专利名称：一种毒杀松材线虫的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毒杀松材线虫的化合物及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是一种对松属等针叶植物危害极大的有害生物，是我国禁止入境的检疫害虫。由松材线虫引起的松材线虫病是世界上最具危险性的森林病害之一，是松树的一种毁灭性流行病害，具有致病力强，致死速度快的特点。目前松材线虫的防治方法主要包括化学防治、抗病育种、防治传媒昆虫天牛以及病死木的处理等，但效果均不明显或有局限性。因此，研究开发高效低毒的杀松材线虫剂受到普遍的关注。
三瓣木兰(Magnolia tripetala L.)属木兰科(Magnoliaceae)、木兰属(Magnolia)植物，为多年生木本植物，原产美国东南部，适于潮湿、微酸性、富含有机质的土壤生长。和厚朴酚化合物系首次是从木兰科植物厚朴(Magnolia officinalia)树皮中分离得到的，药理试验证明，和厚朴酚具有抗菌，抗炎症，抗肿瘤等活性。但目前关于从三瓣木兰(M.tripetala)中分离获得和厚朴酚化合物以及其对松材线虫(B.xylophilus)的毒杀活性尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是从植物提取物中，筛选出对线虫具有良好毒杀活性的化合物，用于开发高效低毒杀线虫剂。
本发明是这样实现的将从中国科学院昆明植物研究所植物园内采集的三瓣木兰(M.tripetala)叶用自来水洗净，经50℃烘箱烘干，碾成粉末，70％乙醇浸提3次，提取液合并过滤浓缩后用水溶解，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后经硅胶柱分离，用石油醚/丙酮梯度洗脱，再经反复凝胶(Sephadex LH-20)柱层析，丙酮洗脱，得到本发明的化合物，该化合物定名为和厚朴酚(honokiol)，结构式为
活性化合物和厚朴酚的结构鉴定无色晶体。C18H18O2，1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ3.33(2H，d，J＝6.6Hz，H-7’)，3.47(2H，d，J＝6.3Hz，H-7)，5.05～5.23(4H，m，H-9，H-9’)，6.08(2H，m，H-8，H-8’)，6.90，6.92(each 1H，d，J＝8.1)，7.03～7.06(2H，m)，7.21～7.26(2H，m)；13C-NMR(CDCl3，125MHz)δ133.1(C-1)，131.1(C-2)，127.5(C-3)，151.7(C-4)，116.5(C-5)，132.1(C-6)，40.3(C-7)，138.7(C-8)，116.5(C-9)，128.3(C-1’)，129.5(C-2’)，130.6(C-3’)，129.7(C-4’)，117.8(C-5’)，154.9(C-6’)，36.1(C-7’)，136.9(C-8’)，117.5(C-9’)。数据与文献报道一致(Yahara et al.，1991；邓世明等，2001)。
本发明的化合物和厚朴酚作为制备杀松材线虫(B.ylophilus)药物的应用。
本发明具有产品成本及产品毒性低、对松材线虫(B.xylophilus)有较好的毒杀作用等优点。
具体实施例方式1、化合物和厚朴酚(honokiol)的分离制备(1)从中国科学院昆明植物研究所植物园采集三瓣木兰叶用自来水洗净，经50℃烘箱烘干，碾成粉末，70％乙醇浸提72小时，提取3次，提取液合并过滤浓缩后用水溶解，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮(9∶1，8∶2，7∶3，2∶1)梯度洗脱；(2)洗脱液经生物活性跟踪检测得活性组分，活性组分浓缩后再次在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮(9∶1)洗脱，洗脱液浓缩经反复凝胶柱层析(20g，Sephadex LH-20；1滴/10秒)，丙酮洗脱；(3)洗脱液进行TLC检测(展开剂石油醚/丙酮，5∶1；碘显色)，将只具有同一个单点的部位合并得浓缩得到化合物和厚朴酚。
2、本发明化合物对松材线虫(B.ylophilus)的药效试验(1)试验及对照用药剂试验用药剂将试验用样品先溶于少量分析纯的有机溶剂丙酮，再加入一定量去离子水分别稀释为200ppm、100ppm、50ppm、25ppm 4个浓度供试药剂。在该药剂中，丙酮的终浓度＜5％。
对照用药剂丙酮溶解于去离子水作为对照，丙酮浓度为5％。
(2)试验用的松材线虫的培养与制备将真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接种到马铃薯培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18-20g，水1000ml)平板上，25℃培养至长满平板，接入一块带有松材线虫(B.xylophilus)的培养基，25℃下培养至菌丝消失，培养基表面有光泽即为线虫长满平板，放入4℃冰箱中备用。
使用时将载有线虫的培养基挑出，放到线虫分离器中，用无菌水将线虫洗出后，离心浓缩，制备成线虫悬液。
(3)活性测定方法将本发明化合物稀释为200ppm、100ppm、50ppm、25ppm浓度供试药液，将药液2ml置于直径为6cm的培养皿中，再加入20ul线虫的悬液，轻轻混匀后将培养皿放置于25℃的培养箱中。分别于12小时、24小时、48小时进行观察，计数死虫数(以线虫僵直不动作为标准，辅以机械刺激，如针尖挑刺等)和总线虫数。每个测试样品设三个重复，计算测试样品对线虫的平均致死率，以平均致死率高低评定样品对线虫的毒力。线虫的死亡率按下面的公式计算
(4)试验结果试样品对松材线虫的毒杀活性结果
结果表明本发明的化合物和厚朴酚对松材线虫(B.xylophilus)有较好的毒杀作用，浓度为100ppm，24小时时松材线虫(B.xylophilus)死亡率达100％，浓度为50ppm，48小时时松材线虫(B.xylophilus)死亡率可达86.5％。
权利要求
1.一种毒杀松材线虫的化合物，其特征在于该化合物分子式为C18H18O2，由下列步骤得到a采集三瓣木兰叶用自来水洗净，经50℃烘箱烘干，碾成粉末，70％乙醇浸提72小时，提取3次，提取液合并过滤浓缩后用水溶解，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮，从9∶1到2∶1进行梯度洗脱；b洗脱液经生物活性跟踪检测得活性组分，活性组分浓缩后再次在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮，按9∶1洗脱，洗脱液浓缩经反复凝胶柱SephadexLH-20层析，丙酮洗脱；c洗脱液进行TLC检测，其展开剂为石油醚/丙酮，按5∶1展开，将只具有同一个单点的部位合并浓缩得到化合物和厚朴酚。
2.权利要求1所述化合物的应用，其特征在于该化合物和厚朴酚作为制备杀松材线虫B.xylophilus药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种毒杀松材线虫的化合物及其应用，属生物农药技术领域。本发明的化合物由植物三瓣木兰(M.tripetala)叶制备得到。该化合物为和厚朴酚(honokiol)，其分子式为C
文档编号A01N31/00GK1907930SQ20061004861
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月11日 优先权日2006年8月11日
发明者张克勤, 洪林军, 李国红 申请人:云南大学