专利名称：常温亚常温离体心脏灌注保存液的制作方法
技术领域：
本发明为一种离体心脏灌注保存液，属于一种常温亚常温条件下心脏保存物质。
背景技术：
目前的待移植器官保存有效时限较短，临床上离体心脏保存时间一般不超过5小时。在此现状下，离体心脏很难进行长途运输，限制了待移植心脏的远距离调配，造成了一定的浪费。另外，由于保存时间短，没有足够时间寻找具良好配型的患者，心脏资源或被丢弃或勉强移植给患者，使得移植质量降低，移植后心脏长期存活率低，这也是某种程度的浪费。在我国相关立法完善后，可用心脏资源更是严重减少，因此，高效保存离体心脏是目前急迫需要解决的问题。
离体心脏保存时间短、利用率不高的根本原因与目前的单纯冷藏保存方式有直接关系。单纯冷藏法的特点是通过提供低温环境(0～4℃)降低器官代谢率，并采用高渗透压的保存液防止心肌组织水肿，但这种保存方法并不能为待移植器官提供持续的营养物质和氧气供应。显然，冷藏保存法仅能有限地延长而不能完全阻止器官功能的丧失。
常温亚常温机器灌注保存(continuous hypothermic perfusion)就是将灌注液泵入心脏内，使灌注液及心脏的温度维持在一定水平，以达到此条件下供应器官代谢所需的基本营养和氧气的目的。
将离体心脏置于体内生理条件模拟装置中，有脉动的“循环系统”提供相对充分的养分和氧气，这种符合器官生理特性的保存方式将大大减少离体心脏的缺血缺氧性损害，透析系统带走有害物质，可以避免传统保存方法对器官结构及功能的影响。目前生物材料和电子科技的发展为仪器小型化创造了条件，以往复杂的控制部分依靠现今微小集成块芯片就得以实现，这些成熟条件的存在为离体心脏的长途运输和该保存方法的广泛应用做了良好的铺垫。但是，目前尚没有常温、亚常温条件下的心脏保存液。
发明内容
本发明的目的在于公开一种针对离体心脏在常温亚常温条件下进行灌注保存的保存液。
本保存液是由基本电解质、能量物质和保护性物质组成的混合物，每升保存液中各物质的含量如下NaCL 5-7g、KCL(氯化钾)0.3-0.5g、NaH2PO4·H2O 100-150mg、MgSO450-100mg、NaHCO33-5g、L精氨酸70-100mg、组氨酸30-60mg、L-胱氨酸50-70mg、L蛋氨酸10-50mg、左旋谷酰胺500-700mg、L赖氨酸100-170mg、甘氨酸10-50mg、L异亮氨酸70-150mg、L丝氨酸30-50mg、L亮氨酸70-150mg、L色氨酸10-20mg、L-酪胺酸80-150mg、L缬氨酸70-150mg、L苏氨酸80-150mg、氯化胆碱3-8mg、维生素B20.5-3mg、泛酸3-8mg、叶酸3-8mg、吡哆醛3-10mg、烟酰胺3-10mg、葡萄糖1-10g、ATP(三磷酸腺苷)0.5-5.0g、腺苷1-10g、血浆蛋白10-50g、低分子右旋糖酐10-50g、红细胞1-100g、维拉帕米1-5mg、地塞米松5-10mg、谷光甘肽5-10mg、别嘌醇5-10mg、肝素200-700U。
在本发明中，各物质所起的作用如下①NaCL、KCL、NaH2PO4·H2O、MgSO4、NaHCO3作为主要电解质成分，电解质离子浓度为血液型，可以维持血浆渗透压。
②血浆蛋白可以维持胶体渗透压；低分子右旋糖酐可改善血流量，达到维持血浆胶体渗透压目的，且其对微循环有较好的作用，预防并消除血小板凝聚，有利于再灌注。
③加入红细胞的目的是增加携氧，保证灌注保存液的有效携氧量。
④维拉帕米为钙拮抗剂，可以减轻钙超载、保护线粒体、减少氧自由基生成，此外，它尚有抑制血小板凝聚的作用。
⑤谷胱甘肽和别嘌醇为保护性物质，谷胱甘肽可以抑制或减轻脂质过氧化反应，减轻灌注损伤；别嘌醇是黄嘌呤氧化酶的抑制剂，可以防止自由基损伤，减轻再灌注损伤。
⑥加入能量物质，如葡萄糖、ATP、腺苷等，充分保证离体心脏可利用能量物质的供应。
⑦地塞米松为膜稳定剂，具有膜稳定性作用。
⑧核黄素、叶酸、吡哆醇、泛酸等维生素类物质，乐意给予基本代谢所需的辅酶等。
⑨肝素具有抗凝、抗血栓作用以及抗炎、抗过敏等非凝血方面的生物活性。
⑩精氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、丝氨酸等氨基酸类物质，可保证基本代谢的低物质供应。
上述物质中还可加入抗菌药物青霉素50-200U、氨苄西林1-5g，在一定程度上预防感染。
本保存液不仅可以提供充分的氧气，而且能提供充足的能量供给，从而可有效地应用于离体心脏的常温亚常温保存，具有保存时间较长、对心脏损害小的特点，可以有效降低器官移植过程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反应，延长移植物的存活时间，提高移植物在宿主内的存活率，此外，还可以防止低温导致的缺血性损伤、细胞水肿及其继发损伤。
