专利名称：一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法
技术领域：
本发明属于植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及烟草黑胫病抗性的鉴定，特别是涉及一种对烟草黑胫病抗性进行苗期鉴定的方法。
背景技术：
烟草黑胫病，俗称“腰烂”、“穿大褂”、“发瘟”、“地下症”等，是一种分布广泛、危害严重的烟草病害。1896年首次发现于印尼的爪哇，1924年以后，全世界温带、亚热带和热带的产烟区都有该病报道，至今只有津巴布韦尚无记载。1950年我国在黄淮烟区首次发现烟草黑胫病。目前，我国平均每年的发病作物面积高达76373hm2，直接经济损失超过1.23亿元人民币。因此，如何提高现有烟草品种的抗病能力，培育出具有高抗病能力的烟草品种，就成为目前该领域研究的热点。
作为品种选育的关键，现有的烟草抗性鉴定方法主要有室内离体叶片接种法和自然诱发抗性鉴定法。室内离体叶片接种法虽然简单易行，但是其鉴定的结果只能反映离体叶片对病害的抗扩展能力，无法反映品种的实际抗性，只能作为抗性划分的参考指标。自然诱发抗性鉴定方法虽然可以反映品种的自然抗病能力，但是该方法易受种植条件和气候的影响，同一品种在不同烟区鉴定的结果会存在较大差异。同时，由于烟草黑胫病对温湿度条件非常敏感，只有在高温、高湿环境下(28～32℃、相对湿度80％以上)才能迅速蔓延。当测试年份间的环境条件不利于病害发生时，该方法无法得到准确地测定结果。
随后出现的大田病圃人工诱发鉴定方法，虽然通过建立病圃，人工定量接种病原菌，模拟自然发病条件等手段提高了测试的准确性，但是依然无法从根本上解决外部环境对鉴定结果的影响。同时，病原菌接种的量及接种时间等因素都会对最终的结果产生影响。因此，该方法还存在鉴定品种及数量有限，鉴定结果易发生波动等问题。而且该方法从育苗到鉴定的完成需要将近195天，鉴定时间过长。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法，用苗期鉴定结果替代传统大田鉴定结果，避免外部环境对鉴定结果的影响，提高烟草黑胫病抗性鉴定的准确性，缩短鉴定时间。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法，包括以下顺序的步骤 1.病原菌分离 在基础培养基中加入利福平原液，制成利福平培养基备用；采集烟草黑胫病症状典型的感病烟茎，取病茎表皮疑病组织数块，切成长1～2cm的小块，置于利福平培养基上，经培养、纯化后得到烟草黑胫病菌丝体，在室温条件下，保存于灭菌蒸馏水中备用； 所述的基础培养基为燕麦培养基。
所述的利福平培养基中利福平原液的体积百分比含量为1.3％。
2.黑胫病接种体的制备 将烟草黑胫病菌丝体移入燕麦培养液中培养5～7天后，转入菌谷培养基上培养18～20天得到黑胫病接种体； 所述的菌谷培养基的制作方法为将谷子浸泡6小时后用清水洗净，淘尽干瘪空壳谷粒，煮至谷粒炸开成半开花状，冷却晾至谷子含水量为50％～60％后分装入三角瓶中，并在115℃下高压灭菌1小时即得； 三角瓶中装入的谷粒量以不超过3/4瓶为宜； 3.病圃设计及管理 将苗龄45～55天的待鉴定烟苗移栽至温室病圃，烟苗在病圃内随机排列，设3次重复，每重复植烟10株，按常规温室管理技术进行管理；以小黄金1025为感病对照，红花大金元为感病辅助对照，金星6007为中抗对照，革新3号为抗病对照； 4.菌谷接种 烟苗移栽5～7天后，将经步骤(2)培养得到的接种体接种至待测烟苗的茎基部，接种量为0.5g/株；接种后立即覆土并灌水15～20cm，保持24～48小时。
5.鉴定与分级 在温室病圃中，分别于接种后的第5天、第7天和第10天各记录一次病指，以三次病指的平均值作为测试品种的抗性指标；进而按国家标准对鉴定品种进行分级。
本发明率先提出一种具有实用价值的烟草黑胫病苗期鉴定方法，实现了用苗期鉴定结果替代传统大田鉴定结果，有效避免外部环境对鉴定结果的影响，提高了烟草黑胫病抗性鉴定的准确性。试验表明，从育苗到鉴定完成只需65天左右，大幅度地缩短了鉴定时间。该方法操作简便，成本低廉，鉴定结果真实可靠，具有良好的市场应用前景。
图1为不同抗性品种接种黑胫病5、7、10天的病指变化趋势图。
具体实施例方式 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的说明，但他们不是对本发明的限定。
