专利名称：寒富苹果花药培养植株的方法
技术领域：
本发明涉及农业领域植物育苗的方法，具体地说是寒富苹果花 药培养植株的方法。
背景技术：
苹果是异花授粉植物，在遗传学上具有高度杂合性，要想获得 纯系材料非常困难，若能通过花药培养获得单倍体植株，再经染色 体加倍获取纯系材料则比较容易，此项技术在苹果育种研究中具有 非常重要的意义。
中国农业科学院果树研究所是我国最早利用苹果花药培养单 倍体植株的试验研究机构，其中对元帅、国光、赤阳、金冠、祝光、 红玉、富士、秋锦和红富士等苹果品种的花药进行组织培养获得了 成功。
在相关论文中公布了利用苹果花药组织培养的方法，其内容
是诱导胚状体培养基为MS附加2, 4-D、 IAA、 GA、 K、 BA不同 配比或浓度，蔗糖每升30克，洋菜每升6~7. 5克，PH值5.8左 右；分化培养基为MS附加GA、 IBA、 BA,蔗糖、洋菜、PH值5. 8; 生根培养基为1/2MS附加IAA 1. 5ppm。在温度25 ~ 30°C,光照强 度1500 ~ 2000勒克司，日光照IO小时的培养条件下进行培养，产 生单倍体胚状体。
将单倍体胚状体进行增殖分化成为植株，将分化植株增殖培养 并诱导生根，所获得的植株进行移栽或嫁接，获得植株幼苗。
植株分化将胚状体转移到MS附加GA3 0. l~2ppm, IBA 0. 1~0. 5ppm、 BA lppm的培养基上进行胚状体分化培养。
分化植株的增殖在分化培养基上进行分化植株的增殖培养。
分化植株的诱导生根选取2-3cm高、且生长健壮的植株， 插入到1/2 MS附加IAA 1. 5ppm的生根培养基上诱导生根。
生根植株的移栽将生根植株进行光照锻炼后，在温室条件下 移栽至营养钵中，经过管理以获得苹果幼苗。
嫁接也可将试管植株切下直接嫁接到苹果树嫩梢上，可直接 在田间获得花培植株。
由于在培养基中含有2， 4D激素，虽然对苹果花药诱导胚状体
有利，但影响植株的后期生长与发育。由于寒富苹果品种的花药生 物学特性较为特殊，因此目前所公布的苹果花药培养获取植株的方 法难以满足对寒富品种苹果花药培养植株的需要。
发明内容
为了克服现有苹果花药培养植株方法的不足，本发明提出了寒 富苹果花药培养植株的方法。该方法以寒富苹果的花药为材料进行 培养，解决寒富苹果育种的技术问题。
本发明解决技术问题所采用的方案是
1、-寒富苹果花药的获取与消毒清洗
在花粉发育单核期时釆集花蕾，经双氧水消毒和无菌水冲洗， 剥取花药进行培养。
2、 胚状体的诱导
将花药接种在胚状体诱导培养基上，在温度26~28°C,光照 1500 ~ 2000LX,每天光照IO小时左右的培养室中。经过90~150 天的培养，从花药裂口处产生乳白色具有两片叶子的胚状体。
胚状体诱导培养基组成由MS附加GA3 5mg/L、蔗糖30g/L和 琼脂5. 5g/L的水溶液组成，调整PH-5. 8。
3、 植株分化
将诱导出的胚状体转入植株分化培养基上，在温度26 ~ 28°C, 光照1500 2000LX条件下培养1个月使胚状体转绿增殖，经2个 月分化出幼叶和小植株。小植株可在分化培养基上继代培养增殖。
植株分化培养基组成由MS附加GA3 0. 5mg/L 、 NAA 0. 5/L、 TDZ 1. Omg/L、蔗糖30g和琼脂5. 5g的水溶液组成，PH = 5. 8。
4、 诱导生根和试管苗嫁接
分化植株达到2cm左右高时，可以切下来转入诱导生根培养基 上诱导生根。在温度26 28。C，光照1500 2000LX条件下培养， 经过20天左右培养产生根系。选择诱导生根比较好的植株，经过 光照锻炼后进行移栽。对于不能生根的植株，采用在早春时节先在 温室内盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，待完全成活并已达到半木质 化时再移入田间。
