三氧化二镧在天山雪莲种苗生长中的应用的制作方法

专利名称：三氧化二镧在天山雪莲种苗生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及三氧化二镧(La203)在天山雪莲种 苗生根和壮苗中的应用。
背景技术：
天山雪莲属菊科(Compositae)菜蓟族(Trib. Cynareae Less.)凤毛 菊属(&"ssw^a sA)植物，是我国高山地区民间常用的一类名贵中草药。 雪莲性温、味微苦，具有散寒除湿、强筋助阳、抗炎镇痛、收縮子宫等功能， 可治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、阳痿、抗衰老及抑制癌细胞增生等。 其主要的活性成分是黄酮、生物碱、多糖。但是随着市场对雪莲需求的不断 增长，野生雪莲遭到了毫无节制地掠夺性盗采，再加上天山雪莲本身生长 缓慢、繁殖相当困难，致使野生雪莲资源严重匮乏，已被列为国家二级野生 保护植物。为了保护野生天山雪莲种质和满足市场对雪莲的需求，研究者开 展了天山雪莲进行试管微繁殖和种植的工作。最先采用组织培养进行天山雪莲快速繁殖的研究者是中国瓦 古巴诺娃 等人(瓦'古巴诺娃，刘杰龙，石玉瑚；新疆雪莲的组织培养，"新疆农业科学"， 1990,(5): 221 222)，他们将获得的无根植株放置在1/2 MS的琼脂糖培养 基(活性炭0.5 %， 0.2mg/L IAA)上诱导根的产生从而获得了完整的植株， 移栽成活率达到50%左右。中国朴日子等(朴日子，曹后男，陈艳秋，金英善， 宗成文；新疆雪莲的离体培养及其快速繁殖，"延边大学农学学报"，2003， 25(2) : 117 121)也采用了同样的方式获得了完整的植株，移栽成活率达到 72%。中国王子霞等(王子霞，林纬；植物组织培养简报摘编，"植物生理学 通讯"，2002， 38(5): 460)通过天山雪莲无菌苗子叶诱导获得不定芽，将不定 芽移栽在含0. 5 %IM + 0. 1%活性炭的1/2 MS培养基上，经过一个月的培养 大部分长出2 4条根，获得完整的植株，移栽成活率为50%。中国付春祥等 (付舂祥，金治平，杨睿，吴风燕，赵德修；新疆雪莲毛状根的诱导及其植 株再生体系的建立，"生物工程学报"，2004， 20 (3) : 366 341)通过毛状 根途径建立了天山雪莲的再生体系。最近，中国科学院过程工程研究所徐春 明等(徐春明，赵兵，耿楠，王晓东，王玉春；植物激素和活性炭对新疆雪 莲组培苗生根的影响，"中国农学通报"2006， 22(2) :41 43)研究了不同植 物激素和活性炭对新疆雪莲组培苗生根的影响，结果表明活性炭可以提高 生根质量，最适添加量为lmg/mL。此时根长最长达25. 51mm,但没有报道移 栽的情况。尽管都获得了再生植株，但是繁殖效率均比较低，主要存在以下 几方面的问题1〉以往的研究重点是组培过程中芽(或丛生芽)的诱导和增 殖，很少有研究报道关于天山雪莲的生根，这是在组培苗生根和移栽方面的 研究一直未有很大进展的原因之一；2〉天山雪莲根的诱导主要采用比较常规 的手段，即添加相关的生长剂IAA、 IBA或者NM来进行诱导，而对于长年生 长在2500米以上的天山雪莲也许并不是最佳的诱导试剂；3〉天山雪莲根的 诱导方式主要在无菌环境下进行，这种方式固然对根的生长提供了一个比较 有利的环境，但是当进行移栽时种苗由于不能适应外界的环境而造成大量死 亡，或者生长缓慢。4〉天山雪莲属于高山植物，它特殊的生长环境(高海拔、 高辐射、酷寒)使得它很难在异地生长，最突出的现象是生长缓慢。这样使 得该品种不能得到大面积的推广。因此，对天山雪莲生根、移栽以及移栽后 的生长方面的研究显得尤为重要。LaA是稀土元素的氧化产物。稀土元素(rare earths,简称RE)是镧系及 钪、镱共17种元素的总称。