专利名称：聚－γ－谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，属于微生物肥料应用领域。
背景技术：
化肥是农业发展史上一次重大变革，它极大地提高了农作物的产量，缓解了全球的粮食紧张局面。我国化肥消费量每年达4000多万吨，占世界化肥总消费量的30％，但当季利用率氮为30％-35％，磷为10％-25％，钾为35％-50％，据统计，我国130多个大中型湖泊已有60多个遭遇富营养化问题，根本原因在于过量氮、磷的迁移。因此当今肥料营养问题已不再是营养的获得而是营养的利用。大量的肥料流失不仅增加了农业成本，造成巨大的经济损失，而且造成了环境污染，导致农业生态系统的失衡，对环境和可持续发展带来越来越大的负面影响，例如，土壤板结盐碱化，地下水硝酸盐含量升高，地表水富营养化，大气臭氧层遭受破坏，农作物品质下降，温室效应和环境污染加重等负效应，严重地影响了人类的健康，在不影响农业丰收的前提下如何减少肥料用量，提高肥料利用率，减少污染，成了科技工作者关注的热点之一。所以开发肥料养分吸收促进剂成为现今迫切需要解决的重要问题。
聚合氨基酸可增加植物对营养的吸收，节约肥料使用量，提高作物产量。目前已作为肥料促进剂的聚合氨基酸是聚天冬氨酸(poly-aspartic acid，PAA)。美国Donlar公司率先利用化学合成即热聚合方法生产TPA(Thermal polyaspartate)，已工业化和商品化，并应用于肥料。TPA是肥料促进剂产品Amisorb中的活性成分，由于TPA含有众多的游离羧基，对肥料中的营养素有较大的亲和力，可加速根的形成，增加分蘖，Amisorb亦被证明可应用于小麦、玉米、大豆等作物，具有增加产量、节约肥料使用量、提高作物品质的作用。但该促进剂的生物降解性能还不尽理想。
聚-γ-谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid，聚-γ-谷氨酸)是自然界中微生物发酵产生的阴离子型多聚氨基酸，聚-γ-谷氨酸的水溶性、吸水性、生物可降解性、对金属离子的亲和性、无毒、抗冻、对环境友好和对蛋白酶的抗性等特点使它在农业、食品、医药、化妆品、纤维轻化工等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于扩大聚-γ-谷氨酸应用范围，作为一种生物可降解型肥料吸收促进剂，聚-γ-谷氨酸能够节省肥料，减少由于肥料的过分使用对环境造成的污染，提高农作物的产量与品质。
实现本发明的技术方案为所述的聚-γ-谷氨酸由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每一个重复单元的α-碳原子还有一个游离的羧基，平均分子量10,000-10,000,000道尔顿。
所述的聚-γ-谷氨酸用于氮(N)、磷(P)、钾(K)单一元素或其组合使用的肥料吸收促进剂。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂可为聚-γ-谷氨酸液态发酵制品，或者为固态发酵的含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
聚-γ-谷氨酸的液体发酵生产方式可采用专利ZL03118908.3中的液体发酵法生产。
固态发酵的含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥通过固态发酵的方式生产，以猪粪或奶牛粪为主要原料，按一定比例添加豆粕、麸皮、谷氨酸和柠檬酸等辅料，采用菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilisCCTCC202048)接种，室外堆积发酵生产含肥料吸收促进剂(聚-γ-谷氨酸含量10％-12％)的生物有机肥。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括水培发芽3d后，将标准营养液(Ca(NO3)2·4H2O 945mg/L，KNO3809mg/L，(NH4)H2PO4153mg/L，MgSO4·7H2O 493mg/L，H3BO32.86mg/L，MnSO4·4H2O 2.13mg/L，ZnSO4·7H2O 0.22mg/L，CuSO4·5H2O 0.08mg/L，Fe-EDTA 30mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02mg/L)稀释4倍后，浇施培养；7d后，将所用标准营养液稀释2倍浇施培养；二叶一心期时，选取均匀一致的幼苗移栽到水培黑色塑料盆钵(φ7cm×15cm)中。