实施例1 取医用利福平胶囊21粒加95％乙醇100ml，并加入1NNaOH数滴至溶解，制成3000ug/ml(利福平含量)的利福平原液，置于4℃冰箱中保存。在每150ml燕麦培养基中加入2ml利福平原液混合均匀，制成利福平培养基备用。采集烟草黑胫病症状典型的感病烟茎，取病茎表皮疑病组织数块，切成长1cm的小块，置于利福平培养基上，经培养、纯化后得到烟草黑胫病菌丝体，在室温条件下，保存于灭菌蒸馏水中备用。将谷子浸泡6小时后用清水洗净，淘尽干瘪空壳谷粒，煮至谷粒炸开成半开花状，冷却晾至谷子含水量为50％后分装入500ml三角瓶中，装入的谷粒量以不超过500ml刻度线为宜，在115℃下高压灭菌1小时制得菌谷培养基备用。将烟草黑胫病菌丝体移入燕麦培养液中培养5天后，再转入菌谷培养基上培养18天得到黑胫病接种体。将苗龄50天的待鉴定烟苗移栽至温室病圃，烟苗在病圃内随机排列，设3次重复，每重复植烟10株，按常规温室管理技术进行管理。以小黄金1025为感病对照，红花大金元为感病辅助对照，金星6007为中护对照，革新3号为抗病对照。烟苗移栽5天后，将接种体接种至待测烟苗的茎基部，接种量为0.5g/株。接种后立即覆土并灌水15cm，保持24小时。在温室病圃中，分别于接种后的第5天、第7天和第10天各记录一次病指，以三次病指的平均值作为测试品种的抗性指标。按国家行业标准YC/T39-1996将鉴定品种抗性划分为四级抗病(R)病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)病指在50.1-75.0；感病(S)病指75以上。
实施例2 重复实施例1，有以下不同点烟草黑胫病菌丝体在燕麦培养液中培养6天。
实施例3 重复实施例1，有以下不同点烟草黑胫病菌丝体在燕麦培养液中培养7天。
实施例4 重复实施例1，有以下不同点烟草黑胫病菌丝体在菌谷培养基中培养19天。
实施例5 重复实施例1，有以下不同点烟草黑胫病菌丝体在菌谷培养基中培养20天。
实施例6 重复实施例1，有以下不同点将苗龄45天的待鉴定烟苗移栽至温室病圃。
实施例7 重复实施例1，有以下不同点将苗龄55天的待鉴定烟苗移栽至温室病圃。
实施例8 重复实施例1，有以下不同点烟苗移栽6天后，将接种体接种至待测烟苗的茎基部。
实施例9 重复实施例1，有以下不同点烟苗移栽7天后，将接种体接种至待测烟苗的茎基部。
实施例10 重复实施例1，有以下不同点煮好的谷子冷却晾至含水量为55％。
实施例11 重复实施例1，有以下不同点煮好的谷子冷却晾至含水量为60％。
实施例12 重复实施例1，有以下不同点接种后立即覆土并灌水18cm，保持36小时。
实施例13 重复实施例1，有以下不同点接种后立即覆土并灌水20cm，保持48小时。
实验例1 1.实验条件 ①参试品种全国区试、云南省区试的27份品种，详见表1。以小黄金1025为感病对照，红花大金元为感病辅助对照，金星6007为中抗对照，革新3号为抗病对照。
②实验地点云南烟草科学研究院农业研究所基地温室黑胫病病圃。
③黑胫病接种体的制备将分离纯化的烟草黑胫病菌株(编号为P0402)移入燕麦培养液中摇床培养，7天后转入菌谷培养基上培养18天备用。菌谷的制作将谷子浸泡6小时后用清水洗净，煮至谷粒炸开成半开花状，冷却晾至半干，分装入500ml三角瓶中高压灭菌1小时(115℃)。装入的谷粒量以不超过三角瓶500ml刻度线为宜。
④黑胫病温室病圃实验设计及管理各鉴定品种在温室病圃随机排列，3次重复，每重复植烟10株，按常规技术进行温室管理。
⑤黑胫病接种将苗龄50天的烟苗移栽至温室病圃，移栽后5天后接种菌谷，将培养18天的菌谷接种至烟株的茎基部，接种量为0.5g/株。接种后立即覆土并保湿，使病圃内土壤处于饱和或过饱和状态。
⑥鉴定于接种后5、7、10天各调查一次病情，以三次病指的平均值作为测试品种的抗性指标。
⑦分级按国家行业标准YC/T39-1996将品种的抗性划分为四级抗病(R)病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)病指在50.1-75.0；感病(S)病指75以上。
⑧对比实验组采用人工诱导大田成株期抗性鉴定方法，菌谷接种量为5g/株，且分别在两块病圃田内进行创伤和不创伤接种试验，鉴定结果与苗期鉴定对比，详见表1。其中创伤试验是指接种时用无菌小刀刺伤茎基表皮。
