产生转基因禾本科细胞和植物的方法

专利名称：产生转基因禾本科细胞和植物的方法
技术领域：
本发明涉及用于产生源自禾本科植物的转基因细胞以及源自所述转基因细胞的转基因组织、器官、植物和种子。本发明也涉及这些转基因细胞、组织、器官、植物和种子在农业、植物育种中的用途以及工业应用。

背景技术：
概述 本说明书包含用3.3版PatenIn制备出的核酸和氨基酸序列信息。在序列列表中，用数字指示符<210>和紧接其后的序列标识符(例如<210>1、<210>2、<210>3等)标识出每个核苷酸序列。通过在数字指示符部分<211>、<212>和<213>给出的信息分别标识出每个核苷酸序列的序列长度和类型(DNA、蛋白(PRT)等)以及来源生物体。用术语“SEQ ID NO”和紧接其后的序列标识符定义出本说明书提到的核苷酸序列(例如SEQ ID NO1指的是在序列列表中被称作<400>1的序列)。
对在此提到的核苷酸残基的命名是IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的命名，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，Y代表嘧啶残基，R代表嘌呤残基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鸟嘌呤或胸腺嘧啶，S代表鸟嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶，H代表除鸟嘌呤外的其他核苷酸，B代表除腺嘌呤外的其他核苷酸，V代表除胸腺嘧啶外的其他核苷酸，D代表胞嘧啶外的其他核苷酸，以及N代表任一种核苷酸残基。术语“源自”在此应当用于表示可以从特定来源中获得所特指的事物，尽管不必一定是从所述来源直接获得的。
除非上下文中有其他的要求，在本说明书的全文中，词语“包括”或“包含”都要被理解成表示包括所述的步骤或元件或事物或步骤或元件或事物的组，但是并不排除任何其他的步骤或元件或事物或步骤或元件或事物的组。
除非有特殊的说明或者上下文中有其他的要求，在本说明书的全文中，单一步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组都应当包括一个和多个(即一个或多个)这些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组。
除非有其他特定的说明，在此所述的每个实施方式都可以经必要的调整应用到每个其他的实施方式中。
此外，在此所述的关于禾本科植物或其禾本植物或其部分(例如籽粒或种子)或其子代的实施方式都应当经必要的调整应用到小麦(例如小麦植物或小麦植物部分或小麦植物的子代)。
就涉及一种或多种禾本科植物、植物种类或植物种类的品种的任何实施方式而言，在此所述的本发明能够单独地涉及和要求保护一种特殊的禾本科植物、植物种类或品种，并可与任何其他禾本科植物、植物种类或品种相区分，而无需具体提及涉及该种具体禾本科植物、植物种类或品种的实施方式。这样做的条件是该要求保护的所述禾本科植物、植物种类或品种已经在本发明的任何实施方式中被具体地提及。
就涉及细菌用途的任何实施方式而言，在此所述的本发明能够单独地涉及和要求保护一种细菌，并可与任何其他细菌相区分，而无需具体提及涉及该种具体细菌的实施方式。这样做的条件是该要求保护的所述细菌已经在本发明的任何实施方式中被具体地提及。
就涉及用于向胚细胞内引入核酸的任一方法的任何实施方式而言，在此所述的本发明能够单独地涉及和要求保护一种用于向胚细胞内引入核酸的具体方法，并可与任何其他用于向胚细胞内引入核酸的方法相区分，而无需具体提及涉及该种用于向胚细胞内引入核酸的具体方法的实施方式。这样做的条件是该要求保护的所述用于向胚细胞内引入核酸的方法已经在本发明的任何实施方式中被具体地提及。
本领域人员明白在此所述的方法可以进行除了具体描述的那些变化和修饰外的变化和修饰。要明白本发明包括所有的这些变化和修饰。本发明也包括本说明书单个地或共同地提及的或标明的所有步骤、性能、组合物和化合物以及任何两个或多个所述步骤或性能的任一组合和所有组合。
