专利名称：绿玉树扦插繁殖和组织培养快速繁殖的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种绿玉树植物快速繁殖苗的生产方法，具体是提供一种通过扦插繁殖获得绿玉树大量的完整植株的方法，以及提供一种通过组织培养快速繁殖技术获得大量的绿玉树完整植株的方法二、背景技术绿玉树(Euphorbia tirucalli)是大戟科大戟属植物，又名橡胶大戟、绿珊瑚、白乳木；是直立无刺的灌木或小乔木，高2～10m；是集药用、供能、观赏、工业原料、环境绿化、水土保持于一体，具有能源、生态、经济综合效益的多功能、多用途树种。我国海南、广州、西双版纳等地作为庭园观赏树种零星引种栽培(臧润国，“海南岛尖峰岭树木园主要构筑类型热带树木名录”，林业科学，2002年，Vol38(1))。从绿玉树中茎、叶、根和乳汁中提取的绿玉树醇，具有清热解毒、消肿止痛以及较强的泻下作用(李同琴，“大戟科植物药用历史沿革及价值的探讨”，中医药学刊，2003年，Vol21(8))。此外，绿玉树分泌的汁液成分类似于柴油，不用或稍加工即可成为生物柴油，备受人们关注(孔宪文，“发展生物质能可获得多方面的效益”，节能，2003年第2期，总第247期)。目前，绿玉树的药用和能源价值正逐步被认识，并开始把它作为能源、防护林造林树种进行引种栽培。
由于绿玉树只在原产地生产种子，因此其它栽培地主要采用无性繁殖。而在无性繁殖中，扦插繁殖是一种广泛应用于农业、林业、廉价简单的无性繁殖方法。该方法的其最大特点是，操作简单，同时子代能够保持母本的优良遗传特性。但是，目前对绿玉树离体培养的公开报道主要集中在细胞和原生体悬浮培养和细胞内油体和甾醇类化合物的合成途径，如德国公开专利(DE3126001A)公开了对绿玉树细胞进行静置式培养，以选择抗高温或抗低温的愈伤或细胞聚集体，其并没有涉及绿玉树丛生芽的诱导和生根。对以增殖为目的的无性繁殖绿玉树扦插既没有相关专利公开，也没有非专利文献报道。而对于通过组织培养快速繁殖绿玉树的研究，日本公开专利(JP57074086A)公开了在100-10000(优选100-3000)勒克斯(LX，下同)的光照条件适合于大戟属植物愈伤的获得，但也没有涉及丛生芽的诱导和生根，因此现有技术并不能达到高效快速组培繁殖绿玉树的目的。
因此，现在需要提供一种可高效快速大量繁殖优质绿玉树种苗的方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供了一种通过扦插繁殖获得绿玉树大量的完整植株的方法，具体地说，方法包括选择插穗材料并配制扦插苗床基质、激素预处理插穗材料、将插穗材料移栽于扦插苗床基质、苗期管理的过程。
因此，绿玉树枝条扦插繁殖方法包括1.选择插穗材料并配制扦插苗床基质插穗材料选自开放带菌环境中的一年生木质化和/或半木质化的绿玉树活体枝条。
将苗床设置在光线好，水源充足的地方，并且扦插床长、宽、深适中(长2～3米、宽1～2米、深30～40厘米)，并事先进行杂草清理等，基质由等体积(即体积比1∶1∶1的比例，下同)的腐质土和河沙以及珍珠岩，或由等体积的腐质土和河沙，或由等体积的紫色土和河沙，或由等体积的黄土和河沙，或单独由河沙或腐质土配制。
2.激素预处理插穗材料选取健壮的带菌绿玉树活体枝条或健壮的一年生木质化和/或半木质化的绿玉树活体枝条后，用枝剪剪成10～20cm长的小段，将小段基部浸泡在激素溶液中进行处理1～12小时；所述激素选自0.05mg/L～0.15mg/L的生根粉ABT6溶液、或0.1mg/L～0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)溶液中或0.01mg/L～0.2的萘乙酸(NAA)溶液，优选激素浓度ABT60.15mg/L、IBA0.1mg/L、NAA0.15mg/L。
