专利名称：蛇床子素苏云金杆菌复配杀虫剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以蛇床子素和苏云金杆菌为活性成分的生物农药复配杀虫剂，该复配杀虫剂可用于防治鳞翅目小菜蛾、菜青虫、低龄夜蛾、夜蛾卵块等多种害虫。
背景技术：
蛇床子素(Osthol)化学名称为8-(3-甲基-2-丁烯基)甲醚繖形酮，属于香豆素类化合物，是伞形花科植物蛇床子(Cnidium monnieir(L.)Cusson)中主要成分，也是欧前胡、圆当归、毛当归、栓翅芹的根和根茎，芸香科植物八角、黄皮的根皮，单叶芸香等的地上部分的活性成分。在医药上，蛇床子素具有抗癌、抗心律失常、解痉平喘等作用。在农业上已经有报道蛇床子素具有杀虫抑菌生物活性，但对其与其他生物农药复配具有增效作用及复配比例尚少有报道。
微生物杀虫剂苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，简称B.t)因产生具有强烈杀虫作用的晶体蛋白毒素(Insecticidal Crystal Protein，简称ICP)而成为近年来防治小菜蛾等害虫的重要生物制剂。然而受生物学特性的限制，在实际使用中普遍存在毒力不强、杀虫谱窄、残效期短、作用缓慢等问题，影响大面积推广应用。有报道，长期大量使用B.t已经使多种害虫对苏云金杆菌产生显著的抗药性。如烟草夜蛾对转B.t杀虫基因的假单细胞杆菌产生了20倍抗药性，对纯B.t杀虫剂某些产品产生了6倍抗药性。研究表明，这主要是由于B.t对害虫的作用机理单一。
为了克服害虫对B.t的抗药性，同时也为了更好地发挥蛇床子素的杀虫效果，本发明将植物源生物农药蛇床子素和微生物源生物农药B.t进行复配，发现其有明显的增效作用。从作用机制上来说，蛇床子素是对昆虫具有神经毒性的触杀作用同时也具有胃毒作用，是速效杀虫；而B.t是通过破坏昆虫消化道而起到一种缓慢的杀虫作用。因此，从杀虫作用机制的互补上来说，与单剂在相当杀虫效果的情况下，蛇床子素与B.t复配具有下列优势与意义1.减少B.t的用量，从而降低害虫对其的选择压力，以期克服害虫对B.t的抗药性；1、减少蛇床子素的用量，以降低对蛇床植株的消耗量；2、缓效型与速效型复配，从杀虫时效上具有增效作用。
发明概述本发明是通过蛇床子素单剂及B.t复配作为农用杀虫剂的研究，尤其是针对鳞翅目害虫及蚜虫的防治应用研究而完成的。其目的在于提供专用于防治作物鳞翅目害虫及蚜虫的蛇床子素和B.t复配生物杀虫剂。
因此，本发明提供了一种蛇床子素苏云金杆菌复配杀虫剂，其中蛇床子素与苏云金杆菌复配的质量比例范围为1∶1～60，更优选为1∶1～25，两者复配后对鳞翅目昆虫如小菜蛾、菜青虫均具有增效作用。本发明特别适合于甘蓝、花椰菜、绿花菜、大白菜、小青菜等作物上防治各龄小菜蛾、菜青虫幼虫，并且对空心菜、茶叶作物的夜蛾卵块具有杀灭作用。本发明还提供了蛇床子素与苏云金杆菌复配的生物农药在农业上的应用，特别是防治鳞翅目害虫的应用研究，如用于防治甘蓝、花椰菜、绿花菜、大白菜、小青菜作物的小菜蛾、菜青虫幼虫和空心菜、茶叶作物的夜蛾。所述的蛇床子素来自各种有效成分含量的制剂，苏云金杆菌来自含有杀虫活性蛋白苏云金杆菌的原粉、粉剂或者水剂。
发明详细描述蛇床子素单剂对小菜蛾、菜青虫具有较好的防治效果，蛇床子素与B.t进行复配，具有以下优势1、表现为增效性，由于B.t具有残效期短、作用缓慢等缺点，而蛇床子素相对而言，速杀性较好，两者复配，可以优势互补，表现为增效；2、复配后与单剂相比降低了蛇床子素的用量，减少对植物资源的依赖；3、复配后能对鳞翅目害虫小菜蛾、菜青虫等对菊酯类药剂如氯氰菊酯的抗药性进行治理，同时可以减少田间使用剂量，从而减少害虫对此类药剂的选择压力。
本发明所使用的蛇床子素可以用已有的提取工艺来提取获得，可以直接从市场上购买得到。与其复配的微生物杀虫剂苏云金杆菌是通过发酵获得，目前，市场上有多家公司生产该药，来源广泛，只要符合本发明所述比例范围及应用条件即可。
下面对蛇床子素及其与苏云金杆菌复配具有增效作用的比例范围和防治对象进行详细说明，这些内容只是用于说明，并不意味着对本发明的保护范围进行限定，其中所述的活性成分均以有效成分计。
1、室内毒力测定与复配比例筛选1.1供试害虫小菜蛾(Plutella xylostella L)，菜青虫(Pieris rapae)。
1.2供试药剂95％蛇床子素(以下用其英文名Osthol)，四川成都龙泉高科生物制品公司提供，溶解于二甲亚砜中，制成1000μg/mL母液；32000IU/mgB.t(IU为B.t的毒力国际单位)，福建浦城绿安生物农药有限公司，溶解于无菌水，制成1000μg/mL母液。
