专利名称：海带无性繁殖系程序降温冻存法的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，涉及一种大型经济藻类—海带种质保存技术。
背景技术：
海带(Laminariajaponica Aresch)是中国重要的经济藻类，海带生活史分两个明显的世代阶段孢子体世代和配子体世代，配子体世代是海带的单倍体阶段，在该阶段将雌配子体(female gametophyte)和雄配子体(male gametophyte)单个分离培养，可形成无性繁殖系(clone)。传统的种质保存技术就是将无性系继代培养保存，传统保存技术具有明显的不足(1)液体培养是唯一的保存途径，手段单一，限制了保存的规模和效率；(2)液体培养保存一般需要在半月内更新一次培养液，工作量大，操作繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的机会；(3)采孢子前无法对种海带进行无菌处理，整个保存过程都在有菌条件下，不能彻底杜绝微生物尤其杂藻的污染；(4)培养中细胞形态异常、单性生殖等现象时有发生，培养因子有待进一步优化。因此，目前的保种技术是一种传统的继代培养保存的方法，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性，还不能作到种质永久保存。
藻类种质超低温保存的研究开始于20世纪60年代，80年代以后发展速度较快，从淡水藻类到海水藻类，从微藻类到大型藻类，从非经济藻类到经济藻类都给予了较多的关注。藻类超低温冷冻保存的方法主要是两步冰冻法(two-stepfreezing)，该方法首先在保存材料中加入抗冻保护剂，进行预冻，再将预冻过的材料投入液氮中快速冷冻，目前已成为藻类种质冰冻保存的常规方法；超低温两步法冻存在大型经济藻类中使用的种类有紫菜和裙带菜，目前有关海带无性系两步法超低温保存仍为一个空白。
发明内容
本发明的目的在于改进已有的继代培养保存无性系技术的不足，而提供一种用于海带无性系超低温保存，存活率高，自动化程度高，利于该技术标准化的海带无性繁殖系程序降温冻存法。
本发明的目的是这样实现的，海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特点是该方法包括以下步骤材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂。
材料预处理是将无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L∶D 24∶0，水温10～15℃，营养盐NO3-N6-10g/m3，PO4-P1-2g/m3的条件下培养两周以上。
平衡是将丝状体置于在0-4℃冰箱预冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min。
降温是平衡结束后，用医用注射器将丝状体与DMSO混合液注射到0.5ml的麦管中，插入程序降温仪冷冻腔内，开始降温，降温从0℃开始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮。
复苏是超低温冰冻后，将麦管从液氮中取出，迅速移到26℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入培养液中培养。
本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果本发明采用超低温程序降温冻存海带无性系，将海带无性系首先按照程序逐渐降温进行预冷，然后投入液态氮中冷冻保存，使海带丝状体在超低温(-196℃)状态下代谢完全停止，生命以静止的形式可以在这种状态下长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性，有效地解决了海带无性系种质保存中污染、混杂、变异的问题，实现海带丝状体种质的永久保存。本发明方法与无性系逐级冷冻保存法相比一是提高了成活率，二是自动化程度高，利于该技术的标准化，但对降温设备要求较高，因此适合大型科研院所使用。无性系程序降温冻存法和逐级冷冻保存法是用途、性质不同的两种方法，有同时存在的必要性。
四、具体实施方案下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例，海带无性繁殖系程序降温冻存法，包括材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂五步骤，材料预处理是将无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L∶D24∶0，水温10～15℃，营养盐NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周；平衡是将无性系置于在0-4℃冰箱预冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min；降温是平衡结束后，用医用注射器将丝状体与抗冻剂混合液注射到0.5ml的麦管(straws)中，插入程序降温仪冷冻腔内，开始降温，降温从0℃开始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮；复苏是超低温冰冻后，将麦管从液氮中取出，迅速移到26℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中，超低温冻存的时间可以根据需要确定，在需要对冻存无性系复苏时结束冻存即可；去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入常规培养液中培养。
采用本发明方法保存的海带无性系，再培养法测定存活率，存活率达73％。
权利要求
1.海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征是该方法包括以下步骤材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂。
2.根据权利要求1所述的海带丝状体程序降温冻存法，其特征材料预处理是将无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时LD240，水温10～15℃，营养盐NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周以上。
3.根据权利要求1所述的海带丝状体程序降温冻存法，其特征平衡是将丝状体置于在0-4℃冰箱预冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min。
4.根据权利要求1所述的海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征降温是平衡结束后，用医用注射器将丝状体与DMSO混合液注射到0.5ml的麦管中，插入程序降温仪冷冻腔内，开始降温，降温从0℃开始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮。
5.根据权利要求1所述的海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征复苏是超低温冰冻后，将麦管从液氮中取出，迅速移到26℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
6.根据权利要求1所述的海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入培养液中培养。
全文摘要
本发明公开了一种海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征是该方法包括以下步骤材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂，本发明改进已有的继代培养保存无性系技术的不足，提供了一种用于海带无性系超低温保存，存活率高，自动化程度高，利于该技术标准化的海带无性繁殖系程序降温冻存法。
文档编号A01G33/00GK1732746SQ20051004420
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月4日 优先权日2005年8月4日
发明者张全胜, 罗世菊, 解建祖, 张壮志, 丛义周 申请人:山东东方海洋科技股份有限公司, 烟台大学