3.将插穗材料扦插于扦插苗床基质将激素预处理插穗材料，以20根/m2的密度扦插于苗床上，在第一次喷透水后进行苗期管理，扦插25～30天后，插穗生根形成完整植株。
4.苗期管理扦插结束后，根据天气变化和土壤情况进行包括喷水施肥、除草除虫、修剪枝条在内的常规苗期管理。
本发明的第二个目的是提供一种通过组织培养快速繁殖技术获得大量的绿玉树完整植株的方法。
因此，组织培养快繁绿玉树的方法包括1.外植体选择以及预处理、表面消毒、接种选取开放带菌环境中活体植物的茎节段或茎顶端，用自来水反复洗净后，用15％～25％的聚乙二醇(PEG6000)浸泡基部3～6小时，再用自来水反复洗净后，在超净或无菌环境中用70％乙醇处理0～30秒或用5％～10％双氧水处理0～5分钟，无菌水反复冲洗后，再用5％～10％的次氯酸盐溶液或0.1％～1％的氯化汞溶液进行4～10分钟的消毒处理，最后用无菌水反复冲洗以用于接种培养。
或者，外植体还可选自无菌环境中的茎节段或茎顶端或活体无菌苗，并直接用于接种培养中。
2.外植体的接种培养——即绿玉树不定芽的诱导不定芽分化培养基是指能诱导茎节段或茎的顶端外植体分化成不定芽的培养基，外植体在这种培养基中经过10～20天培养便可得以诱导芽分化。具体过程是将外植体接入培养基中培养，培养基为MS基本培养基，固体或半固体，加入了0.7％～1.0％的琼脂或0.8％～2.0％的明胶或在液体培养基中直接加入固体颗粒(玻璃珠、珍珠岩、蛭石等材料)，附加0.5～1.0mg/L的玉米素(ZT)和0.01～0.1mg/L的萘乙酸(NAA)，或0.1～1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)和0.01～0.1mg/L的萘乙酸(NAA)，优选激素范围是3/4MS+ZT0.5mg/L+NAA0.02mg/L和1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.02mg/L，诱导率80％以上，培养条件为光照强度为800～1600LX，每日光照时间为10～16小时，培养温度在18～26度。经过10～20天的培养便可诱导不定芽的产生。
3.丛生芽的诱导丛生芽诱导培养基是指能诱导已分化的不定芽形成丛生芽的培养基，外植体在这种培养基中经过25～30天的培养便可得以诱导丛生芽产生。具体过程是将生长良好的1～3cm高的不定芽接入MS基本培养基(同上)，0.5～2.0mg/L的玉米素(ZT)、0.01～0.1mg/L的萘乙酸(NAA)以及0.01～0.1mg/L的赤霉素(GA3)，优选激素范围是MS+ZT0.5mg/L+NAA0.05mg/L+GA0.05mg/L。培养条件同上。经过15～25天的培养，可使不定芽诱导为丛生芽，增殖系数可达4.5以上。
4.生根培养并获得无菌试管苗生根培养基是指能诱导具有带分化芽的茎段生根并形成完整植株的培养基，带分化芽的茎段在这种培养基中经过15～20天培养后得以诱导生根、形成无菌苗。具体过程是将芽接入1/2MS基本培养基(同上)，附加0.05～0.5mg/L的萘乙酸(NAA)或0.1～1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)，优选激素范围是NAA0.4mg/L，IBA0.2mg/L。在这种培养基中经过10～20天培养，分化芽的茎段便可生根(生根率达到90％)，形成无菌苗。
5.炼苗并移栽试管苗等生根后的无菌苗长到1～3cm高时，打开培养瓶盖子继续培养4～8天，用镊子小心地取出幼苗，用自来水洗净残余培养基后，栽于由等体积的腐质土、河沙和珍珠岩配制的并且事先灭菌的基质中，置于培养室、温室、室外相继培养至成活，成活率达70％。
所使用的培养基的组分如表1
表1 培养基的组分