l.3测定方法及复配配比设计1.3.1供试材料小菜蛾由扬州绿源实验农药厂提供的室内人工培养的2龄幼虫，已经人工繁殖了29代。2～3龄菜青虫为采自江苏省农科院实验用虫饲养地。
1.3.2复配配比设计及含药菜叶制备通过预备试验和所测定的单剂的毒力曲线(生测方法如下所述)进行配比设计，按照表1的复配比例进行复配。将原药及复配剂按照表2稀释成系列浓度药液备用。设清水为空白对照测定对小菜蛾和菜青虫的敏感性。将新鲜的甘蓝叶片在不同药液中浸润2s，自然晾干后放入培养皿。
表1蛇床子素(A)与B.t(B)复配比例范围及复配例证(质量比)
表2各药剂系列稀释浓度梯度
1.3.3试验处理在1.3.2制备的每一培养皿中分别放入3.1所得小菜蛾、菜青虫各30条，每一药剂浓度处理4次重复，置于25℃恒温培养箱中(黑暗条件下)，48小时后检查活、死虫数，计算LC50、毒力回归方程及共毒系数(CTC)。
1.4计算方法将校正死亡率转换成机率值。同时将浓度换算成对数，以毒力公式Y＝a+bx计算出致死中浓度(LC50)，以共毒系数(CTC)分析混配的效果。
死亡率(％)＝(死亡个体数÷供试总虫数)×100％校正死亡率(％)＝[(X-Y)÷X]×100％(X、Y分别代表对照组内生存率和处理组内生存率)混剂的实测毒力指数ATI
混剂的理论毒力指数TTITTI＝(药剂A的毒力指数×药剂A在混剂中的百分含量)+(药剂B的毒力指数×药剂B在混剂中的百分含量)
CTC≤80 表示两种单剂混配后具有拮抗作用；80＜CTC＜120表示两种单剂混配后具有相加作用；CTT≥120表示两种单剂混配后具有增效作用。
1.5结果与分析
Osthol、B.t单剂对小菜蛾、菜青虫的测定结果见表3、4。Osthol、B.t及其五个复配比例对小菜蛾、菜青虫的毒力测定结果见表5、6、7、8。结果表明B.t∶Osthol＝25∶1配比对小菜蛾的共毒系数CTC为311，对菜青虫的共毒系数CTC为392，高于其它四个配比，在设定的5个配比中具有最好的增效作用。
表3两种单剂对小菜蛾的测定结果
*为4次重复的平均值表4两种单剂对菜青虫的测定结果
*为4次重复的平均值表5B.t与Osthol不同复配比例对小菜蛾的测定结果
*为4次重复的平均值表6B.t、Osthol及其不同配比复配对小菜蛾室内毒力测定结果分析
表7B.t与Osthol不同复配比例对菜青虫测定结果
*为4次重复的平均值表8B.t、Osthol及其不同配比复配对菜青虫室内毒力测定结果分析
2、田间小区试验根据室内配方筛选实验筛选出B.t∶Osthol＝25mg∶1mg的配比，当Osthol为1mg时，则B.t为8×105IU，即25mg×32000IU/mg。我们研发了1％蛇床子素·8000IU/μLB.t水悬乳剂(以下简称蛇床子素1号)，其中70％的溶剂是纯净水。其中1mL蛇床子素1号制剂中，约含蛇床子素10mg，B.t 8×106IU(毒力国际单位)。另根据B.t∶Osthol＝10mg∶1mg的配比，制成1％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬乳剂作田间对比试验。
蛇床子素与Bt的复配制剂田间药效试验2.1小区试验设计按照农业部农药检定所主编的《农药田间药效试验准则》设计复配制剂对小菜蛾及菜青虫的田间药效试验。
具体试验设计见表9。
表9田间药效试验药剂设计
小区设计试验共设7个处理，每处理四次重复，共计28个小区，每小区面积30m2，各小区按随机区组排列。用工农16型喷雾器施药。
2.2试验药剂1％蛇床子素水乳剂200×，江苏省农业科学院研制，有效浓度为50μg/mL。
16000IU/mg B.t水分散颗粒剂，福建浦城绿安生物农药有限公司生产，有效含量为60g/667m2。
蛇床子素和B.t复配剂，江苏省农业科学院研制，其中蛇床子素有效浓度分别为33.3μg/mL、25μg/mL、20μg/mL。
对照药剂10％高效氯氰菊酯乳油，江苏化工农药集团有限公司生产，有效含量为45g.ai/hm2。
空白对照清水。
2.3调查方法每小区定点调查12株甘蓝，记录整棵甘蓝上的活幼虫数。药前调查虫口基数，药后3天、7天调查每小区残虫量，计算校正防效。药后跟踪观察试验药剂对甘蓝生长有无不良影响，以确定药剂的安全性。采用DMRT统计方法对数据进行分析，在结果中以小写字母a，b，c表示在0.05水平上的差异显著性。
药效计算方法 对作物的影响检查药剂对作物是否有药害，有药害时要记录药害的类型和危害程度。此外，任何有益的影响亦应记录(增加长势等)按下列方式记录药害a、如果药害能够计数或测量，可用绝对值表示，如株高。