诱导生根培养基组成由1/2MS附加IAA 1. Omg/L、IBA 1. Omg/L 蔗糖20g/L和琼脂5. 5g/L水溶液组成，PH = 5. 8。
本发明方法与已经公布的技术相比，其积极效果是
1、在胚状体诱导培养基中减少了 2， 4-D、 IAA、 K、 BA这几
种价格昂贵激素，不但降低了成本，而且缩短了胚状体诱导所需时
间，由原来的150天开始产生胚状体缩短至90天。
2、 在胚状体分化培养基中，釆用了活性较好的新型激素TDZ， 不仅提高了分化率，而且分化植株生长健壮，有利于植株生根和嫁 接。
3、 采用本发明方法可在3月份于温室盆栽的山丁子上进行嫩枝 嫁接，在人工控制条件下使嫁接成活率大大提高，成活植株生长周 期长，可达到完全木质化而安全越冬。
本发明方法适宜釆用苹果花药培养苹果植株的应用。
具体实施例方式
培养过程
1、 寒富苹果花药的获取与消毒清洗
在花粉发育单核期时采集花蕾，经5%的双氧水消毒和无菌水 冲洗，剥取花药。
2、 胚状体的诱导
将花药接种在胚状体诱导培养基上，在温度26~28°C,光照 1500 ~ 2000LX，每天光照IO小时左右的培养室中。经过90~120 天的培养，从花药裂口处产生乳白色具有两片叶子的胚状体。
胚状体诱导培养基组成由MS附加GA3 5mg/L、蔗糖30g/L、 和琼脂5. 5g/L水溶液组成，PH = 5.8。
3、 植株分化
将诱导出的胚状体转入植株分化培养基上，在温度26 ~ 28°C, 光照1500 2000LX条件下培养1个月使胚状体转绿增殖，经2个 月分化出幼叶和小植株。小植株可在分化培养基上继代培养增殖。
植株分化培养基组成由MS附加GA30. 5mg/L、 NAA 0. 5mg/L、 TDZ 1.0mg/L、蔗糖30g和琼脂5. 5g水溶液组成，PH = 5. 8。 4、诱导生根和试管苗嫁接
分化植株达到2cm左右高时，可以切下来转入诱导生根培养基 上诱导生根。在温度26 28。C，光照1500 2000LX条件下经过20 天左右培养产生根系。选择诱导生根比较好的植株，经过光照锻炼 后转入移栽。也可釆用试管苗嫁接的方法在温室或田间的嫩稍上嫁 接。
诱导生根培养基组成由1/2MS附加IAA 1. Omg/L、IBA 1. Omg/L 蔗糖20g和琼脂5. 5g水溶液组成，PH = 5. 8。
由于在培养基配料中减少了 2， 4-D、 IAA、 K、 BA,所以成本 低，干扰因素少，有利于胚状体的诱导与分化，提高诱导、分化的 成功率。
通过对培养出的小植株的细胞观察采取试管苗的茎尖或根尖 作材料，用铁钒苏木精染色法或去壁低渗吉母沙染色法观察细胞染 色体数为2n=17。
通过苹果花药培养植株生产试验观察，其胚状体诱导率提高 50%以上，植株分化率在50%以上，生根率在60%以上，嫁接成 活率在80%以上，而且嫁接后的苹果植株生长茂盛，发育良好， 证明本发明方法适宜以寒富苹果品种花药培养成植株并在苹果育 种试验中进行应用。
釆用本发明方法与原来直接在田间大树上嫁接相比，既提高了
嫁接成活率，又能使嫁接成活的植株延长生长时间，使其充分成熟 而安全越冬。
本发明方法与已经公布的技术相比，有以下几点改进 1、在胚状体诱导培养基中减少了 2， 4-D、 IAA、 K、 BA这几 种价格昂贵激素，不但降低了成本，而且缩短了胚状体诱导所需时 间，由原来的150天开始产生胚状体缩短至90天就可以产生胚状 体，节省了 60天的时间。
2、 在胚状体分化培养基中，釆用了活性较好的新型激素TDZ, 不仅提高了分化率，而且分化植株生长健壮，有利于植株生根和嫁 接。