表1 黑胫病苗期与大田成株期抗性鉴定结果对比 续表1 2.结果分析温室鉴定结果与大田不创伤接种的鉴定结果的相关系数为R2＝0.9609，温室鉴定结果与大田创伤接种的鉴定结果之间的相关系数为R3＝0.8148，查相关系数显著性测验表，R1、R2、R3在1％水平上均达显著正相关，且相关性非常显著。
从以上鉴定结果可以看出，当苗期接种量为0.5g/株时与大田接种量为5g/株时的鉴定结果趋于一致，完全可以用苗期鉴定结果代替大田鉴定结果。
实验例2 1.实验条件 ①参试品种本项目组提供的50份种质资源，品种名称见表2。
②试验时间与地点2004～2005年在云南省烟草科学研究所基地温室黑胫病病圃。
③抗病性鉴定方法 各品种均设3次重复，每重复10株，随机排列。以小黄1025为感病对照，红花大金元为感病辅助对照，金星6007为中抗对照，革新3号为抗性对照。鉴定时采用茎基部菌谷接种法，将苗龄50天的烟苗移栽至温室病圃内，移栽后5天接种，将培养18天的菌谷按0.5g/株的接种量接种于烟苗的茎基部，并及时覆土保湿，接种后分别于第5天、第7天和第10天调查病情，以5、7、10天调查的平均病指作为抗性划分标准。
④病害及抗性分级标准 病害调查时，病情严重度分级按国家行业标准YC/T39-1996规定执行；根据病害严重度及对照品种的发病情况，按最后确定的病指，一般将病害分为以下四级抗病(R)病指25以下；中抗(MR)；病指在25.1-50.0；中感(MS)病指在50.1-75.0；感病(S)病指75以上。
2.结果与分析 ①种质资源抗黑胫病鉴定结果 鉴定结果表明抗黑胫病(R)种质有13份，中抗黑胫病(MR)种质有25份；50份材料中，有76％的种质资源对黑胫病的抗性水平表现为中抗以上；有10份种质对该病表现为中感(MS)，2份种质表现为感病(S)，感病品种占的比例较少。鉴定结果详见表2及表3。
表2 种质资源抗黑胫病鉴定结果 续表2 表3 供试的种质资源对烟草黑胫病病害的抗病性鉴定结果统计表 ②不同抗性品种接种黑胫病5天、7天、10天后的病指变化。
对第5、7、10天的病指进行比较分析发现用第7天的病指与第5天的病指相减时，两者的病指差值在10以下的品种占参试品种的66％，其中抗病品种(R)有13份，占抗病品种总数的100％；中抗品种(MR)有16份，占中抗品种总数的64％；中感品种(MS)有2份，占中感品种总数的20％，感病品种(S)有2份，占感病品种总数的100％。差值在10以上的品种占参试品种的34％，且均为中抗、中感品种，其中中抗品种(MR)有9份，占中抗品种总数的36％；中感品种(MS)有8份，占中感品种总数的80％。
全部的抗病品种(R)及感病品种(S)在第5～7天的病指差值均在10以下；而差值在10以上的中抗及中感品种中，虽然中抗及中感品种相当，但有80％的中感品种在本次鉴定中病指差值在10以上，说明中感品种对黑胫病的反应比较敏感，在接种该病后的第5～7天之间的病指变化较大。结果详见表4。表4 不同抗性品种接种黑胫病后5d的病指与7d的病指变化分析 续表4 用10天的病指与7天的病指相减时两者的病指差值在10以下的品种占参试品种的64％，其中抗病品种(R)有13份，占抗病品种总数的100％；中抗品种(MR)有11份，占中抗品种总数的44％；中感品种(MS)有7份，占中感品种总数的70％；感病品种(S)有1份，占感病品种总数的50％。差值在10以上的品种占参试品种的36％，且均为中抗、中感及感病品种，其中中抗品种(MR)有14份；占中抗品种总数的56％；中感品种(MS)有3份，占中感品种总数的30％；感病品种(S)有1份，占感病品种总数的50％。
全部的抗病品种及70％的感病品种在第7～10天的病指差值在10以下，中抗及感病品种的比例较低；而差值在10以上的品种中，有56％的中抗品种，且份数也最多，达14份；虽然有50％的感病品种病指差值在10以上，但仅有1份感病品种，份数相比较少。结果详见表5。 表5 不同抗性品种接种黑胫病后7d的病指与10d的病指变化分析 续表5 用10天的病指与5天的病指相减时两者的病指差值在10以下的品种占参试品种的64％，其中抗病品种(R)有13份，占抗病品种总数的100％；中抗品种(MR)有15份，占中抗品种总数的60％；中感品种(MS)有2份，占中感品种总数的20％；感病品种(S)有2份，占感病品种的100％。差值在10以上的品种占参试品种的36％，且均为中抗、中感品种，其中中抗品种(MR)有10份，占中抗品种总数的40％；中感品种(MS)有8份，占中感品种总数的80％。
