专利名称：一种抗南方根结线虫的番茄亲本纯系选育方法
技术领域：
本发明属于番茄育种领域，涉及一种番茄的选育方法，特别涉及一种抗南方根结线虫的番茄亲本纯系选育方法，该方法以分子标记辅助选择和传统选择育种方法相结合，筛选出的亲本纯系可直接用于抗根结线虫番茄杂交种的配组。
背景技术：
根结线虫(Meloidogyne spp.)是危害栽培番茄(Lycoperisicon esculentum)十分严重的土传性病害之一，其主要种类是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)。随着番茄保护地栽培面积的扩大和复种指数的提高，根结线虫的危害日益严重，发病田的产量损失一般为30％～50％，严重时达70％以上。对于番茄的根结线虫的化学防治和生物防治，由于污染生态环境或由于土壤抑菌作用，其生态效益和防治效果均不理想。因此，选育和利用抗性番茄品种就成为防治根结线虫最有效的途径，但目前国内尚无抗性番茄品种用于生产。抗性品种的育成有赖于抗性资源的发掘和利用，传统的人工接种鉴定方法不仅程序复杂、结果不准确，而且很难区分抗性基因的纯合体和杂合体，导致抗性基因的纯合速度较慢，严重制约着番茄抗根结线虫亲本系和新品种的选育。
发明内容
针对上述抗根结线虫番茄亲本系和品种选育中存在的问题，本发明的目的在于，提出一种抗南方根结线虫的番茄亲本纯系选育方法，该方法利用分子标记辅助选择与传统选择育种相结合选育抗根结线虫番茄亲本系，操作简便、结果可靠，所选育出的亲本纯系可直接用于抗根结线虫番茄杂交种的配组。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术解决方案一种抗南方根结线虫番茄亲本纯系的选育方法，其特征在于，该方法以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A的母本C为改良对象，以抗根结线虫的番茄杂交种B为抗源，在苗期利用抗性基因的分子标记筛选抗根结线虫材料，在大田利用传统的育种方法选择田间综合性状表现优良的材料，具体选育包括下列步骤1)对抗源进行苗期分子标记鉴定及成株期病圃抗性鉴定在分子标记鉴定的基础上，将抗源移栽在根结线虫病圃，对抗源进行成株期病圃抗性鉴定；选择苗期分子标记鉴定和成株期病圃抗性鉴定确定携带Mi基因和抗病的作为转育的抗源；2)以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A为母本，以抗根结线虫的番茄杂交种B为父本进行人工授粉，收获杂交种ABF1，进行单株DNA提取和PCR扩增，保留扩增出750bp条带的植株，淘汰无扩增条带的单株；对入选单株DNA的PCR扩增产物用核酸限制性内切酶Taq I消解，将SCAR标记转化为CAPs标记；经酶切反应和电泳检测后，淘汰不含Mi基因的单株，保留Mi基因纯合株和Mi基因杂合株；3)将入选植株定植于田间根结线虫病圃，进行病圃辅助鉴定及株型、第一花序着生节位、果色、果实形状、抗性等重要农艺性状的鉴定选择，对具有突出优良性状的植株按单株留种；4)以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A的母本C为轮回亲本，以入选单株为非轮回亲本，连续回交5～6代，每代继续按上述方法进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，入选抗根结线虫并且具有突出优良性状的单株或株系，根据优良性状的不同特点最终选择3～5个株系，按株系留种；5)对入选株系连续自交2代，继续进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，最终获得含有纯合抗性基因、具有不同突出优良农艺性状的番茄亲本系。
本发明带来如下的技术效果(1)本发明首次将分子标记技术应刚于番茄育种材料的筛选，并与传统育种方法相结合，有效地解决了番茄抗根结线虫病圃鉴定程序繁琐、鉴定结果不准确的问题。
(2)以2个生产上利用的番茄杂交种为基础材料，有利于有利基因的积累，保证所获得的亲本株系具有高的配合力。
(3)以A品种的母本C回交多代，在其回交自交后代的入选株系中强化了C的优良性状。
图1为番茄抗根结线虫SCAR标记的扩增效果图。第1和第8泳道是Marker；第2～第3泳道无750bp条带，视为不含Mi抗性基因；第4～第7泳道均出现了750bp条带，需进一步进行CAPs标记分析。
图2为番茄抗根结线虫CAPs标记的酶切电泳图。M泳道是Marker；第1～第4泳道酶切产物出现750bp、570bp和160bp三条带，表示Mi基因杂合；第5泳道酶切产物出现570bp和160bp两条带，表示Mi基因纯合。第6～第8泳道只有750bp一条带，表示不含Mi基因。