每钵加400mL标准营养液并溶解4-40mg的聚-γ-谷氨酸肥料促进剂。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括灌根将不同作物正常施用量的三元复合肥和聚-γ-谷氨酸混合溶解在水中。作物定植后，在作物生长适当的时期灌根，聚-γ-谷氨酸灌根量为10-50g/666平方米(亩)。
所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括叶面喷施将不同作物正常施用量的三元复合肥和聚-γ-谷氨酸混合溶解在水中。在作物生长适当的时期喷施叶面，聚-γ-谷氨酸喷施量为10-50g/666平方米。
种植的农业作物包括蔬菜、谷物、大豆及烟叶、茶叶、中药材等经济作物。
本发明的有益效果在于(1)生物降解聚-γ-谷氨酸是微生物合成的由D型和L型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，可被土壤中微生物降解。与TPA相比具有更大的环保价值；(2)在保证植物生长正常的情况下，每666平方米施用肥料促进剂10克至50克，可减少化学肥料正常施用量10-30％，降低了成本；(3)在植物正常的化学肥料施用量的基础上，每666平方米施用肥料促进剂10克至50克，可提高作物的产量，增产10-30％以上，提高了效益；(4)改善了作物的品质，提高了作物中N、P、K的含量；扩大聚-γ-谷氨酸应用范围。
具体实施例方式
实施例1固态发酵生产聚-γ-谷氨酸聚-γ-谷氨酸也可通过固态发酵的方式生产，本发明以猪粪或奶牛粪为主要原料，按一定比例添加豆粕、麸皮、谷氨酸和柠檬酸等辅料，采用专利菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis CCTCC202048)接种，室外堆积发酵生产含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
固体发酵方法如下1)制备种子液将菌株进行活化，然后将活化好的菌株接种于种子液培养基中，该培养基的组分及其配比如下牛肉膏10.0g，蛋白胨5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.4。种子的培养条件及方法是30℃培养4.5h，取生长至对数中期(OD600nm＝1.4)的菌株为生产用菌种。
2)制备用于扩大培养的固体发酵培养基该培养基包括下列成分(重量/重量计，w/w)配方一新鲜猪粪62.5％，黄豆饼粉25.0％，麦麸5.0％，谷氨酸5.0％，柠檬酸2.5％；补充水份至培养基的含水量60％，调整pH9.0。
配方二56.32％新鲜奶牛粪，23.35％黄豆饼粉，16.08％麦麸和4.25％谷氨酸，补充水份至培养基的含水量60％，调整pH9.0。
3)将步骤1)培养好的种子液接种于步骤2)所述的培养基中进行发酵；4)发酵生产的工艺条件发酵容器装料量10-30％，接种量8％，初始pH9.0，培养温度40℃，通风发酵48h；最终得到聚-γ-谷氨酸含量5％-6％(配方一6％；配方二5％)的固态发酵产物。
5)将步骤4)得到的发酵产物在80℃条件下干燥，使其水分含量低于5％，即为固态发酵含10％-12％聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
实施例2聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对营养钵栽培小白菜茎叶的养分积累实验步骤选择饱满一致的小白菜种子(品种为上海青)发芽。发芽3d后，将标准营养液(配方见发明内容第三条)稀释4倍后，浇施培养；7d后，将标准营养液稀释2倍后，浇施培养；二叶一心期时，选取均匀一致的幼苗移栽到水培黑色塑料盆钵(7cm×15cm)中，分为4大组，一组每钵加400mL标准营养液，其余各组的营养素依次将标准营养液稀释2倍、4倍和8倍，每一大组再分为5小组，分别加入聚-γ-谷氨酸，每小组聚-γ-谷氨酸的终浓度分别为0、50mg/kg、100mg/kg，每钵栽植4株幼苗，试验设10次重复，随机排列。每周更换营养液1次，同时加入对应浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)，经常调换营养钵位置，5-7叶期时收获幼苗茎叶烘干称重，消化后采用半微量凯氏定氮法测全氮；P、K的测定采用美国VARIAN公司生产的VISTA-MPX型ICP-OES。