3、 花药培养植株生根是较难的，所以试管苗的嫁接是试管苗能 否安全转移到田间的关键环节。原来釆用的方法是6月份在田间苹 果大树的嫩梢上直接嫁接，这种方法的缺点是嫁接时间较晚，温度 高，成活率低，而且成活的植株在越冬前不能完全成熟。改进后釆 用3月份在温室盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，在人工控制条件下 使嫁接成活率大幅度提高，成活植株生长周期长，可达到完全木质 化而安全越冬。
权利要求
1、寒富苹果花药培养植株的方法，包括苹果花药采集、花药处理、花药在培养基中进行胚状体诱导、分化、生根、幼株嫁接步骤，其特征在于(1)、寒富苹果花药的获取与消毒清洗在花粉发育单核期时采集花蕾，经5％的双氧水消毒和无菌水冲洗，剥取花药；(2)、胚状体的诱导将花药接种在胚状体诱导培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX，每天光照10小时左右的培养室中，经过90～120天的培养，从花药裂口处产生乳白色具有两片叶子的胚状体；胚状体诱导培养基组成由MS附加GA3 5mg/L、蔗糖30g/L、和琼脂5.5g/L水溶液组成，PH＝5.8；(3)、植株分化将诱导出的胚状体转入植株分化培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下培养1个月使胚状体转绿增殖，经2个月分化出幼叶和小植株，小植株可在分化培养基上继代培养增殖；植株分化培养基组成由MS附加GA3 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、TDZ 1.0mg/L、蔗糖30g和琼脂5.5g水溶液组成，PH＝5.8；(4)、诱导生根和试管苗嫁接分化植株达到2cm左右高时，可以切下来转入诱导生根培养基上诱导生根，在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下经过20天左右培养产生根系，选择诱导生根比较好的植株，经过光照锻炼后转入移栽，也可采用试管苗嫁接的方法在温室或田间的嫩稍上嫁接；诱导生根培养基组成由1/2MS附加IAA 1.0mg/L、IBA1.0mg/L、蔗糖20g和琼脂5.5g水溶液组成，PH＝5.8；
2、 根据权利要求l所述的培养植株的方法，其特征在于在 植株分化培养基中加有TDZ成分。
3、 根据权利要求l所述的培养植株的方法，其特征在于对 于不能生根的植株，采用在早春时节先在温室内盆栽的山丁子上 进行嫩枝嫁接，待完全成活并已达到半木质化时再移入田间。
全文摘要
本发明涉及农业领域寒富苹果花药培养植株的方法。经过寒富苹果花药的获取与消毒清洗过程1、胚状体的诱导过程2、植株分化过程3和诱导生根和试管苗嫁接过程4完成。与现有技术相比1、在胚状体诱导培养基中减少了2，4-D、IAA、K、BA这几种价格昂贵激素，降低了成本，缩短了胚状体诱导时间60天。2、在胚状体分化培养基中，采用了活性较好的新型激素TDZ，提高了分化率，而且分化植株生长健壮，有利于植株生根和嫁接。3、可在3月份于温室盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，提高成活率，延长生长周期长，可达到完全木质化而安全越冬。本发明方法适宜采用苹果花药培养苹果植株的应用。
文档编号A01H4/00GK101185421SQ20071015891
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者丛佩华, 康国栋, 张利益, 李武兴, 玲 杨, 杨振英, 强 王, 义 田, 薛光荣 申请人:中国农业科学院果树研究所