专利名称：糖蜜草固氮螺菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内生固氮新菌株，尤其涉及一种耐酸、高固氮酶活性内生固氮细菌新种(Azospirillum melinis TMCY 05519)及其应用。
背景技术：
糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv.)是热带地区的一种优良牧草，它能在酸性和贫瘠的土壤上作为先锋植物种植。
内生固氮菌是一类具有固氮能力的微生物，它的主要宿主是非豆科作物。人们在研究内生固氮菌时发现某些菌类能提供植物高达80％的氮量。发掘内生固氮菌的资源已成为非豆科作物高效利用生物固氮战略的主攻方向之一。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的旨在提供具有耐酸、高固氮酶活性的内生固氮菌株及其应用。
(二)技术方案本发明通过采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，对生长于珠海酸性土壤的糖蜜草根、茎、叶中的内生固氮菌进行分离、纯化，得到固氮螺菌属的一个新种，经过研究发现它具有耐酸、高固氮酶活性，可作为接种剂促进糖蜜草及禾本科作物生长。
本发明所述的糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis TMCY 05519)已于2005年12月26日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1580。
本发明糖蜜草固氮螺菌具有如下形态和生理、生化特性a、菌体形态特性糖蜜草固氮螺菌的细胞为革兰氏阴性菌，杆状或卷曲，大小为(0.7-0.8)×(1.0-1.5)μm。
b、菌落形态特性在Nfb固体培养基平板上培养72h后，菌落形态为圆形或圆锥状，表面光滑呈粘液状，边缘整齐，透明，菌落大小为2-3mm。
c、主要生理生化特性兼性厌氧，能在以糊精、D-纤维二糖、龙胆二糖、m-肌醇、麦芽糖、松二糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄醛酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天氡酰氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、D-丝氨酸、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、D-甘露糖、D-棉子糖、L-棉子糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-丙氨酸、丙三醇、吐温40、乳果糖、蔗糖、β-羟基苯乙酸、奎尼酸、吐温80、D，L-乳酸、L-丝氨酸作为唯一碳源的培养基上生长，不能在以赤藻糖醇、木糖醇为碳源的培养基上生长。
该菌株的16S rDNA序列如SEQ1所示。
本发明糖蜜草固氮螺菌的分子分类地位的确定采用细菌16S rDNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank进行比对，结果发现本发明的糖蜜草固氮螺菌属于固氮螺菌属，与产脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)模式菌株DSM 1691有97.5％的相似性。SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱分析表明，本发明的糖蜜草固氮螺菌TMCY 05519与产脂固氮螺菌DSM 1691存在着较大差异。进一步的DNA/DNA杂交结果表明糖蜜草固氮螺菌TMCY 05519与产脂固氮螺菌DSM 1691的DNA同源性为55.6％，G+C％为68.7％。
结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析、SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱、IS-PCR指纹图谱分析和DNA/DNA杂交结果，本发明的糖蜜草固氮螺菌应归属于固氮螺菌属(Azopsirillum sp.)，是该属的一个新种，命名为糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis)。其判断参考如下文献Ben Dekhil S，et al.Syst Appl Microbiol，1997，2072-77；Eckert B，et al.，Int J Syst Evol Microbiol，2001，5117-26；Khammas K M，Researchin Microbiology，1989，140679-694；Krieg N R，Dobereiner J，GenusAzospirillum In Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，1，1984，pp.94-104；Reinhold B，et al.International Journal of Systematic Bacteriology，1987，3743-51；Sly L I，Stackebrandt E，Int J Syst Bacteriol，1999，49541-544；Tarrand J J，Canadian Journal of Microbiology，1978，24967-980；Xie C H，Yokota A，Int J Syst Evol Microbiol，2005，551435-1438.
本发明菌种的分离纯化方法如下将生长于珠海酸性土壤的新鲜糖蜜草样本用蒸馏水洗净，然后剪下根、茎、叶并分别置于已灭菌的三个培养皿中，用3％的双氧水(H2O2)浸泡4min(以除去根、茎、叶表面的腐烂物质)，无菌水洗涤一次，再用0.1％的升汞(HgCl2)浸泡5min，无菌水中振动洗涤5-7次，每次5-10min，并将最后一次洗涤液涂布于固休培养基，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的根、茎、叶用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5mlNfb半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28℃的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，向管内注入1/10体积10％乙炔气体(终浓度为1％)，在相同条件下再培养24h，测定其固氮酶活性(乙炔还原法)。将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，以检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态及确定纯化与否。
Nfb培养基构成malic acid(苹果酸)5.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，CaCl20.02g/L，0.5％ bromthymolblue 2.0mL/L(先溶解在0.2N KOH溶液中)，vitamin solution(维生素液)1.0mL/L，micronutrient solution(微量元素液)2.0mL/L，1.64％ Fe-EDTAsolution 4.0mL/L，KOH 4.5g/L，pH＝6.8。其中vitamin solution(维生素液)组成为biotin(生物素)100.0mg/L，pyridoxol-HCl(盐酸吡哆醇，维生素B6)200.0mg/L；micronutrient solution(微量元素液)组成为CuSO40.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.12g/L，H2BO31.4g/L，Na2MoO4·2H2O 1.0g/L，MnSO41.5g/L(固体培养基中加入1.7％的琼脂，半固体培养基中加入0.15-0.25％的琼脂)。
本发明的菌种可作为接种剂以促进糖蜜草及禾本科作物生长。如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，菌数达2.5×109，CFU.mL-1，用蛭石作载体。将糖蜜草固氮螺菌液与蛭石(2∶1)混合，制备成菌数达1-2×109CFU.g-1的菌剂。