以下实验可以进一步说明本发明的优点一、细胞培养形态学变化观察心肌细胞培养方法取出生1天内的新生大鼠，无菌条件下剪取心脏，加入消化液0.125％胰酶+0.02％EDTA于室温下吹打消化4～5次，每次3～5min。第1次的消化物弃之，收集其他几次消化所得细胞悬液，调节细胞密度为6×106个/ml。在24孔培养板中加入盖玻片每孔加入细胞悬液400μl，贴壁6h后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12的细胞培养液1ml，分别加入该保存液0.1、0.2、0.5、1.0mi(终浓度百分比为10％、20％、50％)，于37℃在CO2孵箱中继续培养，24小时后进行细胞形态学观察。心肌细胞的形态学变化结果倒置显微镜下见各组心肌细胞形态正常，呈多角型，胞浆内颗粒丰富，表面长出大量微突起，有较长的伪足与周围细胞相连。各组生长程度相仿，细胞存活率无显著差异，说明该保存液对培养的心肌细胞无影响。
二、对培养心肌自发节律性收缩频率的影响心肌细胞培养5d后，加入含该保存液的培养液(终浓度百分比为10％、20％、50％)，24小时后观察，计算心肌细胞自发节律性收缩的频率。每剂量组取6个有代表性的细胞簇进行观察。结果随着浓度增加，各组心肌细胞的自发节律性收缩频率较对照组无明显改变，说明保存液对培养心肌细胞生物电生理特性无显著影响。
三、保存液对培养心肌细胞细胞骨架影响的观察心肌细胞培养5d融合后加入含本保存液的培养液，方法同前，培养24小时后，用考马斯亮蓝R250显示细胞骨架。结果光镜下见心肌细胞骨架纤维束清晰可见，排列规则，保存液各浓度组较对照组无显著差别。
四、对心肌细胞酶代谢影响心肌细胞培养5天后，加入含本发明保存液(终浓度百分比为10％、20％、50％)，24小时后取各组培养液，离心后用Technicon RA-XT(美国)全自动生化分析仪测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和碱性磷酸酶(AKP)的活力。结果与对照组相比，实验组培养上清的LDH、AST、CK、AKP水平无明显差异。
表1 心肌细胞酶代谢变化结果(U/L)
五、离体心脏保存实验将大鼠离体心脏用保存液保存，亚常温条件下(20℃)进行灌注保存，压力为(40±5)mmHg，心脏无博动，保存5小时后进行观察。
1、病理学检查取左室心肌部分，10％甲醛固定，HE染色，光镜下观察。
结果在光镜下可见心肌细胞形态、胞质、间质及横/纵纹均正常。无明显的心肌细胞胞浆的空泡变性、炎症细胞浸润和间质水肿、横/纵纹不清等病理表现。
2、电镜观察取心脏心尖部米粒大小组织，3％戊二醛加1.5％多聚甲醛固定，磷酸缓冲液洗，2％饿酸、3％亚铁氰化钾等比例混合后固定，脱水，环氧树脂618包埋，切片，醋酸铀和枸橼酸铝双重染色，透射电镜观察。
电镜结果可见正常组肌原纤维纵向走向，肌节结构明显，Z带清楚，其间可见线粒体和肌质网，线粒体多呈单排分布，嵴结构清楚，肌质网相互吻合形成纵管系统。
3、心肌组织生化指标测定心肌SOD、GSH-Px活性及MDA水平测定取心脏组织剪成碎块，称取0.2g，加组织块重量9倍的匀浆介质(pH7.4，0.01mol/L EDTA-2Na)制各匀浆，再以3000r/min离心10min，取适量上清液，进行SOD、GSH-Px活性及MDA水平测定。结果见表。
表心肌SOD、GSH-Px、MDA测定结果
实验显示，本发明涉及的保存液配方较好保存了实验大鼠的离体心脏。
具体实施例方式
以下每例的保存液的总量为1升
配制方法取部分蒸馏水，将电解质(NaCL、KCL、NaH2PO4·H2O、MgSO4、NaHCO3)首先加入其中，然后将肝素加入，然后加入氨基酸和血浆蛋白等，最后加入红细胞，最后用蒸馏水定容至总量1升。
权利要求
1一种常温亚常温离体心脏灌注保存液，其特征在于每升保存液中含有以下物质NaCL5-7g、KCL 0.3-0.5g、NaH2PO4·H2O 100-150mg、MgSO450-100mg、NaHCO33-5g、L精氨酸70-100mg、组氨酸30-60mg、L-胱氨酸50-70mg、L蛋氨酸10-50mg、左旋谷酰胺500-700mg、L赖氨酸100-170mg、甘氨酸10-50mg、L异亮氨酸70-150mg、L丝氨酸30-50mg、L亮氨酸70-150mg、L色氨酸10-20mg、L-酪胺酸80-150mg、L缬氨酸70-150mg、L苏氨酸80-150mg、氯化胆碱3-8mg、维生素B20.5-3mg、泛酸3-8mg、叶酸3-8mg、吡哆醛3-10mg、烟酰胺3-10mg、葡萄糖1-10g、三磷酸腺苷0.5-5.0g、腺苷1-10g、血浆蛋白10-50g、低分子右旋糖酐10-50g、红细胞1-100g、维拉帕米1-5mg、地塞米松5-10mg、谷光甘肽5-10mg、别嘌醇5-10mg、肝素200-700U。
2根据权利要求1所述的保存液，其特征在于每升保存液中还加入青霉素50-200U和/或氨苄西林1-5g。
全文摘要
本发明为一种常温亚常温离体心脏灌注保存液，属于一种器官保存物质，由基本电解质、能量物质和保护性物质组成。每升保存液含以NaCl(5.0－7.0g)、KCl(0.3－0.5g)、NaH
文档编号A01N1/02GK1930961SQ20061009518
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月29日 优先权日2006年9月29日
发明者王贵波, 吴军, 罗高兴, 黄赤兵, 卞修武 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院