本发明的范围并不受在此所述的具体实施方式
的限制，所述具体实施方式
只是用于举例说明的目的。功能上等效的产品、组合物和方法明显也在在此所述的本发明的范围之内。
无需过多的试验，本发明都用传统的分子生物学技术、微生物学技术、病毒学技术、重组DNA技术、溶液肽合成技术、固相肽合成技术和免疫学技术进行，除非有其他的说明。例如在下面的文献中都描述了这些方法，在此通过引用将其并入本申请 1.Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition(1989)，所有的卷I、II、和III； 2.DNA CloningA Practical Approach，VoIs.I and II(D.N.Glover，ed.，1985)，IRL Press，Oxford，全文； 3.Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(M.J.Gait，ed.，1984)IRL Press，Oxford，全文；特别是其中Gait，pp 1-22、Atkinson et al，pp35-81、Sproat etal，pp83-115、和Wu et al，pp135-151的内容； 4.Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford，全文； 5.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)； 6.Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology(W.V.Dashek，ed.，1997)CRC Press，全文； 7.Methods of Molecular BiologyPlant Cell and Tissue Culture(J.Polland，ed.，1990)Humana Press，全文
背景技术：
小麦是人类最为丰富的能量和营养来源之一。至今为止，利用传统的育种技术例如伴有数代选择和回交的从一系到另一系的渐渗技术已经将大多数造成小麦的植物产量和/或营养价值提高的有益性状引入到了小麦内。
因为小麦是一种重要的被广泛种植的农作物，以及因为针对农作物改良的传统植物育种方法是费时的，因此生产表达相关表型的经遗传加工过的小麦(即转基因小麦)是非常吸引人的。但是，当产生转基因双子叶植物的现有方法应用于单子叶植物，特别是不同的小麦品种的时候，所述方法不能发挥作用或者不能有效或可靠的发挥作用。
本领域人员要明白术语“转基因”表示除了植物、细胞或部分中天然存在的核酸外还包括其他遗传物质的植物或植物细胞或植物部分(例如植物组织或植物器官)。例如，转基因植物或植物细胞或植物部分的基因组可以包括来自不同生物体例如动物、昆虫、细菌、真菌或不同植物种类或品种的核酸。或者，转基因植物或植物细胞或植物部分的基因组可以包括一个或多个附加拷贝的天然存在于同一植物种类或品种中的核酸。或者，转基因植物或植物细胞或植物部分的基因组可以包括非天然存在的核酸例如RNAi。相对于同基因的或近似同基因的天然存在的植物而言，转基因植物或植物细胞或植物部分的基因组也可以含有缺失，例如同源重组或重组酶诱导性重组造成的基因缺失。
术语“植物部分”用于表示植物的组织或器官，包括任何繁殖材料例如种子。
一般而言，转基因植物或植物细胞或植物部分的生产包括 (i)转化，其中将核酸引入到植物原生质体或植物细胞的核基因组中，以便产生转化细胞；和 (ii)再生，其中通过器官发生或胚发生的方法从转化细胞产生了在其细胞的基因组中携带有引入核酸的植物组织、器官或整个植物。
术语“器官发生”在此表示从分生组织中心次序地发育出苗和根的过程。
术语“胚发生”在此表示按协同方式(非次序的)从体细胞或配子一起发育出苗和根的过程。
本发明提供了特别用于小麦的改良改造的方法，但所述方法与现有的用于获得再生的方法结合时，本发明提供了用于可靠地改良这种有价值的农作物的工具。
用于向小麦内引入核酸的方法 原生质体摄取核酸、粒子轰击介导的转化以及土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化都已经被用于转化小麦。这些方法通常涉及原生质体、花序、胚愈伤组织、或不成熟胚用作转化原材料的用途。