实验结果如下表1不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对小白菜茎叶中钾积累的影响(％)(钾在小白菜茎叶中含量的重量比)
表2不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对小白菜茎叶中磷积累的影响(％)(磷在小白菜茎叶中含量的重量比)
表3不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对小白菜茎叶中氮积累的影响(％)(氮在小白菜茎叶中含量的重量比)
实验结果表明在营养液中添加聚-γ-谷氨酸，有利于K、P、N元素在小白菜茎叶中的积累。
实施例3聚-γ-谷氨酸灌根(平均分子量10000千道尔顿)对盆栽小白菜产量的影响试验处理设不加聚-γ-谷氨酸和加不同浓度的聚-γ-谷氨酸(25mg/kg土、50mg/kg土、100mg/kg土、200mg/kg土、400mg/kg土)，共6组，底肥的营养元素施用量设4组，一组为1kg土施氮0.20g、磷0.065g、钾0.16g，肥料种类分别为市售商品化肥尿素、过磷酸钙、氯化钾，其余各组的营养素依次减为原来的75％、50％、33％。
实验步骤将肥料溶于水与聚-γ-谷氨酸(平均分子量1000千道尔顿)溶液混合，每盆称土1kg，将其与以上肥料混匀后装盆，共24组实验，重复3次。每盆分别播种供试小白菜(品种为上海青)均匀饱满的种子15粒，在其生长到二叶一心期时定植10株，不定期浇水。于小白菜7-9叶期时收获幼苗，取地上部分在70℃下烘干称重。
实验结果见表4。
表4不同浓度聚-γ-谷氨酸(平均分子量10000千道尔顿)对小白菜产量的影响(盆栽试验)单位g
结果显示当肥料浓度为100％时，加入25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg聚-γ-谷氨酸比对照分别增产3％、10％、13％、15％和13％；当肥料浓度为原浓度的33％、50％、75％和100％时，加入100mg/kg聚-γ-谷氨酸比对照分别增产33％、31％、22％和13％，加入200mg/kg聚-γ-谷氨酸与对照相比分别增产53％、43％、24％和15％，这个实验再次说明聚-γ-谷氨酸(平均分子量10000千道尔顿)可以促进小白菜的生长，在肥料较缺乏的时候，聚-γ-谷氨酸对小白菜增产效果尤为明显。当加入200mg/kg的聚-γ-谷氨酸时，50％肥料浓度的小白菜生长量与100％肥料浓度的生长量几乎相当，这说明在合适的情况下，聚-γ-谷氨酸可节约将近50％的肥料。
实施例4聚-γ-谷氨酸(平均分子量10千道尔顿)灌根试验对田间小区栽培小白菜产量的影响实验区域面积在面积为2.0m×5.0m的田地里进行，实验步骤选取均匀饱满小白菜种子(品种为上海青)，均匀播种，在其生长到二叶一心期时定植，株间保持10cm间距，不定期浇水。定植10d后灌根1次，40mL/株。定植18d后喷施1次，10mL/株，聚-γ-谷氨酸(平均分子量50千道尔顿)喷施量为灌根量的1/4。3个重复，区组随机排列。于7-9叶期时收获幼苗，取地上部分称鲜重。
试验设3个处理聚-γ-谷氨酸溶液施用浓度为0、100mg/l和300mg/l。
实验结果见表5。表5不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量10千道尔顿)灌根对小白菜产量的影响
结果显示加100mg/l和300mg/l的聚-γ-谷氨酸(平均分子量10千道尔顿)分别比对照增产33.50％和32.94％。在田间试验中选用100-300mg/l浓度的聚-γ-谷氨酸溶液灌根较为合适。
实施例5平均分子量200千道尔顿的聚-γ-谷氨酸叶面喷施对田间小区小白菜产量的影响为了与实际大田实验情况相接近，本实验采用田间小区(2.0m×5.0m)实验，常规施肥为1kg土施氮0.20g、磷0.065g、钾0.16g，肥料种类分别为市售商品化肥尿素、过磷酸钙、氯化钾，采取聚-γ-谷氨酸水溶液叶面喷洒的方式，通过不同的处理得到的数据来统计分析聚-γ-谷氨酸叶面喷施对植物生状况的影响。