与现有技术相比，以上发明具有以下突出优点1.本发明提供的绿玉树扦插和组织培养的快速繁殖方法，可以不受季节的影响，大幅度提高植物繁殖系数(成活率达75％以上)，在短时间内获得大量优质绿玉树种苗。
2.有利于绿玉树的耐寒品种的筛选和定向选育。
3.为规模化发展绿玉树提供大批量优质种苗。该技术的实施推广，将对生态、经济以及能源方面产生积极影响。
附图1通过绿玉树组织快繁技术获得的试管苗。
附图2通过绿玉树扦插繁殖技术获得的小苗具体实施方式
实施例一通过扦插绿玉树枝条获得完整绿玉树植株1.选择插穗材料并配制扦插苗床基质插穗材料选自开放带菌环境中的一年生木质化和/或半木质化的绿玉树活体枝条。
将苗床设置在光线好，水源充足的地方，并且扦插床长、宽、深适中(长2～3米、宽1～2米、深30～40厘米)，并事先进行杂草清理等，基质根据表2的比例分别进行配制。
2.激素预处理插穗材料选取健壮的带菌绿玉树活体枝条或健壮的一年生木质化和/或半木质化的绿玉树活体枝条后，用枝剪剪成10～20cm长的小段，将小段基部浸泡在激素溶液中进行处理1小时；3.将插穗材料扦插于扦插苗床基质将激素预处理插穗材料，以20根/m2的密度扦插于苗床上，在第一次喷透水后进行苗期管理，扦插25～30天后，插穗生根形成完整植株。
4.苗期管理扦插结束后，根据天气变化和土壤情况进行包括喷水施肥、除草除虫、修剪枝条在内的常规苗期管理。最后统计存活率，结果如表2所列。
表2 扦插成活率(成活率＝扦插成活的植株/扦插枝条总数)
实施例二外植体组织培养快繁获得绿玉树植株以腋芽和顶芽段为外植体，剪切成0.5-1cm的小段。根据前述的方法进行不定芽的诱导，经10天的培养便可诱导不定芽的产生，诱导率可达86-90.6％。然后在丛生芽分化诱导培养基上，经过20天的培养得到丛生芽，增殖系数4.5，有效芽85-91.7％。将丛生芽转入生根培养基上，经过7天的培养开始生根，发育成完整的植株，接种20天生根率达80-95％。
具体结果参见表3表3 外植体组织培养绿玉树植株
权利要求
1.一种大戟科大戟属(Euphorbia)的植物绿玉树(E.tirucalli)的生产方法，所述的绿玉树苗通过在有菌的条件下于大田或在温室大量扦插培育获得，其特征在于包括以下过程(1)选择插穗材料并配制扦插苗床基质插穗材料选自开放带菌环境中的一年生木质化和/或半木质化的绿玉树活体枝条；扦插苗床是由等体积的腐质土和河沙以及珍珠岩，或由等体积的腐质土和河沙，或由等体积的紫色土和河沙，或由等体积的黄土和河沙配制的基质，或单独由河沙或腐质土配制的基质；(2)激素预处理插穗材料选取健壮的带菌绿玉树活体枝条后，用枝剪剪成10～20cm长的小段，将小段基部浸泡在激素溶液中进行处理1～12小时，所述激素选自0.05mg/L～0.15mg/L的生根粉ABT6溶液、或0.1mg/L～0.2mg/L吲哚丁酸溶液中或0.01mg/L～0.2mg/L的萘乙酸溶液；(3)将插穗材料扦插于扦插苗床基质将激素预处理插穗材料，以20根/m2的密度扦插于苗床上，在第一次喷透水后进行苗期管理，扦插25～30天后，插穗生根形成完整植株；(4)苗期管理扦插结束后，根据天气变化和土壤情况进行包括喷水施肥、除草除虫、修剪枝条在内的常规苗期管理。
2.一种大戟科大戟属(Euphorbia)的植物绿玉树(E.tirucalli)的生产方法，所述的绿玉树苗通过温室无菌快速繁殖的组织培育方式大量生产获得，包括预处理或不预处理绿玉树外植体、在分化培养基诱导外植体分化不定芽、不定芽在丛生芽诱导增殖培养基上诱导丛生芽、在生根培养基上诱导丛生芽生根、获得无菌试管苗、炼苗并移栽试管苗的过程，其特征在于(1)所述的不定芽分化培养基是指能诱导茎节段或茎顶端外植体分化成不定芽的培养基，外植体在这种培养基中经过10～20天培养便可得以诱导芽分化，该培养基通过在3/4MS基本培养基