专利名称：植物种子转化技术的制作方法
技术领域：
本发明专利属于生物技术领域。
背景技术：
外源DNA进入植物基因组，目前主要有愈伤组织的农杆菌介导和基因枪法等技术。但是，受再生体系难、遗传背景差异导致转化率低下等因素，它们仍然处在不断的完善之中。物理手段的使用(如超声波、负压法、脉冲电泳、重离子辐照和γ射线辐照等)也同样存在使用材料有限、转化率低等主要问题。其中与本发明相近的γ射线辐照，因为辐照材料为愈伤组织，要考虑到再生体系、辐照时期和污染等问题，实际操作受到了很大限制。因此面对许多类型植物的转化技术，还需要进一步的不断改进。
发明内容
本发明专利的主要内容与技术特征是将在γ射线辐照后的植物种子(剂量为0.01-10Gy，剂量率为0.1-2Gy/h)，转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源DNA(表达质粒)中浸泡5-300min，然后，在选择性基质中萌发；鉴定、筛选GUS基因瞬间表达的幼苗；利用阳性幼苗可以用作两种后续的处理一是作为外植体，在选择培养基上进行组织培养获得转基因再生植株；二是将阳性幼苗直接移栽盆内或田间，但其后，要每各3-5天，在各株的所有茎尖处点滴50-200μl的相关抗生素(浓度为50-250mg/l)，直至花芽的形成；收获种子进行外源基因鉴定，阳性材料进入下一代种植。
主要用途 本发明在多种植物，特别是在再生体系较难(如单子叶植物)、愈伤组织-农杆菌介导效果差(如十字花科的部分物种等)和转化效率低下等物种的转化上将发挥重要的作用，大大提高转化效率。本项发明在农业生物技术及其应用基础、植物基因组研究等方面有较大的应用价值。
具体实施例方式 实例1 辐照种子的农杆菌介导gus基因的瞬间表达 1.1材料和方法 1.1.1材料 物种取饱满、完好的白菜、小麦、南瓜、芹菜、香菜、玉米、粳稻、籼稻、黑麦、菠菜、苋菜和豇豆等种子；每种取500粒左右供实验使用。
农杆菌及质粒为LBA4404；携带的质粒为pKUC(浙江大学舒庆尧教授实验室)；含抗生素选择基因为卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；报告基因为GUS基因(含内含子序列)；它们的启动子均为CaMV 35S启动子。
1.1.2方法 种子辐照用0.01-10Gy剂量(剂量率为0.1-2Gy/h)的γ射线辐照植物种子。
摇菌农杆菌在LB液体培养基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃条件下，120rpm摇床培养。指数增长的中后期，菌液OD550值为0.20-0.85时用做以下实验。
浸泡在农杆菌悬浮液中分别加入辐照处理和未处理的种子，在15-35℃条件下，浸泡5-300min。
萌发浸泡种子分别点播在含沙土或珍珠岩的盆内；期间，喷洒适量的无菌水(含50mg/L卡那霉素)以保湿润。
gus瞬间表达鉴定种子萌发，幼苗长到3cm高以上时(7-25天内)，剪下植株的少许叶片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm长的小块转入GUS染色液中；在遮光条件下染色6-24小时，设置已知未转化材料为阴性对照和转化材料为阳性对照；染色后，用95％乙醇去叶绿素等物质，直至透明；出现兰色为阳性，否则为阴性，由于GUS基因含插内含子，因此可以排除由农杆菌自身造成的假阳性。染色液成分含0.1M K/NaPO4缓冲液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O；0.1％(v/v)Triton X-100；1ml/mg X-Gluc；抽滤灭菌，-20℃保存。