实验处理1、常规施肥，清水浇灌(空白对照)；2、常规施肥，用40mg/L的聚-γ-谷氨酸溶液叶面喷施一次，喷施量200L/666平方米，计聚-γ-谷氨酸用量5g/666平方米；3、常规施肥，用60mg/L的聚-γ-谷氨酸溶液叶面喷施一次，喷施量200L/666平方米，计聚-γ-谷氨酸用量25g/666平方米；4、常规施肥，用80mg/L的聚-γ-谷氨酸溶液叶面喷施一次，喷施量200L/666平方米，计聚-γ-谷氨酸用量50g/666平方米；实验结果见表6表6聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)叶面喷施对植物生长状况的影响
通过以上实验，小白菜在不同浓度聚-γ-谷氨酸叶面喷施的情况下，增产效果随聚-γ-谷氨酸添加量的增加而增加，叶面积增大，颜色更加浓绿，说明了聚-γ-谷氨酸叶面喷施对植物生长状况具有极大的促进作用。
实施例6含聚-γ-谷氨酸(平均分子量2000千道尔顿)发酵猪粪作为底肥对田间小区栽培小白菜产量的影响实验处理在小区试验面积为4.0m×5.0m，施肥量为300g干重/m2田地中，将猪粪发酵肥料和猪粪未发酵肥料风干后施肥，底肥的施用设计如下表。
表7底肥的施用设计
实验步骤选取均匀饱满小白菜种子(品种为上海青)，均匀播种，在其生长到二叶一心期时定植，株间保持间距10cm，不定期浇水。于小白菜7-9叶期时收获，取地上部分称鲜重。实验结果见表8。
表8底肥中不同浓度的聚-γ-谷氨酸(平均分子量2000千道尔顿)对小白菜产量的影响
肥料II(含100mg/kg聚-γ-谷氨酸)、肥料III(含300mg/kg聚-γ-谷氨酸)分别比肥料I(对照)增产31.56％和39.57％。该实验说明了聚-γ-谷氨酸对小白菜的增产有显著影响。
实施例7玉米大喇叭口期尿素中施加聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)对玉米田间产量的影响实验设计1、处理设四个处理A、每666平方米施尿素15斤；B、每666平方米施尿素15斤+10g聚-γ-谷氨酸；C、每666平方米施尿素30斤；D、每666平方米施尿素30斤+10g聚-γ-谷氨酸；2、面积每个小区64平方米，每个小区设4行，每行长16米，宽1米。
3、施肥时间6月23日(玉米大喇叭口期)
4、施用方法尿素+聚-γ-谷氨酸用水溶化后混合淋施。
实验结果见表9。
表9聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)灌根施用对玉米产量的影响
实验结果分析1、聚-γ-谷氨酸在低施肥水平下增产明显，增产12.3％；2、聚-γ-谷氨酸在高施肥水平下增产不明显，仅增2.9％；实施例8聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)在烟草栽培上对其保肥增效作用实验步骤烟草生育期分为团棵期、旺长期、成熟期三个时期，在基肥追肥并施的实际生产基础上，分别在三个不同生长阶段灌根施用不同量聚-γ-谷氨酸。666平方米施纯氮12.5kg，纯氮钾磷比为1∶1∶2。底肥施用量50％氮肥、50％钾肥及100％磷肥；底肥种类N、P、K三元复合肥+过磷酸钙+硫酸钾；追肥种类硝酸铵、硫酸钾。
实验结果见表10。
表10聚-γ-谷氨酸(平均分子量200千道尔顿)在烟草栽培上对烟叶产量的影响
总体而言，团棵期施用聚-γ-谷氨酸灌根，增产效果较佳，其中10g/666平方米的施用量效果最佳，较对照高出25.5kg，增产率达15.9％；旺长期和成熟期灌根无增产效果。从聚-γ-谷氨酸在团棵期灌根的浓度看，烟叶产量、产值都随聚-γ-谷氨酸的浓度增加而渐次增强。
权利要求
1.聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的聚-γ-谷氨酸由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu)通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每一个重复单元的α-碳原子还有一个游离的羧基，平均分子量10,000-10,000,000道尔顿。