本领域人员要知道术语“原生质体”表示其中例如通过利用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的组合的酶消化作用已经人为地去除了细胞壁的植物细胞。
在本文的上下文中，“花序”表示花的结构，通常表示不成熟的或发育中的花蕾。
术语“愈伤组织”表示通过培育植物组织或器官一段时间以及在没有再生的情况下足以发生细胞分裂的条件下产生的未分化细胞的簇或组。在植物组织培养领域，愈伤组织通常被认为是非天然存在的组织。
术语“胚愈伤组织”表示在组织培养中源自胚的愈伤组织，一般是在种子发育的线性籽粒灌浆期(linear grain filling stage)。
术语“胚”表示在萌发过程中产生幼苗的种子部分。本领域人员要知道除了盾片外，来自小麦谷粒的胚还包括包含在胚根鞘内的胚根(胚根(radicle))以及包含在胚芽鞘内的苗端。
术语“不成熟胚”在本领域中表示源自开花期后(d.p.a.)约10到18天的小麦种子，以及更常见的源自约14到15天d.p.a.的小麦种子(见例如Weeks et al，Plant Physiol，1021077-1084，1993；Delporte et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture 80139-149，2005以及发表的国际申请WO97/48814)。在这个发育阶段，小麦种子具有以下特征(i)胚乳细胞的快速细胞分裂，例如分裂指数所示；(ii)胚乳的核内复制，例如DAPI染色所示；(iii)胚乳内DNA含量的增加，如DAPI染色所示；(iv)种子鲜重的增加；(v)胚乳中含水量的增加；和(vi)胚乳中淀粉含量的增加。简单地，种子处于发育的籽粒灌浆期。这些植物材料已经被认为是对转化最为有用的材料，因为胚细胞在这个阶段是快速分裂的。
原生质体摄取核酸 为了产生原生质体，必须要去除植物细胞的细胞壁。用于产生原生质体的方法在本领域是已知的，例如在Potrykus and Shillito，Methods in Enzymology118，449-578，1986中对此有所描述。
通过对原生质体的细胞膜进行物理的或化学的透化作用可以将裸核酸(即非载体、媒介、细胞、噬菌体或病毒所含的核酸)引入到植物原生质体内(Lorz et al，Mol.Gen.Genet.199178-182，1985和Fromm et al，Nature，319791-793，1986)。
用于将核酸引入到原生质体内的优选的物理方法是电穿孔，其包括给原生质体应用短暂的、高电压的电脉冲，据此在细胞膜上形成纳米大小的孔。通过这些孔将核酸摄取到细胞浆内。或者，通过伴有孔闭合的细胞膜组分的再分布可以经细胞膜摄取核酸。核酸可以从细胞浆转运到细胞核内，在所述核中核酸被整合到基因组内。
用于将核酸引入到原生质体内的优选的化学方法利用了聚乙二醇(PEG)。PEG介导的转化一般都包括在足以穿透原生质体的细胞膜的条件下，在PEG溶液中，用相关核酸处理原生质体一段足以穿透原生质体的细胞膜的时间。然后通过在细胞膜上产生的孔摄入核酸，并将其保留为游离型质粒或被将其整合到原生质体的基因组内。
不过，这些物理和化学的方法都降低了原生质体的活力并阻碍了它们的分裂能力，据此造成了非常低的转化效率。此外，只有在这些所测试的植物种类的很小范围的基因型中实现了转化原生质体的成功的和可靠的再生。原生质体介导的转化所需的延长培养条件也会诱导突变，包括体细胞克隆变异，这常常会造成不育植物的再生。
粒子轰击介导的转化(Biolistic转化) 粒子轰击介导的转化也可以将裸核酸转移到植物细胞内(Sanford et al，J.Part.Sd.Technol.527，37，1987)。这个技术包括将致密核酸涂层的微粒例如金粒或钨粒加速到能够穿透植物细胞壁和核的有效速度。然后将所引入的核酸整合到植物基因组内，由此产生转基因的植物细胞。然后用该细胞再产生转基因植物。