图3为亲本系M02-28-3-6-12-69-158与对照(左)在南方根结线虫抗性鉴定圃中的发病情况对比。
图4为M02-69-9-62-32-49-216亲本系与对照(左)在南方根结线虫抗性鉴定圃中的发病情况对比。
图5为M02-58-9-4-82-89-213亲本系与对照(左)在南方根结线虫抗性鉴定圃中的发病情况对比。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
本发明首次将分子标记技术应用于番茄育种材料的筛选，在苗期利用抗性基因的分子标记筛选抗根结线虫材料，在大田利刚传统的育种方法选择田间综合性状表现优良的材料，最终选育出抗根结线虫并具有突出优良性状的番茄株系作为新一代杂交种的亲本纯系。其具体步骤如下(1)以我国目前生产上应用的综合性状优良但不抗根结线虫的番茄杂交种A的母本C(番茄杂交种A及其母本C可从已育成番茄杂交种的单位或其制种单位索取)为主要改良对象，以从国外引进的抗根结线虫的番茄杂交种B(可从市场上种子销售门市或有种子进出口业务的公司，如中国种子集团公司、上海种业(集团)有限公司和上海沃尔农业科技有限公司等单位购买)为抗性来源。
(2)对抗源B进行苗期分子标记鉴定及成株期病圃抗性鉴定。具体方法是先播种抗源B，待其幼苗长至2～3片真叶时，采用微量法提取单株叶片的总DNA(巩振辉等，以PCR鉴定转基因植株的微量DNA提取方法.西北农业大学学报，1997，25(1)45～48)。根据已公开发表的番茄抗根结线虫Mi基因的SCAR标记序列设计正反向引物(Williamson V M，Ho J Y，WuF F，et al.A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene.Mi，in tomato.Theoretical and Applied Genetics，1994，87757～763)，正向引物序列为5′-TCGGAGCCTTGG TCTGAATT-3′，反向引物序列为5′-GCCAGAGATG ATTCGTGAGA-3′。PCR反应总体积为15μL，其中包括模板DNA 2μL，正向引物(20μM)0.5μL，反向引物(20μM)0.5μL，dNTP(2mM)1.5μL，10×buffer(20mM，含Mg2+)1.5μL，ddH2O 8.5μL，Taq酶(2U/μL)0.5μL。PCR反应程序为95℃，5min；94℃，1min，59℃，1min，72℃，2min，30个循环；72℃，7min。利用该引物对抗源单株的总DNA进行PCR扩增，植株能扩增出一条约750bp的条带；再用核酸限制性内切酶TaqI消解PCR扩增产物，将SCAR标记转化为CAPs标记。酶切体系总体积为10μL，其中包括扩增产物7μL，5U/μL Taq I限制性内切酶0.5μL，10×buffer1.0μL，ddH2O 1.5μL。反应混合液在PCR仪65℃温育1h。电泳检测后，没有被酶消解的只有750bp一条带，这些单株小含Mi基因；能被酶消解的可出现两条或三条酶带，其中出现570bp和160bp两条特异片段的为Mi基因纯合株，而出现750bp、570bp和160bp三条特异片段的为Mi基因杂合株。Mi基因纯合株或杂合株均可作为抗源。
在分子标记鉴定的基础上，将抗源移栽在根结线虫病圃对抗源进行成株期病圃抗性鉴定。
只有苗期分子标记鉴定和成株期病圃抗性鉴定确定携带Mi基因和抗病的可作为转育的抗源。
(3)以A为母本、B为父本进行人工授粉，收获杂交种ABF1。按上述方法进行单株DNA提取和PCR扩增。绝大部分植株扩增出了一条约750bp的条带；少部分植株无扩增产物，视为不含根结线虫Mi抗性基因(附图1)，淘汰无扩增条带的单株。
入选单株DNA的PCR扩增产物用核酸限制性内切酶Taq I消解，将SCAR标记转化为CAPs标记。酶切反应按本说明书“具体实施方式
”中第(2)所述酶切方法进行。电泳检测后，没有被酶消解的只有750bp一条带，这些单株不含Mi基因，予以淘汰；能被酶消解的可出现两条或三条酶带，其中出现570bp和160bp两条特异片段的为Mi基因纯合株，而出现750bp、570bp和160bp三条特异片段的为Mi基因杂合株(附图2)。入选抗性基因纯合与杂合的单株。
将入选植株定植于田间根结线虫病圃，进行病圃辅助鉴定及株型、第一花序着生节位、果色、果实形状、抗性等重要农艺性状的鉴定选择，对具有突出优良性状的植株按单株留种。