b、其他情况下，损害程度，可用下面两种方法记录①参照药害分级标准，记录每小区药害情况，以-、+、++、+++、++++表示。
-无药害；+轻度药害，不影响作物正常生长；++轻度药害，可复原，不会造成作物减产；
+++明显药害，影响作物正常生长，对作物产量和质量造成一定程度的损失；++++严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。
②每个处理小区同空白对照比较并评价药害百分率。
同时，要准确描述作物损害的症状(矮化、失绿、畸形等)。
2.4试验结果1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂防治十字花科蔬菜小菜蛾田间药效试验结果见表10。从表10可看出，该药300倍、400倍和500倍三个处理药后3、7天的防效分别为81.63％、83.39％；78.62％、81.77％；72.34％和75.74％；1％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬乳剂防治十字花科蔬菜小菜蛾田间药效试验结果见表12。从表12可看出，该药300倍、400倍和500倍三个处理药后3、7天的防效分别为79.71％、82.78％；74.28％、77.46％；66.08％和69.45％；药剂16000IU/mg B.t 60克/667m2、1％蛇床子素水乳剂200倍和10％高效氯氰菊酯乳油45g.ai/hm2，药后3、7天的防效分别为65.80％、68.72％；73.34％、77.85％；55.07％、62.85％。显著性测定表明，药后3天，1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂300倍、400倍防效显著高于其他药剂。药后7天，该药300倍、400倍防效也显著高于其他药剂。药后3，7天，1％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬乳剂300倍、400倍防效显著的高于对照药剂16000IU/mg B.t和10％高效氯氰菊酯乳油。
1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂防治十字花科蔬菜菜青虫田间药效试验结果见表11。从表11可看出，该药300倍、400倍和500倍三个处理药后3、7天的防效分别为84.98％、94.25％；82.86％、90.64％；80.25％和85.82％。1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂防治十字花科蔬菜菜青虫田间药效试验结果见表13。从表13可看出，该药300倍、400倍和500倍三个处理药后3、7天的防效分别为85.13％、90.15％；83.10％、87.99％；75.22％和78.09％；药剂16000IU/mg B.t60g/667m2、1％蛇床子素水乳剂200倍和10％高效氯氰菊酯乳油45g.ai/hm2，药后3、7天的防效分别为80.78％、87.46％；78.25％、82.32％；88.41％、86.38％。显著性测定表明，药后3天，1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂300倍防效显著高于其他药剂，而药后7天，该药300倍，400倍防效显著高于10％高效氯氰菊酯乳油45g.ai/hm2的防效。药后3，7天，1％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬乳剂300倍防效与对照药剂相当。
2.5对作物的安全性评价据施药后观察，各处理区的甘蓝生长正常，未发现药害，各试验药剂对甘蓝生长无不良影响。结论1.通过田间试验可看出，1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂对小菜蛾和菜青虫的防效均要好于1％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬乳剂，所以选择1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂作为开发剂型。
2.1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂防治小菜蛾、菜青虫的持效期达7天以上。药后7天，300～400倍药液处理对小菜蛾、菜青虫的防效为81.77％～83.39％；90.64％～94.25％。