中加入0.5～1mg/L的玉米素ZT和0.01～0.1mg/L的萘乙酸，或在1/2MS基本培养基中加0.1～1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤和0.01～0.1mg/L的萘乙酸得以制备；(2)所述的丛生芽诱导培养基是指能诱导已分化的不定芽形成丛生芽的培养基，外植体在这种培养基中经过25～30天的培养便可得以诱导丛生芽产生并得以增殖，该培养基通过在MS基本培养基中加入0.5～2.0mg/L的玉米素ZT、0.01～0.1mg/L的萘乙酸NAA以及0.01～0.1mg/L的赤霉素GA3得以制备；(3)所述的生根培养基是指能诱导具有带分化芽的茎段生根并形成完整植株的培养基，带分化芽的茎段在这种培养基中经过15～20天培养后得以诱导生根并形成无菌苗，该培养基通过在1/2MS基本培养基中加入0.05～0.5mg/L的萘乙酸或0.1～1.0mg/L吲哚丁酸得以制备。
3.根据权利要求2的生产方法，其中外植体选自开放带菌环境中活体植物的茎节段或茎顶端，或选自无菌环境中的茎节段或茎顶端或活体无菌苗；所述的预处理是在对选取的带菌的外植体茎或茎顶端，用自来水反复洗净后，再用15％～25％的聚乙二醇PEG6000浸泡基部3～6小时，再用自来水反复洗净，然后用于消毒和接种培养。
4.根据权利要求3的生产方法，其中消毒是指用自来水反复洗净后，在超净或无菌环境中用70％乙醇处理0～30秒或用5％～10％双氧水处理0～5分钟，无菌水反复冲洗后，再用5％～10％的次氯酸盐溶液或0.1％～1％的氯化汞溶液进行4～10分钟的消毒处理，最后用无菌水反复冲洗以用于接种培养。
5.根据权利要求3或4的生产方法，其中接种培养指培养外植体2～4周后，可产生不定芽，当不定芽长至1～3cm高时，其作为无菌的外植体材料，用于诱导绿玉树丛生芽形成或诱导生根再产生无菌苗。
6.根据权利要求3或4的生产方法，其中接种培养是将外植体茎节或茎顶端经无菌培养直接产生无菌苗。
7.根据权利要求3或4的生产方法，其中接种培养是将消毒处理过的外植体接种到MS或经MS改良的固体或半固体培养基上进行光照控温培养。
8.根据权利要求7的生产方法，其中光照控温培养是在800～1600LX的光照强度、10-16小时的日光照时间以及18～26℃的条件下进行培养。
9.根据权利要求7的生产方法，其中固体培养基中加入了0.7％～1.0％的琼脂或0.8％～2.0％的明胶或在液体培养基中直接加入固体颗粒，固体颗粒由玻璃珠、珍珠岩或蛭石材料制成。
10.根据权利要求2的生产方法，其中炼苗移栽是当生根后的小植株长到1～3cm高时，打开培养瓶盖子继续培养4～8天，用镊子小心地取出幼苗，用自来水洗净残余培养基后，移栽于由腐质土、河沙和珍珠岩按等体积配制的并且事先灭菌的基质中，置于培养室或温室中相继培养至成活。
全文摘要
提供了一种通过扦插繁殖获得绿玉树植株的方法，包括选择插穗材料并配制扦插苗床基质、激素预处理插穗材料、将插穗材料移栽于扦插苗床基质、苗期管理的过程，其中插穗材料通过生根粉、IBA或NAA浸泡预处理再进行培植，所需时间25～30天，生根率可达80％以上。还提供一种通过组织培养快速繁殖技术获得大量的绿玉树完整植株的方法，包括预处理或不预处理绿玉树外植体、在分化培养基诱导外植体分化不定芽、不定芽在丛生芽增殖培养基上诱导丛生芽、在生根培养基上诱导丛生芽生根、获得无菌试管苗、炼苗并移栽试管苗的过程。其中根据不同阶段添加不同浓度的ZT、6－BA、NAA、IBA或GA
文档编号A01H4/00GK1806512SQ20051012807
公开日2006年7月26日 申请日期2005年11月25日 优先权日2005年11月25日
发明者蒋丽娟, 李昌珠, 李培旺, 孙友平, 张良波, 肖志红 申请人:湖南省林业科学院