(4)以A品种的母本C为轮回亲本，以入选单株为非轮回亲本，连续回交5～6代，每代继续按上述方法进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，入选抗根结线虫并且具有突出优良性状的单株或株系。根据优良性状的不同特点最终可选择3～5个株系，按株系留种。
(5)对入选株系连续自交2代，继续进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，最终获得含有纯合抗性基因、具有不同突出优良农艺性状的番茄亲本系。
以下是发明人给出的具体实施例，但本发明并不限于该实施例。
实施例(1)以我国综合性状优良但不抗南方根结线虫的番茄杂交种“金棚一号”为母本(A品种，由西安金鹏种苗有限公司提供)，以从国外引进的含抗番茄根结线虫基因Mi的杂交种Kelly(B品种，由山东寿光先正达种业有限公司提供)为父本进行杂交。
(2)对抗源B进行苗期分子标记鉴定及成株期病圃抗性鉴定。具体方法是先播种抗源B，待其幼苗长至2～3片真叶时，采用微量法提取单株叶片的总DNA(巩振辉等，以PCR鉴定转基因植株的微量DNA提取方法.西北农业大学学报，1997，25(1)45～48)。根据已公开发表的番茄抗根结线虫Mi基因的SCAR标记序列设计正反向引物(Williamson V M，Ho J Y，WuF F，et al.A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in tomato.Theoretical and Applied Genetics，1994，87757～763)，正向引物序列5′-TCGGAGCCTTGG TCTGAATT-3′，反向引物序列5′-GCCAGAGATG ATTCGTGAGA-3′。PCR反应总体积为15μL，其中包括模板DNA 2μL，正向引物(20μM)0.5μL，反向引物(20μM)0.5μL，dNTP(2mM)1.5μL，10×buffer(20mM，含Mg2+)1.5μL，ddH2O 8.5μL，Taq酶(2U/μL)0.5μL。PCR反应程序为95℃，5min；94℃，1min，59℃，1min，72℃，2min，30个循环；72℃，7min。利用该引物对抗源单株的总DNA进行PCR扩增，植株能扩增出一条约750bp的条带；再用核酸限制性内切酶TaqI消解PCR扩增产物，将SCAR标记转化为CAPs标记。酶切体系总体积为10μL，其中包括扩增产物7μL，5U/μL Taq I限制性内切酶0.5μL，10×buffer1.0μL，ddH2O 1.5μL。反应混合液在PCR仪65℃温育1h。电泳检测后，没有被酶消解的只有750bp一条带，这些单株不含Mi基因；能被酶消解的可出现两条或三条酶带，其中出现570bp和160bp两条特异片段的为Mi基因纯合株，而出现750bp、570bp和160bp三条特异片段的为Mi基因杂合株。Mi基因纯合株或杂合株均可作为抗源。
在分子标记鉴定的基础上，将抗源移栽在根结线虫病圃对抗源进行成株期病圃抗性鉴定。
通过苗期分子标记鉴定和成株期病圃抗性鉴定确定Kelly携带Mi基因和抗病，可作为转育的抗源。
(3)以“金棚一号”A品种为母本，“Kelly”B品种为父本进行人工授粉，收获杂交种ABF1。按上述方法进行单株DNA提取和PCR扩增。绝大部分植株扩增出了一条约750bp的条带；少部分植株无扩增产物，视为不含根结线虫Mi抗性基因(附图1)。淘汰无扩增条带的单株。
入选单株DNA的PCR扩增产物用核酸限制性内切酶Taq I消解，将SCAR标记转化为CAPs标记。酶切反应按上述方法进行。电泳检测后，没有被酶消解的只有750bp一条带，这些单株不含Mi基因，予以淘汰；能被酶消解的可出现两条或三条酶带，其中出现570bp和160bp两条特异片段的为Mi基因纯合株，而出现750bp、570bp和160bp三条特异片段的为Mi基因杂合株。入选抗性基因纯合与杂合的单株。
将入选植株定植于田间根结线虫病圃，进行病圃辅助鉴定及株型、第一花序着生节位、果色、果实形状、抗性等重要农艺性状的鉴定选择，对具有突出优良性状的植株按单株留种。
(4)以“金棚一号”的母本T15-28-6(A品种的母本C，由西安金鹏种苗有限公司提供)为轮回亲本，以入选单株为非轮回亲本，连续回交5～6代，每代继续按上述方法进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，入选抗根结线虫并且具有突出优良性状的单株或株系。根据优良性状的不同特点最终入选了3个株系，按株系留种。
