专利名称：通过体胚发生途径建立五叶地锦高频再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及五叶地锦离体培养再生体系建立的方法。具体讲涉及以五叶地锦种子成熟胚为外植体，通过体细胞胚胎发生途径建立其再生体系的方法。属于植物细胞工程领域。
背景技术：
五叶地锦为葡萄科(Vitaceae)地锦属(Parthenocissus)，是落叶藤本植物，有强大的吸附和攀缘能力。五叶地锦是具有良好观赏效果的园林、城市垂直绿化、美化植物。联合国生物圈和环境组织提出“城市绿地面积达到60m2/人时为最佳居住环境”，人类视野中绿色占25％以上时视觉感觉最舒服。但我国城市人均绿地面积不到5m2，与发达国家水平相距甚远，绿化用地缺乏是主要问题之一，而绝大多数城市建筑墙面未加以充分利用，荒漠、石质山地的植被恢复，新建公路、铁路创伤面及护坡的植被建设均需要特殊功能植物。五叶地锦是解决上述问题的优选植物种类之一。
在城市绿化中五叶地锦适应墙面辐射的高温，对氯气抗性强，夏季地锦爬满墙壁对墙面有显著的降温增湿效果，减少墙壁热辐射的面积，有效地消除部分热污染源，并且地锦种植在建筑物墙根处，占用绿化土地面积小，既达到了绿化效果，又弥补了城市绿地不足。地锦增加了城市中植物光合作用的面积，提高了光合效率，从而吸收、固定了温室气体，从根本上减弱了“热岛效应”，同时五叶地锦具有一定的耐荫性，可在高架路下立柱等较荫处作为垂直绿化材料。
五叶地锦适应性强，对土质要求不严，无论是种子繁殖、插条、分株都容易成活；生长迅速，一年生苗株高可达1.5-2.0m，茎长20-50m；耐瘠薄，一般无病虫害。同属的地锦、异叶爬山虎、绿爬山虎和美国爬山虎都有较好的绿化山体断面的效果，其自然生境多为山坡、沟边灌丛或疏林中以及攀援树上、岩石上，生长地海拔最低为140m，最高可达1760m。地锦属植物较强的适应性，使其成为绿化荒漠的先锋植物。随着国家对生态环境建设的日益重视，地锦属植物大量用于荒山绿化、固土护坡，防止水土流失以及干旱地区地面覆盖和植被恢复。五叶地锦在土石荒山与石质荒山、黄土高原、风沙地、长江流域红、黄壤水土流失区绿化中已经应用。
然而五叶地锦在冬季落叶，缺乏绿意，在降雨400mm以下，就难生存，限制了其绿化效果和范围，因此通过育种手段培育绿期长、耐干旱的五叶地锦新品种可显著增强其绿化价值。同时地锦的优良特性并不是都存在于每一个种中，以原产中国的地锦(Parthenocissus tricuspidata)和原产美国的五叶地锦(P.quinquefolia)所含优良特性为多。地锦吸盘发达，附着力强，但生长较慢，五叶地锦生长快、抗性强，但吸盘不发达，附着力弱，这些性状限制严重影响了地锦的推广应用，培育兼具两者优点的新品种将摆脱这一限制。但到目前为止对地锦的利用还处于自然式的随机应用状态，有目标的育种工作尚未开展。
建立高频、稳定的植株再生体系是利用现代生物技术进行品种改良的前提。植株再生体系是外源基因的良好受体，同时也是体细胞融合的基础。深入研究爬山虎体细胞胚的发生还将为爬山虎原生质体培养、优良无性系的繁殖和突变体筛选等研究奠定基础。因此，五叶地锦高频、稳定再生体系的建立成为生物技术育种的关键。
有关五叶地锦植株再生的研究工作未见报道，同属植物地锦再生也只有较少的报道。冯大领等(北京林业大学学报，2004，26(4)，97-100)以地锦子叶的叶片和叶柄为试验材料，在MS附加6-BA0.3mg/L和NAA0.1mg/L培养基上或1/2MS附加6-BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L培养基上诱导产生体细胞胚，转移到无植物生长调节剂的MS或B5培养基上发育成正常植株。并进行了组织学观察，发现地锦体细胞胚的形成经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚、于叶胚等几个阶段，与合子胚的发育途径相似，但存在诱导率较低的问题，诱导率仅为16.7％。李正红等(林业科学研究，2005，1)对地锦盛花期后45天的幼胚在添加2，4-D和6-BA的B5培养基进行愈伤诱导，通过对诱导出的生长较快、灰白色无粘性、质地稀软的愈伤组织继代培养，继代培养基为B5+6-BA+NAA+LH，得到黄绿色颗粒状松散的胚性愈伤组织，转移到胚状体分化培养基(B5+6-BA+NAA+LH)后，分化出胚状体并再生出地锦植株，但胚状体分化率较低，只有33％。
虽然通过以上方法建立了地锦属植物再生体系但再生率较低，同时外植体的取材受季节限制大，因此在实际应用中受到了极大的限制。在地锦离体培养的各种外植体中，其种子比其他外植体具有易收集、耐贮藏，取材不受季节限制等优势，且种子中成熟胚内源激素含量高，细胞具有潜在旺盛的分裂能力，是用于离体培养的良好材料。