但是，对于大多数种植的小麦品种而言，利用粒子轰击的转化效率仍然是低的，一般是约0.1％到约2.5％(Patnaik and Khurana，BMC Plant Biology，35-15，2003)。这意味着需要大量未成熟的胚和/或外植体来产生甚至少数的转化植物。这就增加了生产费用。
此外，粒子轰击介导的转化经常造成多个拷贝的引入核酸被整合到植物细胞的基因组内。这些多拷贝与经抑制或共抑制造成的引入核酸的不需要的表达下调有关(Rakoczy-Trojanowska，Cell and Molecular Biology Letters，7849-858，2002)。多拷贝的外源性引入核酸的存在对于国家监督机构来说通常也是不可接受的，所述机构的批准对于商品化而言是重要的。这一部分是为了确保能够完全表征出转基因植物的引入核酸的插入位点及其遗传性。因此，多个拷贝的引入核酸的存在是不需要的。
粒子轰击技术也是昂贵的，因为它们需要使用特殊的装置。
Patnaik和Khurana(BMC Plant Biology，35-15，2003)已经利用粒子接到的转化技术转化了来自成熟小麦胚的胚愈伤组织。在这种情况中，从其中盾片已经变硬了的籽粒中分离出胚，并培养约2周，以产生愈伤组织。然后从变硬的盾片中物理地分离出愈伤组织，并再培养1周。转化愈伤组织，而不是胚，从转化的愈伤组织中再生出转基因植物。这个技术的缺点是在转化之前从胚产生愈伤组织所需的大量时间。
土壤杆菌介导的转化 根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是主要发生在双子叶植物中的冠瘿病的致病菌。在感染过程中，肿瘤诱导性片段或细菌携带的Ti质粒被转移到植物基因组中，其中它被稳定地整合到宿主植物的基因组内(Hooykas and Beijersbergen，Ann.Rev.Phytopathol.，32157-179，1994)。然后通过宿主RNA聚合酶II转录被转移到宿主细胞内的核酸(Kahl and Schell(1982)，Molecular Biology ofPlant Tumors，Academic Press，New York)。
对从根瘤土壤杆菌到植物的基因转移的研究已经促进了遗传修饰的细菌菌株的开发，所述菌株容许基因转移且不会发生疾病。例如，Horsch(Science，2271229-1231，1985)显示了利用缺乏引起冠瘿病的基因的根瘤土壤杆菌将外来核酸成功的转移到烟草内。从这个研究报道开始，根瘤土壤杆菌已经被用于产生来自多种双子叶植物的转基因细胞，从所述转基因细胞产生转基因植物。用于转化植物的土壤杆菌系统提供了一些优于其他转化方法的优点，例如快速产生转基因植物，使用多种用于转化的植物细胞中的任何一种植物细胞，和廉价实施的相当容易的方法。
但是，土壤杆菌介导的转化还不能容易地应用到单子叶植物，小麦已经被证实对这种方法的转化是特别抵抗的，例如Birch Annu.Rev.Plant Physiol，48793-797，1997。例如，虽然Mooney等Plant Cell，Tissue and Organ Culture，25209-218，1991报道了对来自约12到16d.p.a.的种子的不成熟小麦胚的土壤杆菌介导的转化，但是作者不能再生出任何转基因植物。同样，虽然Ishida等Nature Biotechnology 14745-750，1996和EP 0 672752报道了对玉米和稻的不成熟胚的土壤杆菌介导的转化，但是他们不能证实对其他谷类农作物的成功转化，特别是小麦的成功转化。这两种方法的其他缺点是需要不成熟的胚组织。这些组织在全年中均不容易得到，并要求使用特殊的装置以及获得足够多的资源例如劳动力以便确维持续的供应原材料。
Amoah等Journal of Experimental Botany.521135-1142，2001阐述了对源自小麦花序的愈伤组织的土壤杆菌介导的转化，但是当用没有预处理过的花序组织产生愈伤组织时，这并不能获得转基因细胞。在这个报道中，在愈伤组织组织而不是在花序组织中发现了转基因细胞。此外，Amoah等不能从转基因愈伤组织中再生出任何的转化植物。