稀土元素在农业方面的应用研究在我国始于七十 年代初。通过多年实验室实验和实际大田试验在理论上取得了一系列的重要 突破，并产生了很大的经济效益。中国周正朝研究表明(周正朝，张系彪， 上官周平，植物对稀土元素的生理生态影响；"西北农业学报"，2004， 13 (2): 119 123)稀土元素影响植物的抗逆反应、光合作用和对金属离子的吸收， 能够提高作物的产量和品质、增强植物对土壤中N、 P、 K等营养元素的利用 和转化效率，从而对植物的生理生态产生较大的影响。中国王国烘等(王国烘； 我国农业稀土化合物应用研究的进展，"热带作物研究"，1986 (3): 71 74认 为稀土离子能促进叶绿体蛋白质的合成或者是延缓叶绿体衰老，从而提高叶 绿素含量，此外稀土离子与叶绿体色素的结合，可能加强了光合色素对光的 捕获能力，或者是提高了叶绿体中二磷酸核酮糖羧化嗨的羧化活性，从而提
高对C02的同化作用，最终表现为较高的光合能力。近来，以植物悬浮细胞为体系研究稀土元素对植物细胞生长和次生代谢产物生物合成影响方面的研究越来越多。中国袁晓凡等(袁晓凡，王谦，赵兵，王玉春；稀土元素对水母 雪莲细胞生长及黄酮类化合物合成的影响，"过程工程学报"，2004， 4 (4): 325 329)将稀土元素添加到水母雪莲悬浮细胞培养体系中，发现Ce和La 及混合稀土可促进雪莲细胞的生长及黄酮类化合物的合成，其中以Ce效果最 佳。当初始浓度为0. 025 mol/L的Ce添加到改良的MS培养基中时，细胞生 物量和黄酮类化合物产量最高，分别可达17. 7 g/L及942 mg/L，分别是不添 加稀土元素的对照实验的134. 4%和166.7%。中国赵建等(J. Zhao(赵建)， W.H. Zhu， Q. Hu. Promotion of indole alkaloid production in Catiiaranthus roseus cell cultures by rare earth elements, Biotechnology Letters, 2000， 22: 825 828) 在长春花细胞悬浮培养体系中分别添加Ce02、 Y203和NdCl3，显著提高了H引 哚类生物碱的积累，说明适量的稀土元素对植物次生代谢产物的生物合成有 一定的促进作用。类似的结果如中国吴江永(J.Y.Wu(吴江永)，C.GWang，X.G Mei. Stimulation of taxol production and excretion in Taxus spp cell cultures by rare earth chemical lanthanum, Journal of Biotechnology, 2001 ， 85: 67 73)、中 国杨盛昌(S.C. Yang(杨盛昌)；Possible involvement of NADPH oxidase in lanthanide cation-induced superoxide anion generation in BY-2 tobacco cell suspension culture. Journal of rare earths, 2006, 24: 243 247)。另夕卜，应用 稀土元素促进植物细胞形态发生方面的研究已有报道。杨汉民等(杨汉民， 杜琳；稀土元素对枸杞体细胞胚诱导频率的影响；"中国稀土"， 1994， 12(2): 186 188)研究了稀土元素对枸杞体细胞胚胎诱导频率的影响，结果表明混 合稀土元素的添加较大程度上提高了胚胎发生的频率，可达到295.4%。中国 鲁宽科等人(鲁宽科，常振战，陈宝卫，果德安，郑俊华；稀土元素对植物 的激素样作用，"北京医科大学学报"，1997， 29 (4) :289 291)对稀土元 素的作用机理进行了研究，结果表明稀土元素有类似植物激素的作用，其作 用机制可能与钙调蛋白有关。