(三)有益效果本发明为酸性、贫瘠土壤的先锋植物-糖蜜草提供了一种优良的接种剂，它来源于糖蜜草植物组织中，明显促进糖蜜草的生长和提高糖蜜草对酸性土壤的耐受性，可防止使用化肥进一步使土壤酸化、不利于植物生长。
本发明所述的糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis TMCY 05519)已于2005年12月26日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1580。
具体实施例方式
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地理解本发明，但下述实施例不是对本发明的限定。
实施例1将采集的生长于珠海酸性土壤的新鲜糖蜜草样本用蒸馏水洗净，然后剪下根、茎、叶并分别置于已灭菌的三个培养皿中，用3％的双氧水(H2O2)浸泡4min以除去根、茎、叶表面的腐烂物质，无菌水洗涤一次，再用0.1％的升汞(HgCl2)浸泡5min，无菌水中振动洗涤5次，每次8min。将表面消毒完全的根、茎、叶用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5mlNfb半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28℃的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，向管内注入1/10体积10％乙炔气体(终浓度为1％)，在相同条件下再培养24h，测定其固氮酶活性(乙炔还原法)。将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态，并确定已纯化。
实施例2将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，与蛭石以1∶2重量比混合(如1升培养液混合2公斤蛭石)制成固氮螺菌-蛭石接种剂。预先将土壤pH值调整为4.0、5.0、6.0、7.0，将固氮螺菌-蛭石接种剂与糖蜜草种子1∶1拌种后播种。90天后与未接种的对照相比，在土壤pH值5.0、6.0、7.0的盆栽中糖蜜草干重平均增加22％，植株内氮素平均增加15％。而土壤pH值4.0的盆栽中，未接种的糖蜜草叶子呈现枯黄，接种的糖蜜草叶子呈现正常的绿色，干重增加30％，植株内氮素平均增加20％，表明糖蜜草固氮螺菌提高了糖蜜草对酸的耐受性。
实施例3将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，与蛭石以1∶2重量比混合(如1升培养液混合2公斤蛭石)制成固氮螺菌-蛭石接种剂。将固氮螺菌-蛭石接种剂与水稻种子1∶1拌种后播种。20天后与未接种的对照相比，盆栽中水稻干重平均增加10％，植株内氮素平均增加10％。
序列表<110>华南农业大学<120>SEQ1<130>糖蜜草固氮螺菌及其应用<160>1<170>Patent In version 3.3<210>1<211>1414<212>rDNA<213>Azospirillum melinis<400>1ctggcggcat gcctaacaca tgcaagtcga acgaaggctt cggccttagt ggcgcacggg60tgagtaccac gtgggaacct gcctttcggt tcggaataac gtcgggaaac ggacgctaac120accggatacg cccttggggg gaaagttcac gccgagagag gggcccgcgt cggattaggt180agttggggag gtaatggctc accaagcctt caatccgtag ctggtctgag aggatgatca240cccacactgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg300gacaatgggc gcaagcctga tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt360aaagctcttt cgcacgcgac gatgatgacg gtagcgtgag aagaagcccc ggctaacttc420gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa480gggcgcgtag gcggcctgtt tagtcagaag tgaaagcccc gggctcaacc tgggaatagc540ttttgatact ggcaggcttg agttccggag aggatggtgg aattcccagt gtagaggtga600aattcgtaga tattgggaag aacaccggtg gcgaaggcgg ccatctggac ggacactgac660gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta720aacgatgaat gctagacgtc ggggtgcatg cacttcggtg tcgccgctaa cgcattaagc780attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca840caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc aacccttgac900atgtccacta tgggcttgag agatcgcgtc cttcggttcg gccgggtgga acacaggtgc960tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa1020
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1.糖蜜草固氮螺菌菌株(Azospirillum melinis TMCY 05519)，保藏号为CGMCC No.1580，其特征在含有如SEQ1所示的16S rDNA序列。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于具有如下形态和生理、生化特性a、菌体形态特性糖蜜草固氮螺菌为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状或卷曲，大小为(0.7-0.8)×(1.0-1.5)μm；b、菌落形态特性在Nfb固体培养基平板上培养72h后，菌落形态为圆形或圆锥状，表面光滑呈粘液状，边缘整齐，透明，菌落大小为2-3mm；c、生理生化特性兼性厌氧，能在以糊精、D-纤维二糖、龙胆二糖、m-肌醇、麦芽糖、松二糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄醛酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天氡酰氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、D-丝氨酸、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、D-甘露糖、D-棉子糖、L-棉子糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-丙氨酸、丙三醇、吐温40、乳果糖、蔗糖、β-羟基苯乙酸、奎尼酸、吐温80、D，L-乳酸、L-丝氨酸作为唯一碳源的培养基上生长，不能在以赤藻糖醇、木糖醇为碳源的培养基上生长。
3.如权利要求1或2所述的菌株，为糖蜜草固氮螺菌(Azospirillummelinis)CGMCC No.1580。
4.一种接种剂，其特征在于含有权利要求1-3任一所述的菌株。
5.一种促进糖蜜草及禾本科作物生长的方法，其包括步骤a.将权利要求1-3任一所述的菌株制成接种剂；b.将接种剂用于种植糖蜜草及禾本科作物的pH4.0-10.0的土壤中。
全文摘要
本发明提供了菌株糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis TMCY05519)，保藏号为CGMCC No.1580。它是采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，对生长于珠海酸性土壤的糖蜜草根、茎、叶中的内生固氮菌进行分离、纯化得到的，具有耐酸、高固氮酶活性，可作为接种剂促进糖蜜草及禾本科作物生长。
文档编号A01N63/00GK1810953SQ20061001140
公开日2006年8月2日 申请日期2006年3月1日 优先权日2006年3月1日
发明者谭志远, 彭桂香, 王华荣, 张国霞, 侯伟 申请人:华南农业大学