在本领域中，对用于产生能够被再产生具有所需表型例如提高产量和/或抗虫性和/或抗旱性的转基因组织、器官或整个植物的转基因的小麦细胞的快速的和廉价的方法有着非常明显的需求。


发明内容
本发明提供了用于转化禾本科植物的细胞(即禾本科植物细胞)的可靠的和有效的细菌介导的方法，其可应用于大量不同的植物包括例如小麦。本发明人已经发现来自成熟籽粒的胚可以被直接用作对来自禾本科植物的细胞的细菌介导的转化的原材料，这就克服了对产生胚愈伤组织的组织培养步骤的需要。在这个方面，发明者已经证实了不同于常规认识的看法，即愈伤组织形成本身并非成功转化禾本科植物细胞所必需的。通过避免这些步骤，本发明人也降低了与愈伤组织形成所需的组织培养相关的转基因细胞和植物中的体细胞克隆变体的机会。此外，由于使用成熟的种子，这相对于未成熟胚或愈伤组织是可大量供应的，因此本发明提供了优于现有技术方法的显著的时间和费用的节省。本发明人已经正式了这种细菌介导的转化方法在大量小麦品种和大麦、稻和玉米的广泛应用性，据此显示这是一种用于不依赖于其基因型来转化禾本科植物的稳健系统。
在这个方面，本发明人已经用小麦作为禾本科植物的模式系统，因为至今为止小麦植物被普遍地证实为抗细菌介导的转化，特别是土壤杆菌介导的转化。
本发明人也已经通过产生转基因小麦细胞、转基因大麦细胞、转基因稻细胞和转基因玉米细胞证实了用于转化禾本科植物的方法的普遍可应用性。
根据在此所述的发明方法产生的转化禾本科植物细胞能够进行随后的再生，以便再产生带有引入核酸的植物部分、小植物和整个植物，即转化的植物部分和转化的整个植物。对于本领域人员显而易见的是，本发明的方法可用于产生例如由于具有内源性基因的修饰表达或者引入基因的比较表达而表达一种或多种所需的表型例如增强了的抗旱性和/或抗真菌病原体的繁殖种群。
因此，本发明提供了用于产生转基因的禾本科植物细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟的禾本科籽粒获得胚细胞；和 (ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的禾本科植物细胞。
术语“禾本科”在此应取其最广泛的含义，表示任何单子叶的真草或其部分，优选地来自禾本科。合适的植物种类对于本领域人员是显而易见的。合适的禾本科植物的实例包括例如来自山羊草属(Aegilops)、冰草属(Agropyron)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecuris)、须芒草属(Andropogon)、燕麦草属(Arrhenatherum)、芦竹属(Arundo)、燕麦属(Avena)、雀麦属(Bromus)、垂穗草属(Bouteloua)、野牛草属(Buchloe)、拂子茅属(Calamagrostis)、蒺藜草属(Cenchrus)、虎尾草属(Chloris)、蒲苇属(Cortaderia)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinocloa)、蟋蟀草属(Eleusine)、野麦属(Elymus)、画眉草属(Eragrostis)、蔗茅属(Erianthus)、羊茅属(Festuca)、甜茅属(Glyceria)、绒毛草属(Holcus)、大麦属(Hordeum)、滨麦属(Leymus)、黑麦草属(Lolium)、乱子草属(Muhlenbergia)、稻属(Oryza)、落芒草属(Oryzopsis)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、草芦属(Phalarus)、梯牧草属(Phleum)、茶轩竹属(Pseudosasa)、总序竹属(Racemobambos)、赤竹属(Sasa)、葸劳竹属(Schizostachium)、鬣刺属(Spinifex)、针茅属(Stipa)、Teinostachywn、筱竹属(Thamnocalamus)、三齿稃属(Triodia)、小麦属(Triticum)、玉山竹属(Yushania)或玉蜀黍属(Zea)的植物。其他合适的属对于本领域人员也是显而易见的。例如，禾本科植物是裸麦草(即黑麦草属)或大麦(即大麦属)或稻(例如稻属)或玉米(例如玉蜀黍属)或小麦。