中国郑志侠等(郑志侠，黄碧霞，芮蕾，徐洛； 稀土元素对Ca在细胞中分布影响机制的探讨，"稀土"， 2001, 22 (6) :27 31 )研究了稀土元素与Ca在植物细胞中的运转和分布的影响，研究结果表明， 稀土元素和Ca竞争膜磷脂上的结合点，影响膜上的C,转运机制，导致了Ca 在细胞中分布的改变，从而引起细胞生理生化的改变。关于稀土元素作用机 理方面的研究尽管已有报道，但仍然处于摸索阶段。本发明在研究稀土元素与植物根形态发生和种苗生长生理的基础上筛选出了高效组根生长试剂La203，该试剂对天山雪莲根诱导和种苗的生长具有显 著的促进作用。将此试剂应用于常规的组织培养过程，能够快速、高效的诱 导高山植物——天山雪莲无根苗的生根，并促进移栽过程中种苗的生长和提 高成活频率。整个工艺简单可行，既节省了原材料的使用量，又縮简了雪莲 试管苗操作步骤，容易实现雪莲种苗的规模化生产，并为其它难生根植物的 快速繁殖和驯化工作提供了很好的借鉴。发明内容本发明的目的是提供三氧化二镧在天山雪莲种苗生根中的应用。 本发明的再一 目的是提供三氧化二镧在天山雪莲种苗生长中的应用。本发明巧妙的利用了 1^203促进细胞生长和分化的功能，快速实现了天山 雪莲生根的诱导和移栽后种苗的健壮生长，与传统的依赖于植物激素诱导生 根的途径和分阶段生根的方式相比，具有节省材料、节省试剂、节省人力、 縮短种苗的培育周期、生产效率高的优点，很容易在规模化生产中使用。本发明的三氧化二镧在天山雪莲种苗生根和壮苗中的应用的具体实施方 案包括两个途径(如图l、 2所示)，第一个途径分为两个阶段瓶内生根和瓶 外驯化；第二个途径是无根种苗或组培苗直接移栽、驯化。其步骤如下途径一准备高压灭菌的无菌支持培养基质，加入浓度为25 250微摩 尔每升的天山雪莲根诱导试剂La^溶液；然后在无菌条件下取天山雪莲的无 根或带有少量根的组培苗插入到培养瓶内装有制备好的培养基质中培养，培 养温度25士2。C，光照强度为500 5000 Lux、光周期16小时，湿度刚开始 保持在80%以上， 一周后可降低湿度；生长一个月后，将生根的组培苗从培养 瓶中取出，用无菌水冲洗掉附着的培养基质，移栽在外界培养基质支持物上， 用1^203溶液浇灌，La必溶液浓度为50 500微摩尔每升，用遮荫网遮盖，并 保持培养空间湿度不低于50%。培养3 14天后，优选3 7天后，叶片喷洒 1^203溶液至液滴形成但不掉落为止丄3203溶液的浓度为10 150微摩尔每升， 以后每间隔3 14天，优选7天可再喷洒浓度为10 300微摩尔每升的LaA 溶液， 一个月后即可进行大田移栽。途径二准备不经灭菌或者没完全灭菌的支持培养基质，加入浓度为25 250微摩尔每升的天山雪莲根诱导试剂1^203溶液；然后将天山雪莲的无根组 培苗或者种籽实生苗插入制备好的培养基质中培养，培养温度25士2X:，光照 强度为500 5000 Lux、光周期16小时，湿度刚开始保持在80%以上， 一周 后可降低湿度；培养3 14天后，优选3 7天后，叶片喷洒LaA溶液至液滴 形成但不掉落为止，La2(V溶液的浓度为10 150微摩尔每升，以后每间隔3 14天，优选7天可再喷洒浓度为10 300微摩尔每升的LaA溶液。所述的天山雪莲(5"a歸勤a i/7Ko7worata Kar. et Kir. ex Maxim)的无 根或带有少量根的种苗是由细胞再分化而来的无菌苗，或者是种子种植出来的种苗。所述的培养基质选自琼脂、草炭、珍珠岩、蛭石、木屑、腐殖土中的一 种或一种以上的混合基质。所述的LaA溶液中可进一步加入蔗糖，制备成混合天山雪莲根诱导试剂。所述的La^溶液中可进一步加入其它无机元素(钾、钙、镁、铁、磷、 铜、钴、硼、锌或它们的任意混合物)，制备成混合天山雪莲根诱导试剂。所述的天山雪莲根诱导试剂LaA溶液、U203与蔗糖的混合溶液、LaA 与钾、钙、镁、铁、磷、铜、钴、硼、锌元素或它们的任意混合溶液添加方 式为在培养基质中直接添加、对天山雪莲根部浇灌或者叶片喷洒。