gus基因表达率的计算。阳性表达率(％)＝GUS蓝色反应株数/浸泡后萌发的总株数。
1.2结果与分析 由表1可知，各个物种的未辐照或未经农杆菌介导的植株幼苗均没有检测出GUS反应阳性，表明实验材料存在的内源gus基因及其表达被排除。而经过辐照处理的种子，均表现了高低不等的阳性表达率，有的高达80％以上，这在发明者所能查阅的文献中，还没有过报道。
表1 辐照种子农杆菌介导后幼苗的gus基因瞬间表达率(％) 1.3结论 来源不同、遗传背景各异的植物种子，通过适宜的γ射线处理，在农杆菌悬浮液中，可以获得很高的外源DNA瞬间表达(如GUS阳性)的转化体。
实例2 辐照种子的外源质粒(gus基因)转化表现 2.1材料和方法 2.1.1材料 物种取饱满、完好的小麦、番茄、白菜和香椿等种子；每种取500粒左右供实验使用。
农杆菌及质粒为LBA4404；携带的质粒为pKUC(来自浙江大学舒庆尧教授实验室)；含抗生素选择基因为卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；报告基因为GUS基因(含内含子序列)；它们的启动子均为CaMV 35S启动子。
2.1.2方法 种子辐照用0.01-10Gy剂量(剂量率为0.1-2Gy/h)的γ射线辐照植物种子。
摇菌农杆菌在LB液体培养基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃条件下，120rpm摇床培养。指数增长的中后期，菌液OD550值为0.20-0.85时用于质粒的提取。
质粒的提取碱裂解法裂解农杆菌；异丙醇-乙醇粗提质粒；PEG沉淀法纯化质粒；溶于TE缓冲液(pH8.0)，-20℃保存。
浸泡用TE缓冲液将质粒稀释到20-350ng/ml浓度，然后分别加入辐照处理和未处理的种子，在15-35℃条件下，浸泡5-300min。
萌发浸泡种子分别点播在含珍珠岩的盆内；期间，喷洒适量的无菌水(含50mg/l卡那霉素)以保湿润。
gus瞬间表达鉴定种子萌发，幼苗长到3cm高以上时(7-25天内)，剪下植株的少许叶片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm长的小块转入GUS染色液中；在遮光条件下染色6-24小时，设置已知未转化材料为阴性对照和转化材料为阳性对照；染色后，用95％乙醇去叶绿素等物质，直至透明；出现兰色为阳性，否则为阴性，由于GUS基因含内含子，农杆菌造成的假阳性可以排除。染色液成分含0.1M K/NaPO4缓冲液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H3O；0.1％(v/v)TritonX-100；1ml/mg X-Gluc；抽滤灭菌，-20℃保存。
gus基因表达率的计算。表达率(％)＝GUS蓝色反应株数/浸泡后萌发的总株数。
2.2结果与分析 由表2可知，小麦、番茄、白菜和香椿的种子在未辐照或未经质粒转化的植株幼苗均没有检测出GUS反应阳性。而经过辐照处理的种子，在质粒转化下也表现了高低不等的阳性表达率，最低香椿也高达30％多。
表2 辐照种子质粒介导后幼苗的gus基因瞬间表达率(％) 2.3结论 同实例1辐照种子经过农杆菌介导的结果一样，辐照的种子在质粒直接转化下，也可以获得外源基因(如gus基因)瞬间表达率较高的转化体。
实例3 瞬间表达的幼苗盆栽-卡那霉素选择获得T0和T1代植株的表现 3.1材料和方法 3.1.1材料 材料来源取实例2的小麦、番茄、白菜和香椿等幼苗，经过GUS染色，选取兰色阳性植株用于移栽。
3.1.2方法 盆内移栽阳性植株移栽在含有肥沃沙土的盆内。每间隔3-5天，在所有茎尖上滴50-200μl的卡那霉素(浓度为50-250mg/L)，直至花芽的形成。