因此，本发明提供了用于产生转基因的裸麦草细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟的裸麦草籽粒获得胚细胞；和 (ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个所述细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的裸麦草细胞。
术语“裸麦草”在此应当表示属于禾本科的黑麦草属或丛生草的任一植物。裸麦草通常是二倍体，2n＝14，与羊茅属非常接近。黑麦草类一般分成远系繁殖种类例如浮床黑麦草(L.multiflorum)或多年生黑麦草(L.perenne)以及近系繁殖种类例如毒麦(L.temulentum)或欧毒麦(L.persicum)。
因此，本发明也提供了用于产生转基因的大麦细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟的大麦籽粒获得胚细胞；和 (ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个所述细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的大麦细胞。
术语“大麦”在此应当表示大麦属的任一植物。大麦类为一年生或多年生植物，其多倍体水平范围是从2x、4x到6x，基础染色体数目x＝7。术语大麦属包括例如球茎大麦(H.bulbosum)、滨海大麦(H.murinum)、H.brachyantherum、H.patagonicum、H.euclaston、H.flexuosum或大麦(H.vulgare)这些种类。优选地，大麦属植物是大麦。
因此，本发明也提供了用于产生转基因的稻细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟的稻籽粒获得胚细胞；和 (ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个所述细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的稻细胞。
术语“稻”应当表示稻属或菰属(zizania)的植物。术语稻包括例如稻(O.sativa)、普通野生稻(O.ruflpogon)、高杆野生稻(O.alta)、澳洲野生稻(O.australiensis)、短舌野稻(O.barthii)、O.brachyanih、紧穗野生稻(O.eichingeri)、非洲栽培稻(O.glaberrima)、大颖野生稻(O.grandiglumis)、颗粒野生稻(O.granulata)、阔叶野生稻(O.latifolia)、长护颖野稻(O.longiglumis)、长药野生稻(O.longistaminata)、小粒野生稻(O.minuta)、尼瓦拉野生稻(O.nivara)、药用野生稻(O.officinalis)、斑点野生稻(O.punctata)、马来野生稻(O.ridleyi)、沼生菰(Z.palustris)、水生菰(Z.aquatica)、德克萨斯野生稻(Z.texana)或茭白(Z.latifolia)。优选地，稻是稻。
因此，本发明也提供了用于产生转基因的玉米细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟的玉米籽粒获得胚细胞；和 (ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个所述细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的玉米细胞。
术语“玉米”在此应当表示玉蜀黍属的植物。优选地，术语玉米包括玉米种类中的任一植物。术语玉米包括例如硬粒玉米(Z.mays indurate)、Z.maysindenta、Z.mays everta、甜玉米(Z.mays saccharata)、粉质玉米(Z.maysamylacea)、Z.mays tunicata和/或糯玉米(Z.mays Ceratina Kulesh)这些种类。