2.按权利要求1所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的聚-γ-谷氨酸用于氮、磷、钾单一元素或其组合使用的肥料吸收促进剂。
3.按权利要求1或2所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂为聚-γ-谷氨酸液态发酵制品，或者为固态发酵的含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
4.按权利要求1或2所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括水培发芽3d后，将标准营养液稀释4倍后，浇施培养；7d后，将所用标准营养液稀释2倍浇施培养；二叶一心期时，选取均匀一致的幼苗移栽到ф7cm×15cm水培盆钵中；每钵加400mL标准营养液并溶解4-40mg的聚-γ-谷氨酸肥料促进剂。
5.按权利要求1或2所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括灌根将不同作物正常施用量的三元复合肥和聚-γ-谷氨酸混合溶解在水中；作物定植后，在作物生长适当的时期灌根，聚-γ-谷氨酸灌根量为10-50g/666平方米。
6.按权利要求1或2所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的聚-γ-谷氨酸肥料吸收促进剂的应用方法包括叶面喷施将不同作物正常施用量的三元复合肥和聚-γ-谷氨酸混合溶解在水中；在作物生长适当的时期喷施叶面，聚-γ-谷氨酸喷施量为10-50g/666平方米。
7.按权利要求1或2所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于种植的农业作物包括蔬菜、谷物、大豆及经济作物。
8.按权利要求3所述的聚-γ-谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，其特征在于所述的含聚-γ-谷氨酸的生物有机肥固体发酵方法如下1)制备种子液将菌株进行活化，然后将活化好的菌株接种于种子液培养基中，该培养基的组分及其配比如下牛肉膏10.0g，蛋白胨5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4。种子的培养条件及方法是30℃培养4.5h，取生长至对数中期(OD600nm＝1.4)的菌株为生产用菌种；2)制备用于扩大培养的固体发酵培养基该培养基包括下列成分按重量/重量计配方一新鲜猪粪62.5％，黄豆饼粉25.0％，麦麸5.0％，谷氨酸5.0％，柠檬酸2.5％；补充水份至培养基的含水量60％，调整pH9.0；配方二56.32％新鲜奶牛粪，23.35％黄豆饼粉，16.08％麦麸和4.25％谷氨酸，补充水份至培养基的含水量60％，调整pH9.0；3)将步骤1)培养好的种子液接种于步骡2)所述的培养基中进行发酵；4)发酵生产的工艺条件发酵容器装料量10-30％，接种量8％，初始pH9.0，培养温度40℃，通风发酵48h；最终得到聚-γ-谷氨酸含量5％-6％的固态发酵产物；5)将步骤4)得到的发酵产物在80℃条件下干燥，使其水分含量低于5％，即为固态发酵含有10％-12％聚-γ-谷氨酸的生物有机肥。
全文摘要
本发明涉及聚－γ－谷氨酸作为肥料吸收促进剂在农业种植中的应用，所述的聚－γ－谷氨酸由D型谷氨酸(D－Glu)和L型谷氨酸(L－Glu)通过α－氨基和γ－羧基以肽键形式形成的高分子聚合物，在每一个重复单元的α－碳原子还有一个游离的羧基，平均分子量10－10,000千道尔顿。用于氮、磷、钾单一元素或其组合使用的肥料吸收促进剂。本发明的有益效果在于可被土壤中微生物降解，与TPA相比具有更大的环保价值；在保证植物生长正常的情况下，每亩施用肥料促进剂10克至50克，可减少化学肥料正常施用量10－30％，提高作物的产量10－30％以上，同时改善了作物的品质，提高了作物中N、P、K的含量。
文档编号C05G3/00GK1827560SQ20061001839
公开日2006年9月6日 申请日期2006年2月22日 优先权日2006年2月22日
发明者陈守文, 喻子牛, 陈雄, 蔡皓, 柯云, 孙明, 何进 申请人:华中农业大学