3.1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂防治小菜蛾、菜青虫推荐使用浓度为300～400倍，常规喷雾。
4.1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂防治小菜蛾用药适期应掌握在小菜蛾低龄幼虫盛发期施药；菜青虫用药适期应掌握在菜青虫1、2龄幼虫盛发期施药。
5.1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂在试验剂量范围内对供试甘蓝未产生药害，可安全使用。
表10 1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬浮剂防治小菜蛾药效试验结果分析
*为四次重复的平均值，a，b，c表示在0.05水平上的差异显著性。
表11 1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬浮剂防治菜青虫药效试验结果分析
*为四次重复的平均值，a，b，c表示在0.05水平上的差异显著性。
表121％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬浮剂防治小菜蛾药效试验结果分析
*为四次重复的平均值，a，b，c表示在0.05水平上的差异显著性。
表13 1％蛇床子素·3200IU/μL B.t水悬浮剂防治菜青虫药效试验结果分析
*为四次重复的平均值，a，b，c表示在0.05水平上的差异显著性。
3、对夜蛾杀卵块作用该剂型在田间使用杀小菜蛾和菜青虫作用的同时，发现对夜蛾卵块具有杀卵作用，主要是使卵块绒毛脱落，从而卵粒脱落，与对照卵块相比，只要接触到药剂的卵块上只有2.5％～10％的卵能孵化出幼虫危害。而由于施药技术未接触到药剂的卵块则能正常孵化。下面是按照喷药5天后所有调查的卵块中孵化出幼虫数来计算对卵块的防效的。
调查方法喷药5天后，每小区随机调查20株上的卵块初孵幼虫数。
计算方法杀卵效果＝[1-(处理区初孵幼虫数/对照区初孵幼虫数)]*100表121％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬浮剂杀夜蛾卵块效果
由于在生产上极少有杀夜蛾卵块作用的报道，因此在本说明书中，以示其通过作用于卵块上绒毛脱落而最终起到杀卵作用。从蛇床子素对植物病原真菌的抑菌机制来分析，其可能与抑制病原真菌几丁质沉积一样，也抑制卵块绒毛的几丁质沉积，从而使覆盖卵块的绒毛脱落，卵粒随之脱落，最后导致叶片上卵块能孵出的幼虫数只有5～20条，而对照的卵块正常孵化出80～200条幼虫。
4、药剂安全性试验委托指定进行农药毒性试验的单位南京医科大学测定。毒性测定结果表明1％蛇床子素·8000IU/μL B.t水悬乳剂属于微毒类农药大鼠急性经口、经皮LD50♂＞5000mg/kg，♀＞5000mg/kg；兔眼刺激积分0(1h)，48h后为0，对眼无刺激性；兔皮肤刺激积分0(4h)，对皮肤无刺激性。
权利要求
1.蛇床子素苏云金杆菌复配杀虫剂，其中蛇床子素和苏云金杆菌的质量比为1∶1～60。
2.如权利要求1所述的蛇床子素苏云金杆菌复配杀虫剂，其中蛇床子素和苏云金杆菌的质量比为1∶1～25。
3.如权利要求1或2所述的蛇床子素苏云金杆菌复配杀虫剂，其中所述的蛇床子素来自各种有效成分含量的制剂，苏云金杆菌来自含有杀虫活性蛋白苏云金杆菌的原粉、粉剂或者水剂。
4.权利要求1～3中任意一个所述的蛇床子素苏云金杆菌复配杀虫剂的应用，用于防治甘蓝、花椰菜、绿花菜、大白菜、小青菜作物的小菜蛾、菜青虫幼虫和空心菜、茶叶作物的夜蛾。
全文摘要
本发明公开了蛇床子素与苏云金杆菌复配的生物农药在农业上的应用，特别是防治鳞翅目害虫的应用研究。本发明提供了蛇床子素(A)与苏云金杆菌(B)复配的比例范围为1∶1～60，更优选为1∶1～25，两者复配后对鳞翅目昆虫如小菜蛾、菜青虫均具有增效作用。本发明特别适合于甘蓝、花椰菜、绿花菜、大白菜、小青菜等作物上防治各龄小菜蛾、菜青虫幼虫，并且对夜蛾卵块具有杀灭作用。
文档编号A01N43/16GK1745637SQ20051011468
公开日2006年3月15日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者范永坚, 石志琦, 陈浩, 王春梅 申请人:江苏省农业科学院