发明内容
本发明的目的是建立五叶地锦的高频再生体系。
本发明是以五叶地锦成熟胚为外植体进行培养，以此建立五叶地锦再生体系的方法。
本发明通过离体培养五叶地锦成熟胚建立了高频的再生体系，所获得的再生植株性状均一、稳定，易于遗传工程操作。
本发明的培养方法包括三个培养阶段(1)成熟胚剥离培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导体细胞胚和胚状体发育成植株，培养基中均含有蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，培养温度22～28℃，光暗周期16h/8h，光强2000～2500勒克斯，相对湿度60％-70％，每培养30天更换一次新鲜培养基。
本发明三个阶段的基本培养基是改良B5培养基(表一)，在第(1)阶段培养中所用激素为1.0mg/l-3.0mg/l6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)，100mg/L-1000mg/l水解乳蛋白(LH)，0.5mg/l-6.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，在第(2)阶段的培养基中所用激素为0.5mg/l-3.0mg/l 2，4-D，0.1mg/l-3.0mg/l6-BA，在第(3)阶段的培养基中所用激素为0.1mg/l-3.0mg/l6-BA、0.1mg/l-3mg/l奈乙酸NAA、100mg/l-1000mg/l LH、0.1mg/l-10.1mg/l赤霉酸(AC)。
优选为第(2)阶段培养在含激素为1.5mg/l-2.5mg/L 2，4-D，0.5mg/l-1.5mg/l 6-BA的培养基上愈伤组织继代三次，在第(3)阶段的培养基从A.含500mg/L水解乳蛋白(LH)的培养基B.含激素2mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、300mg/L LH的培养基C.含激素2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、100mg/L LH、5mg/lAC的培养基三种培养基中选择其一。
本发明特别优选的方法包括以下步骤(1)成熟胚剥离后接种于添加3.5mg/L-4.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.5mg/L-2.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)和500mg/l水解乳蛋白(LH)的培养基上；(2)诱导得到的愈伤组织第一次继代培养于1.5-2.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.5-1.5mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)的培养基上；第二次继代培养于0.5-1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.1-1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)的培养基上；第三次继代培养于0.5-1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1-1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)的培养基上(3)继代的愈伤组织在400-600mg/l水解乳蛋白(LH)的培养基上，诱导出体细胞胚并发育成植株。
本发明方法的优点在于
1.以成熟胚为培养物建立了五叶地锦的再生体系，使得其离体培养外植体的取材不再受季节限制。
2.此方法建立的再生体系，再生频率达到59％。
3.此方法建立的再生体系，植株发育正常、稳定，是良好的育种平台。
具体实施例方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1本试验采用由加拿大引进的五叶地锦种子，将五叶地锦种子用室温下的自来水浸泡10～15小时，然后用70％酒精表面灭菌2分钟，无菌水冲洗2遍，接着用0.1％氯化汞(HgCl2)表面灭菌10分钟，无菌水冲洗5遍，用镊子和解剖刀剖出胚接种在含6-BA 2.3mg/l，2，4-D 3.8mg/l，600mg/l水解乳蛋白的改良B5培养基(表1)上。培养基中均含有蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L。用1mol/LNaOH或HCl调pH值为5.8～6.2，高压蒸汽灭菌20min，培养温度22～28℃，光暗周期16h/8h，光强2000～2500lx，相对湿度60％-70％，每培养30天更换新鲜培养基。