植株GUS染色的鉴定苗期GUS阳性植株在花期剪取顶部幼茎，一部分用于GUS染色，另一部分用于DNA提取，进行PCR鉴定；其株收获的种子进行无菌水发芽(T1代)，随机取一株根尖进行GUS染色，统计阳性表达率(＝再次GUS染色阳性株数/开始阳性反应取样株数)，染色方法见实例1；阳性材料进入下一轮种植。
植株gus基因PCR的鉴定T0代的幼茎部分(见GUS染色)；T1代的材料为测定T1代GUS反应的同一植株的幼叶；CTAB法提取植物全基因组DNA；按文献设计gus基因引物；含gus基因的质粒为阳性对照，未转化植株为阴性对照进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳鉴定，有特异带为阳性植株。
3.2结果与分析 由表3可知，从质粒介导而来的GUS染色阳性幼苗，移栽到盆内，一部分不做任何处理，花期检测GUS染色反应和PCR鉴定，两者阳性率急剧下降，其中香椿为0；另外一部分，为卡那霉素处理，所有实验材料仍然维持较高的阳性率，表明保持选择压力是必要的。对花期GUS阳性的植株(不论是否经过卡那霉素处理)，收获种子，经萌发，测定幼苗GUS反应和进行PCR鉴定，两者阳性率普遍增高。
表3 GUs阳性幼苗盆栽后T0和T1代GUS染色阳性表达率(％)和PCR阳性率(％) 3.3结论 辐照种子经农杆菌介导或质粒直接转化，瞬间表达阳性的植株只有在适当的选择压力下，其后期和后代可以获得阳性率较高的转化体。
实例4 gus基因瞬间表达的番茄和白菜幼苗经过组织培养获得再生植株 4.1材料和方法 4.1.1材料 材料来源取实例2的番茄、白菜和香椿等幼苗，经过幼(子)叶局部和茎尖下段GUS染色测定，选取阳性反应的幼叶和茎尖余下部分为外质体用于组织培养。
4.1.2方法 番茄的组织培养以阳性反应的番茄幼叶余下部分为外质体(12天内)，用70％的乙醇洗45s，无菌水清洗3次；再用3％次氯酸钠浸泡15min，无菌水清洗3-5次；最后用灭菌滤纸吸干其浮水后转入MS+1.0mg/lNAA+0.1mg/l 6-BA+50mg/l卡那霉素培养基诱导形成愈伤组织；两周一次继代培养2-3次，愈伤组织转入MS+0.2mg/l IAA+2.0mg/l 6-BA培养基诱导幼苗分化；分化幼苗转入MS+1.0mg/l 6-BA+1.0mg/l IAA培养基诱导生根；3-5天练苗后，移栽盆内。
白菜的组织培养以阳性反应的白菜子叶余下部分为外质体(7天内)，用70％的乙醇洗30s，无菌水清洗3次；再用3％次氯酸钠浸泡10min，无菌水清洗3-5次；最后用灭菌滤纸吸干其浮水后转入MS+0.8mg/lNAA+0.2mg/l 6-BA+50mg/l卡那霉素培养基诱导形成愈伤组织；两周一次继代培养1次，愈伤组织转入MS+0.2mg/l IAA+1.2mg/l 6-BA培养基诱导幼苗分化；分化幼苗转入MS+0.5mg/l IAA培养基诱导生根；3-5天练苗后；移栽盆内。
香椿的组织培养以阳性反应的香椿茎尖余下部分为外质体(20天内)，用70％的乙醇洗30s，无菌水清洗3次；再用3％次氯酸钠浸泡15min，无菌水清洗3-5次；最后用灭菌滤纸吸干其浮水后转入MS+0.6mg/l2，4-D+100mg/l卡那霉素培养基诱导形成愈伤组织；两周一次继代培养3-4次后，愈伤组织转入MS+0.4mg/lIAA+2.0mg/l KT培养基诱导幼苗分化；分化幼苗转入
IAA培养基诱导生根；3-5天练苗后，移栽盆内。
GUS染色鉴定取再生植株的叶片(每个来源的再生植株只随机选取一株测定)；阳性再生植株(T1)收获的种子进行无菌水发芽，取其根尖(随机选取100株)进行GUS染色；统计阳性表达率，染色方法见实例1。