本发明利用LaA促使天山雪莲根的发生和苗生长，通过在无菌培养基质 上或者在外界培养基质支持物中加入一定剂量的LaA溶液，能够促进天山雪 莲种苗高效生根，并提高移栽成活率；同时通过叶面喷洒La203溶液能够显著 增加天山雪莲组培苗的地上部分植株高度和叶片的数目，提高种苗的生长质 量，在短期内可获得茁壮的天山雪莲种苗。本发明适用于试管内生根或者试 管外直接生根，具有简单、节省原材料、縮短生长周期、生产效率高的优点， 节省人力、物力，很容易在大规模生产中应用。不仅对天山雪莲种苗的高效 生根提供了有效的途径，而且为其它难生根的高山植物的人工生根体系的建 立提供了可借鉴的模式。


图1.本发明途径一的LaA促进天山雪莲植株生根、壮苗工艺流程示意图。 图2.本发明途径二的LaA促进天山雪莲植株生根、壮苗工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例11、 配制200微摩尔每升La203溶液，添加琼脂粉0.5%， 12rC灭菌17分 钟。取生长状态均一健壮的天山雪莲无根组培苗(长2 cm)转接到含有UA 的琼脂培养基上，每个培养瓶转接3 5棵，然后放置到温度为25士2。C，光 照强度为4000 Liix、光周期16小时的培养室中培养。2、 培养35天后，生根频率达到100%、平均每个苗上有6条根、平均根 长2.5cm，优于不添加La203溶液的培养基。将生根的种苗取出培养瓶，用自 来水冲洗掉附着的琼脂，然后转接到珍珠岩支持培养基质上，用浓度为200微 摩尔每升的LaA溶液浇灌根部，用遮荫网遮挡，每隔一个小时喷洒自来水一 次，以空气湿度不低于80%为佳。温度25 ±2°C,光照强度为2500 Lux、光 周期16小时。3、 培养7天后，去掉遮荫网，用浓度为200微摩尔每升的LaA溶液喷 洒叶面，以形成液滴但不往下滴水为止，调整每次喷洒自来水的间隔时间， 以空气湿度不低于50%为佳。以后每次间隔一周喷洒浓度为100微摩尔每升 的La2(V溶液。 一个月后，种苗的成活率为85%。温度25士2'C，光照强度为 4000Lux、光周期16小时。实施例21、 取优质草炭放置到培养瓶中(高度为培养瓶的2/5),然后加入浓度为 200微摩尔每升LaA溶液至不积水为止，121。C灭菌30分钟。取生长状态均 一健壮的天山雪莲无根组培苗(长2 cm)转接到含有La203的琼脂培养基上， 每个培养瓶转接3 5棵，然后放置到温度为25 ±2°C,光照强度为4000 Lux、 光周期16小时的培养室中培养。2、 培养35天后，生根频率达到95%、平均每个苗上有8条根、平均根长 2.9cm，优于不添加U203溶液的培养基。将生根的种苗取出培养瓶，然后转接 到珍珠岩支持培养基质上，用浓度为200微摩尔每升的LaA溶液浇灌根部，
用遮荫网遮挡，每隔一个小时喷洒自来水一次，以空气湿度不低于80%为佳。 温度25 ±2°C，光照强度为2500 Lux、光周期16小时。3、培养7天后，去掉遮荫网，用浓度为200微摩尔每升的LaA溶液喷 洒叶面，以形成液滴但不往下滴水为止，调整每次喷洒自来水的间隔时间， 以空气湿度不低于50%为佳。以后每次间隔一周喷洒浓度为100微摩尔每升 的La203溶液。 一个月后，种苗的成活率为88%。温度25士2X:,光照强度为 4000Lux、光周期16小时。实施例31、 取珍珠岩草炭蛭石体积比为3: 1: 1的混合基质，用800倍的多菌灵灭菌，次日，取天山雪莲无根组培苗(长2 cm)转接到混合基质中，用 浓度为200微摩尔每升的La203溶液浇灌根部，用遮荫网遮挡，每隔一个小时 喷洒自来水一次，以空气湿度不低于80%为佳。温度25±2°C，光照强度为 2500Lux、光周期16小时。2、 培养7天后，去掉遮荫网，用浓度为200微摩尔每升的UA溶液喷 洒叶面，以形成液滴但不往下滴水为止，调整每次喷洒自来水的间隔时间， 以空气湿度不低于50%为佳。以后每次间隔一周喷洒浓度为100微摩尔每升 的UA溶液。--个月后，种苗的成活率为72%，生根频率为85%。温度25土2 °C，光照强度为4000 Lux、光周期16小时。