因此，本发明也提供了用于产生转基因的小麦细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟的小麦籽粒获得胚细胞；和 (ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个所述细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的小麦细胞。
在一个实例中，本发明提供了用于产生转基因小麦细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟小麦籽粒获得胚细胞；和 (ii)用包括核酸构建体的土壤杆菌接触所述胚细胞，所述构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触是在足以使得所述土壤杆菌将所述转移核酸引入到一个或多个所述细胞内的条件下接触一段时间，由此产生转基因的小麦细胞。
术语“小麦”在此取其最广泛的含义，其表示能够产生直立花穗及亮褐色籽粒并属于山羊草属-小麦属组例如小麦和山羊草的一年生或多年生植物。根据在此所述的描述，合适的种类和/或品种对于本领域人员是显而易见的。
术语“小麦”也包括任一四倍体、六倍体和异源多倍体(例如异四倍体和异六倍体)的山羊草或小麦，其携带有异六倍体小麦或其变体的A基因组和/或B基因组和/或D基因组。这包括A基因组二倍体(例如一粒小麦(Triticum monococcum)和乌拉尔图小麦(T.urartu))、B基因组二倍体(例如斯佩特状山羊草(Aegilops speltoides)和斯氏麦草(T.searsii))和非常接近的S基因组二倍体(例如沙融山羊草(Aegilops sharonensis))、D基因组二倍体(例如节节麦(T.tauschii)和节节麦(Aegilops squarrosa))、四倍体(例如波斯小麦(Triticum turgidum)和提莫非维小麦(T.dicoccum)(AABB)、节节麦(Aegilops tauschii)(AADD))、和六倍体(例如普通小麦(Triticumaestivum)和密穗小麦(T.compactum))。术语“小麦”可以包括山羊草或小麦的品种、栽培品种和品系，但是并不限定于其任何特定的品种、栽培品种和品系，除非有特定的说明。在一个实例中，小麦是冬小麦。在这个方面，小麦是在冬季之前(例如冻土发生之前)发芽、然后处于休眠状态直到春天土壤暖和的小麦。在另一个实例中，小麦是夏小麦或春小麦。在这种情况中，夏小麦或春小麦是在春天播种并在夏天成熟的小麦。本领域人员知道冬小麦的品种(例如Tennant或Brennan或Warbler或Currawong或Whistler)和/或夏小麦的品种(例如Satu或Turbo或Nandu或Opal或Gaby)。
在本发明的上下文中，术语成熟籽粒应当表示其中籽粒灌浆是完全的或接近完全的籽粒。例如，术语“成熟小麦籽粒”指的是其中籽粒灌浆是完全的或接近完全的小麦籽粒或种子，优选地还具有以下特征 (i)存在没有可检测到的分裂的胚乳细胞(例如分裂指数为0或接近0)；和/或 (ii)已经停止核内复制的胚乳细胞；和/或 (iii)具有低含水量胚乳的胚乳细胞，即已经开始了种子的干燥。
例如，术语“成熟大麦籽粒”指的是其中籽粒灌浆是完全的或接近完全的大麦籽粒或种子，优选地还具有以下特征 (i)存在没有可检测到的分裂的胚乳细胞(例如分裂指数为0或接近0)；和/或 (ii)具有低含水量胚乳的胚乳细胞，即已经开始了种子的干燥；和/或 (ii)粒(kernel)含水量不超过约40％。
术语“成熟稻籽粒”指的是其中籽粒灌浆是完全的或接近完全的稻籽粒或种子，优选地还具有以下特征 (i)圆锥花序(panicle)或籽粒的颜色为黄色；和/或 (ii)具有低含水量胚乳的胚乳细胞，即已经开始了种子的干燥。
