁液3％、几丁质2％、FeSO40.02％、KH2PO40.1％、K2HPO40.15％、MgSO40.2％、水余量。
全文摘要
一种抗灰霉病的生物杀菌剂，由木霉菌直接发酵制备得到的生物杀菌剂。发酵是在含麦麸或稻糠或马铃薯为基料、几丁质为诱导物和其他基础营养成分的液体培养基中于25～40℃条件发酵5～10天。本生物杀菌剂经口LD
文档编号A01N63/02GK1685834SQ200510039128
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者蒋立科, 岳永德, 罗曼, 花日茂, 汤锋, 操海群 申请人:安徽农业大学