权利要求
1.一种三氧化二镧在天山雪莲种苗生长中的应用，其特征是所述的三氧化二镧在天山雪莲种苗生根和壮苗中应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的三氧化二镧在天山雪 莲种苗生根和壮苗中的应用是，在事先灭过菌的培养基质中，加入浓度为25 250微摩尔每升的天山雪莲根诱导试剂LaA溶液；然后在无菌条件下取天山雪莲的无根组培苗插入到培养瓶内装有制备好的培养基质中培养，培养温度25士2。C，光照强度为500 5000 Lux、光周期16小时，湿度刚开始保持在 80%以上；生长一个月后，将生根的组培苗从培养瓶中取出，用无菌水冲洗掉 附着的培养基质，移栽在外界培养基质支持物上，用La203溶液浇灌，LaA溶 液浓度为50 500微摩尔每升，用遮荫网遮盖，并保持培养空间湿度不低于 50% ;培养3 14天后，叶片喷洒LaA溶液至液滴形成但不掉落为止，La203 溶液的浓度为10 150微摩尔每升，以后每间隔3 14天再喷洒浓度为10 300微摩尔每升的La203溶液， 一个月后即可进行大田移栽。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的三氧化二镧在天山雪 莲种苗生根和壮苗中的应用是，在没有灭过菌或者没有完全灭菌的培养基质 中，加入浓度为25 250微摩尔每升的天山雪莲根诱导试剂1^203溶液；然后 将天山雪莲的无根组培苗或者种籽实生苗插入制备好的培养基质中培养，培 养温度25±2°C，光照强度为500 5000 Lux、光周期16小时，湿度刚开始 保持在80%以上；培养3 14天后，叶片喷洒1^203溶液至液滴形成但不掉落 为止，LaA溶液的浓度为10 150微摩尔每升，以后每间隔3 14天再喷洒 浓度为10 300微摩尔每升的La203溶液。
4. 根据权利要求2或3所述的用途，其特征是所述的天山雪莲的无根 或带有少量根的种苗是由细胞再分化而来的无菌苗，或者是种子种植出来的 种苗。
5. 根据权利要求2或3所述的用途，其特征是所述的天山雪莲根诱导 试剂LaA溶液添加方式为在培养基质中直接添加、对天山雪莲根部浇灌或者叶片喷洒。
6. 根据权利要求2或3所述的用途，其特征是所述的培养基质选自琼脂、草炭、珍珠岩、蛭石、木屑、腐殖土中的一种或一种以上的混合基质。
7. 根据权利要求5所述的用途，其特征是所述的培养基质选自琼脂、草炭、珍珠岩、蛭石、木屑、腐殖土中的一种或一种以上的混合基质。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别涉及三氧化二镧在天山雪莲种苗生根和壮苗中的应用。本发明利用La₂O₃促使天山雪莲根的发生和苗生长，通过在无菌培养基质上或者在外界支持物中加入La₂O₃溶液，能够促进天山雪莲种苗高效生根，并提高移栽成活率；同时通过叶面喷洒La₂O₃溶液能够显著增加天山雪莲组培苗的地上部分植株高度和叶片的数目，提高种苗的生长质量，在短期内可获得茁壮的天山雪莲种苗。本发明不仅对天山雪莲种苗的高效生根提供了有效的途径，而且为其它难生根的高山植物的人工生根体系的建立提供了可借鉴的模式。
文档编号A01H4/00GK101161057SQ20061011373
公开日2008年4月16日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者刘春朝, 琼 晏, 斌 郭 申请人:中国科学院过程工程研究所