(5)对入选株系连续自交2代，继续进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间农艺性状选择，最后育成了三个优良亲本系，定名为M02-28-3-6-12-69-158、M02-69-9-62-32-49-216和M02-58-9-4-82-89-213。
将上述3个优良亲本系定植于番茄根结线虫抗性鉴定圃，结果显示这三个亲本系均高抗南方根结线虫(附图3、图4、图5)。育成的三个亲本系的主要特性如下M02-28-3-6-12-69-158有限生长粉红果类型。植株生长势较强，株高60～65cm，叶片较稀。主茎第六叶着生第一花序，三至四层封顶。果实高圆形，幼果无绿肩，光泽度好，成熟果粉红色，一般单果重200～250g。果实硬度好，货架寿命长，耐贮运。高抗根结线虫和番茄花叶病毒。
M02-69-9-62-32-49-216无限生长粉红果类型。植株生长势较强，叶片较稀。主茎第七叶着生第一花序，以后每隔三叶着生一花序。果实高圆形，幼果无绿肩，表面光滑发亮，成熟果粉红色，一般单果重250g左右。果肉厚，心室大，硬度好，货架寿命长，耐贮运。高抗根结线虫和枯萎病。
M02-58-9-4-82-89-213无限生长大红果类型。植株生长势较强，叶片较稀，节间较长。主茎第七叶着生第一一花序，以后每隔三叶着生一花序。果实高圆形，幼果无绿肩，果面光滑发亮无皱，成熟果粉红色，一般单果重250g左右。果肉厚，硬度大，货架寿命10～15天。高抗根结线虫、叶霉病和番茄花叶病毒。
权利要求
1.一种抗南方根结线虫番茄亲本纯系的选育方法，其特征在于，该方法以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A的母本C为改良对象，以抗根结线虫的番茄杂交种B为抗性来源，在苗期利用抗性基因的分子标记筛选抗根结线虫材料，在大田利用传统的育种方法选择田间综合性状表现优良的材料，具体选育包括下列步骤1)对抗源进行苗期分子标记鉴定及成株期病圃抗性鉴定在分子标记鉴定的基础上，将抗源移栽在根结线虫病圃，对抗源进行成株期病圃抗性鉴定；选择苗期分子标记鉴定和成株期病圃抗性鉴定确定携带Mi基因和抗病的作为转育的抗源；2)以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A为母本，以抗根结线虫的番茄杂交种B为父本进行人工授粉，收获杂交种ABF1，进行单株DNA提取和PCR扩增，保留扩增出750bp条带的植株，淘汰无扩增条带的单株；对入选单株DNA的PCR扩增产物用核酸限制性内切酶Taq I消解，将SCAR标记转化为CAPs标记；经酶切反应和电泳检测后，淘汰不含Mi基因的单株，保留Mi基因纯合株和Mi基因杂合株；3)将入选植株定植于田间根结线虫病圃，进行病圃辅助鉴定及株型、第一花序着生节位、果色、果实形状、抗性农艺性状的鉴定选择，对具有突出优良性状的植株按单株留种；4)以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A的母本C为轮回亲本，以入选单株为非轮回亲本，连续回交5～6代，每代继续按上述方法进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，入选抗根结线虫并且具有突出优良性状的单株或株系，根据优良性状的不同特点最终选择3～5个株系，按株系留种；5)对入选株系连续自交2代，继续进行苗期根结线虫抗性基因分子标记筛选和田间病圃辅助鉴定及农艺性状选择，最终获得含有纯合抗性基因、具有不同突出优良农艺性状的番茄亲本系。
全文摘要
本发明公开了一种抗南方根结线虫番茄亲本纯系的选育方法，以综合性状好但不抗根结线虫的番茄杂交种A的母本C为改良对象，以抗根结线虫的番茄杂交种B为抗源，在苗期利用抗性基因的分子标记筛选抗根结线虫材料，在大田利用传统的育种方法选择田间综合性状表现优良的材料，选育包括对抗源B进行苗期分子标记鉴定及成株期病圃抗性鉴定。以A为母本、B为父本进行人工授粉，并以A的母本C作为轮回亲本连续回交5～6代，然后自交2代。每一世代都在苗期利用番茄抗根结线虫Mi基因的CAPs分子标记对抗根结线虫性状进行筛选，在田间进行病圃辅助鉴定及农艺性状选择。最后选育出了含有纯合抗性基因、具有不同突出优良农艺性状的番茄亲本纯系。
文档编号A01H5/00GK1903014SQ20061010442
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者巩振辉, 逯明辉, 黄炜, 李大伟, 马维, 李晓东, 郑丽粉, 王建人, 蔡义勇 申请人:西北农林科技大学, 西安金鹏种苗有限公司