全部的抗病品种(R)及感病品种(S)在第5～10天的病指差值均在10以下；而差值在10以上的中抗及中感品种中，80％的中感品种在本次鉴定中病指差值在10以上，说明中感品种对黑胫病的反应比较敏感，在接种该病后的第5～10天之间的病指变化仍然较大。结果详见表6。
表6 不同抗性品种接种黑胫病后5d的病指与10d的病指变化分析 续表6 综合分析，三次差值均在10以下的有24份，占参试品种的48％，其中抗病品种(R)有13份，中抗品种(MR)有8份，中感品种(MS)有2份，感病品种(S)有1份；三次差值均在10以上的有9份，占参试品种的18％，且均为中抗、中感品种，其中中抗(MR)有6份，中感品种(MS)有3份。
7天的病指与5天的病指相减时病指差值没有变化的有2份Cokertobacco和COM烟，均为抗病品种(R)，病指差值变化最大的是H8，为中感品种(MS)；10天的病指与7天的病指相减时病指变化最小的有2份中感品种TN86，抗病品种Coker tobacco。变化最大的是中感品种H1；10天的病指与5天的病指相减时差值变化最小的是仍是抗病品种Coker tobacco，差值变化最大的是中感品种H8。结果如图1所示。
权利要求
1、一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法，包括以下顺序的步骤
①病原菌分离
在基础培养基中加入利福平原液，制成利福平培养基备用；采集烟草黑胫病症状典型的感病烟茎，取病茎表皮疑病组织数块，切成长1～2cm的小块，置于利福平培养基上，经培养、纯化后得到烟草黑胫病菌丝体，在室温条件下，保存于灭菌蒸馏水中备用；
②黑胫病接种体的制备
将烟草黑胫病菌丝体移入燕麦培养液中培养5～7天后，转入菌谷培养基上培养18～20天得到黑胫病接种体；
③病圃设计及管理
将苗龄45～55天的待鉴定烟苗移栽至温室病圃，烟苗在病圃内随机排列，设3次重复，每重复植烟10株，按常规温室管理技术进行管理；以小黄金1025为感病对照，红花大金元为感病辅助对照，金星6007为中抗对照，革新3号为抗病对照；
④菌谷接种
烟苗移栽5～7天后，将经步骤(2)培养得到的接种体接种至待测烟苗的茎基部，接种量为0.5g/株；接种后立即覆土并并灌水15～20cm，保持24～48小时；
⑤鉴定与分级
在温室病圃中，分别于接种后的第5天、第7天和第10天各记录一次病指，以三次病指的平均值作为测试品种的抗性指标；进而按国家标准对鉴定品种进行分级。
2、根据权利要求1所述的抗性鉴定方法，其特征在于步骤(1)所述的基础培养基为燕麦培养基。
3、根据权利要求1所述的抗性鉴定方法，其特征在于步骤(1)所述的利福平培养基中利福平原液的体积百分比含量为1.3％。
4、根据权利要求1所述的抗性鉴定方法，其特征在于步骤(2)所述的菌谷培养基由下述方法制成将谷子浸泡6小时后用清水洗净，淘尽干瘪空壳谷粒，煮至谷粒炸开成半开花状，冷却晾至谷子含水量50％～60％后分装入三角瓶中，并在115℃下高压灭菌1小时即得。
5、根据权利要求4所述的抗性鉴定方法，其特征在于三角瓶中装入的谷粒量不超过3/4瓶。
6、根据权利要求1所述的抗性鉴定方法，其特征在于步骤(4)所述的接种为创伤或不创伤接种。
7、根据权利要求6所述的抗性鉴定方法，其特征在于步骤(4)所述的接种优选为不创伤接种。
全文摘要
本发明公开了一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法，从感病烟茎上分离病原菌，经纯化、培养后得到黑胫病接种体。将接种体接种至待测烟苗的茎基部，并分别于接种后的第5天、第7天和第10天各记录一次病指，以三次病指的平均值作为测试品种的抗性指标。本发明率先实现了用苗期鉴定结果替代传统大田鉴定结果，有效避免外部环境对鉴定结果的影响，提高了烟草黑胫病抗性鉴定的准确性。该方法从育苗到鉴定完成只需65天左右，大幅度地缩短了鉴定时间。其操作简便，成本低廉，鉴定结果真实可靠，具有良好的市场应用前景。
文档编号A01G7/00GK1922965SQ200610048658
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者卢秀萍, 李永平, 白永富, 肖炳光, 李德团 申请人:云南省烟草科学研究所