10～12天开始出现愈伤，18天后愈伤快速生长。在附加6-BA 1.0mg/l，2，4-D 2.0mg/l和500mg/l水解乳蛋白培养基愈伤诱导率可达100％。
诱导出的胚性愈伤组织(除去雪花状愈伤组织)，第一次继代培养基所用激素为2，4-D 1.2mg/l，6-BA0.6mg/l，第二次继代为2，4-D 0.8mg/l，6-BA0.33mg/l，第三次继代为2，4-D 0.8mg/l，6-BA0.33mg/l。经过三次继代愈伤组织为两类，5％为生长较慢的淡黄色胶状粘性愈伤组织，95％为生长较快的黄绿色无粘性、颗粒状松散的愈伤组织，镜检为球形、细胞质较浓的胚性愈伤组织。
将继代获得的胚性愈伤组织，转到不加生长调节剂，附加300mg/L水解乳蛋白的B5培养基上，40天后，观测到体细胞胚的发生，发生率达59％。显微观察确定，胚状体均从愈伤组织表面的圆形细胞产生，即外起源，愈伤底部的长形细胞无胚状体发生。胚状体发育经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚等不同时期逐渐发育成熟，与合子胚发育相类似。
在附加300mg/L水解乳蛋白的改良B5培养基上，愈伤组织经继代后能不断生长，且不断产生胚状体，继代6次后仍保持胚状体发生能力，从最初分化的80块愈伤组织共产生约4298个胚状体，平均每块54个。
成熟胚状体在相同培养基中萌发为具根、茎、叶结构的完整小苗。对100瓶胚状体萌发情况进行调查，胚状体成苗率78％。其余22％则为畸形胚，如不形成子叶，或单片肥大子叶，或玻璃化等。
小苗长8～10cm时，在温度25℃、湿度75％左右的玻璃温室中揭盖炼苗3d后移栽，于同样条件温室中培养，第1周置于阴凉处，而后置于向阳处，1个月后调查成活率90％。
实施例2培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于第一阶段在附加6-BA1.1mg/l，2，4-D 2.2mg/l和LH 400mg/l(单位下同)，第二阶段第一次继代2，4-D0.9mg/l，6-BA为0.45mg/l，第二次继代为2，4-D0.5mg/l，6-BA为0.25mg/l，第三次继代为2，4-D0.5mg/l，6-BA为0.25mg/l，第三阶段将继代获得的胚性愈伤组织，转到不加生长调节剂，附加400mg/l水解乳蛋白的改良B5培养基上进行。
实施例3培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于第一阶段在附加6-BA1.3mg/l，2，4-D 1.9mg/l和500mg/l(单位下同)，第二阶段第一次继代2，4-D1.25mg/l，6-BA为0.65mg/l，第二次继代为2，4-D0.65mg/l，6-BA为.035mg/l，第三次继代为2，4-D0.65mg/l，6-BA为0.35mg/l，第三阶段将继代获得的胚性愈伤组织，转到不加生长调节剂，附加460mg/l水解乳蛋白的B5培养基上进行。
实施例4培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于第一阶段在附加6-BA0.9mg/l，2，4-D 1.8mg/l和500mg/l(单位下同)，第二阶段第一次继代2，4-D0.8mg/l，6-BA为0.4mg/l，第二次继代为2，4-D0.4mg/l，6-BA为0.2mg/l，第三次继代为2，4-D0.4mg/l，6-BA为0.2mg/l，第三阶段将继代获得的胚性愈伤组织，转到不加生长调节剂，附加580mg/l水解乳蛋白的B5培养基上进行。
实施例5培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于第一阶段在附加6-BA0.8mg/l，2，4-D 2.2mg/l和500mg/l(单位下同)，第二阶段第一次继代2，4-D1.1mg/l，6-BA为0.4mg/l，第二次继代为2，4-D0.55mg/l，6-BA为0.2mg/l，第三次继代为2，4-D0.55mg/l，6-BA为0.2mg/l，第三阶段将继代获得的胚性愈伤组织，转到不加生长调节剂，附加480mg/l水解乳蛋白的B5培养基上进行。
实施例6培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于第一阶段在附加6-BA1.4mg/l，2，4-D 2.5mg/l和580mg/l(单位下同)，第二阶段第一次继代2，4-D1.3mg/l，6-BA为0.7mg/l，第二次继代为2，4-D0.7mg/l，6-BA为0.35mg/l，第三次继代为2，4-D0.7mg/l，6-BA为0.35mg/l，第三阶段将继代获得的胚性愈伤组织，转到不加生长调节剂，附加480mg/l水解乳蛋白的B5培养基上进行。