gus基因PCR的鉴定取植株的幼叶，CTAB法提取植物全基因组DNA；按文献设计gus基因引物；以含gus基因的质粒为阳性对照(质粒来源于实例1)，未转化植株为阴性对照进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳鉴定，有特异带为阳性植株；PCR阳性率(％)＝阳性株数/测定总株数。每个来源的再生植株只随机选取一株测定(同GUS染色测定的材料相对应)；T1代鉴定材料为GUS染色测定的随机选取的100株苗。
4.2结果与分析 实例3表明瞬间表达阳性的植株，在无选择压力下，随着它的生长发育，它很快就会失去外源DNA片段。因此，开展了实例4的研究。由表4可知，经过辐照处理的种子，在质粒转化下幼苗期表现阳性的植株，取其叶或茎尖为外植体，经过组织培养获得再生植株，其GUS阳性表达率和PCR阳性率均超过60％；而随机抽取的再生植株后代幼苗，GUS阳性表达率和PCR阳性率均超过80％。
表4 再生植株和T1代幼苗的GUS染色阳性表达率(％)与PCR阳性率(％) 4.3结论 对辐照种子通过农杆菌介导或质粒直接转化获得的瞬间表达阳性的植株，可以通过组织培养的手段获得更高而稳定的转化体。
权利要求
植物种子转化技术
本发明专利的主要技术特征是将在γ射线辐照后的植物种子(剂量为0.01-10Gy，剂量率为0.1-2Gy/h)，转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源DNA(表达质粒)中浸泡5-300min，然后，在选择性基质中萌发；鉴定、筛选GUS基因瞬间表达的幼苗；利用阳性幼苗可以用作两种后续的处理一是作为外植体，在选择培养基上进行组织培养获得转基因再生植株；二是将阳性幼苗直接移栽盆内或田间，但其后，要每各3-5天，在各株的所有茎尖处点滴50-200μl的相关抗生素(浓度为50-250mg/l)，直至花芽的形成；收获种子进行外源基因鉴定，阳性材料进入下一代种植。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。外源DNA进入植物基因组，目前主要有愈伤组织的农杆菌介导和基因枪法等技术。但是，受再生体系难、遗传背景差异导致转化率低下等因素，它们仍然处在不断的完善之中。物理手段的使用(如超声波、负压法、脉冲电泳、重离子辐照和γ射线辐照等)也同样存在使用材料有限、转化率低等主要问题。其中与本发明相近的γ射线辐照，因为辐照材料为愈伤组织，要考虑到再生体系、辐照时期和污染等问题，实际操作受到了很大限制。因此面对许多类型植物的转化技术，还需要进一步的不断改进。本发明的主要内容与技术特征是将在γ射线辐照后的植物种子(剂量为0.01－10Gy，剂量率为0.1－2Gy/h)，转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源DNA(表达质粒)中悬浮液浸泡5－300min，然后，在选择性的基质中萌发；鉴定、筛选GUS基因瞬间表达的幼苗利用阳性幼苗可以用作两种后续的处理一是作为外植体，在选择培养基上进行组织培养获得转基因再生植株；二是将阳性幼苗直接移栽盆内或田间，但其后，要每各3－5天，在各株的所有茎尖处，点滴50－200μl的相关抗生素(浓度为50－250mg/l)，直至花芽的形成；收获种子进行外源基因鉴定，阳性材料进入下一代种植。
文档编号A01H4/00GK1995358SQ20061012949
公开日2007年7月11日 申请日期2006年11月22日 优先权日2006年11月22日
发明者李兴林, 舒庆尧, 路福平, 夏英武, 吴殿星, 高年发, 张健, 崔海瑞, 傅俊杰 申请人:天津科技大学