表一B5基本培养基(Gamborg等，1968)成分
权利要求
1.一种建立五叶地锦高频再生体系的方法，其特征在于以五叶地锦成熟胚为外植体，进行培养。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述方法包括三个培养阶段(1)花后40-45天成熟胚剥离后培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导体细胞胚和胚状体发育成植株。培养基中均含有蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，培养温度22～28℃，光暗周期16h/8h，光强2000～2500lx，相对湿度60％-70％，每培养30天更换一次新鲜培养基。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于本发明三个阶段的基本培养基是改良B5培养基(表一)，在第(1)阶段培养中所用激素为1.0mg/l-3.0mg/l 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA，100mg/L-1000mg/l水解乳蛋白LH，0.5mg/l-6.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，在第(2)阶段的培养基中所用激素为0.5mg/-3.0mg/l 2，4-D，0.1mg/l-3.0mg/l 6-BA，在第(3)阶段的培养基中所用激素为0.1mg/l-3.0mg/l 6-BA、0.1mg/l-3mg/l奈乙酸NAA、100mg/l-1000mg/l LH、0.1mg/l-10.1mg/l赤霉酸AC。
4.根据权利要求2的方法，其特征在于第(2)阶段培养在含激素为0.7mg/l-2.5mg/L 2，4-D，0.2mg/l-1.5mg/l 6-BA的培养基上愈伤组织继代三次，在第(3)阶段的培养基从A.含500mg/L水解乳蛋白LH的培养基B.含激素2mg/L 6-BA、0.1mg/L奈乙酸NAA、300mg/L LH的培养基C.含激素2mg/L 6-BA、0.5mg/LNAA、100mg/L LH、5mg/l AC的培养基三种培养基中选择其一。
5.根据权利要求2的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)成熟胚剥离后接种于添加1.5mg/L-2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L-1.5mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA和500mg/l水解乳蛋白(LH)的培养基上；(2)诱导得到的愈伤组织第一次继代培养于0.7-1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.4-1.2mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的培养基上；第二次继代培养于0.5-1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1-1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的培养基上；第三次继代培养于0.5-1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.1-1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的培养基上(3)继代的愈伤组织在400-600mg/l水解乳蛋白LH的B5改良培养基上，诱导出体细胞胚并发育成植株。
全文摘要
本发明涉及以五叶地锦成熟胚为材料建立其再生体系的方法，包括三个培养阶段(1)成熟胚剥离后培养诱导愈伤组织；(2)愈伤组织继代培养；(3)愈伤组织中体细胞胚的发生和胚状体发育成植株。在继代培养中采用分步降低2，4－二氯苯氧乙酸2，4－D浓度的方法，使体细胞胚的发生率高达59％，可做为五叶地锦遗传转化体系。
文档编号A01H4/00GK1737128SQ200510090078
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者孙振元, 李正红, 江泽慧, 巨关升, 韩蕾, 杨学军, 李云 申请人:中国林业科学研究院林业研究所