术语“成熟玉米籽粒”指的是其中籽粒灌浆是完全的或接近完全的玉米籽粒或种子或粒，优选地还具有以下特征 (i)存在没有可检测到的分裂的胚乳细胞(例如分裂指数为0或接近0)；和/或 (ii)在玉米籽粒或种子或粒内形成了黑色细胞层；和/或 (iii)粒含水量不超过约35％。
要明白的是，对于使用本发明的方法而言，成熟籽粒实际上没有完成籽粒灌浆和/或进行果皮(pericarp)的枯萎和/或具有硬的盾片、或者能够完成萌发，这并非是至关重要的。事实上，本发明的一个实例清楚地包括应用没有完成籽粒灌浆的成熟籽粒。对于小麦而言，这些籽粒通常具有圆形外观，这说明籽粒灌浆是接近完全的，优选地还具有绿色的果皮。
对于本领域人员显而易见的是，术语“成熟小麦籽粒”在本发明的上下文中一般表示龄期为至少约30d.p.a.以及优选地至少约35d.p.a.或者至少约40d.p.a.，其中完成或接近完成了种子发育的籽粒灌浆期。术语“成熟大麦籽粒”在本发明的上下文中一般表示龄期为至少约30d.p.a.以及优选地至少约35d.p.a.或者至少约40d.p.a.，其中完成或接近完成了种子发育的籽粒灌浆期。术语“成熟稻籽粒”在本发明的上下文中一般表示龄期为至少约25d.p.a.以及优选地至少约30d.p.a.或者至少约35d.p.a.，其中完成或接近完成了种子发育的籽粒灌浆期。术语“成熟玉米籽粒”在本发明的上下文中一般表示龄期为至少约35d.p.a.以及优选地至少约40d.p.a.或者至少约45d.p.a.，其中完成或接近完成了种子发育的籽粒灌浆期。
在一个实例中，本发明的方法利用了由干籽粒或种子组成的成熟籽粒。在干种子中，储存蛋白和淀粉的蓄积是完全的，果皮开始与母源上皮融合，种皮细胞被压缩，以及糊粉开始产生与渗透保护和/或抗旱性相关的蛋白。
本领域人员知道来自其他禾本科植物例如黑麦草属的成熟籽粒的特征。
利用在此所述的描述可以容易地鉴定并区分开成熟种子或籽粒和未成熟种子。
在本发明的上下文中，术语“成熟籽粒的胚细胞”应当包括任一数目的胚细胞或整个胚，可以有或没有周围的非胚组织例如果皮、胚乳、糊粉。优选地，术语“来自成熟籽粒的胚细胞”应当包括任一数目的胚细胞或整个胚，基本上没有果皮和/或胚乳和/或糊粉。“基本上没有”在本文中表示不到约5-10％重量的污染，优选地不到约10-20％重量的污染，更优选地不到约20-40％重量的污染。
用于本发明中的优选的胚细胞是来自上胚层或盾片的细胞。因此，本发明清楚地涉及包括上胚层和/或盾片细胞或组织的胚组织的用途。
术语“成熟籽粒的胚细胞”在本文中也应当表示天然存在的胚细胞，即不是通过组织培养方法直接产生的胚细胞。因此，在缺少诱导愈伤组织形成或者去分化胚细胞或者从胚细胞产生去分化的细胞的步骤时，这些胚细胞就存在于胚内。因此，在一个实例中，在足以容许所述胚细胞形成愈伤组织的条件下，来自成熟种子的胚细胞接触细菌一段时间。这意味着例如本发明所用的胚组织没有在含有合成植物生长素例如2，4-二氯苯氧乙酸的介质中预培育或保存一段相当长的时间例如至少约2周。但是这并不排除在接触细菌之前将成熟种子或其所形成的胚细胞在组织培养基中进行短期保存，例如不到约3天，优选地不到约2天，更优选地不到约1天，以及仍更优选地不到约8个小时。
术语“从成熟籽粒获得胚细胞”应当包括从在此上面所定义的成熟籽粒的细胞中分离或分选出胚细胞。用于获得胚细胞的优选方法包括例如切下胚组织。在一个实例中，本发明的方法包括例如用解剖刀切下成熟种子的胚组织(例如上胚层和/或盾片或其片段)。
能够将核酸引入到植物细胞中的合适的细菌对于本领域人员是显而易见的。优选地，细菌是能够将核酸引入到植物细胞内和/或转化植物细胞的土壤传播的细菌。在这种情况中，术语“土壤传播”只要求细菌种或属最初是从土壤来源中鉴定到的或分离出的或者天然存在于土壤中的。这个术语并不要求本发明的转化方法所用的细菌确实是在土壤内的。
优选地，细菌是任一细菌，例如土壤杆菌属或根瘤菌属或大豆根瘤菌属或中间根瘤菌属的细菌。优选地，细菌是土壤杆菌种。不需要过多的试验，“土壤杆菌”的多种种类或菌株都适用于实施本发明的方法，只要它们能够将转移核酸转运到植物细胞内。优选的种类包括根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)。依据在此所述的描述，本领域人员对于优选的土壤杆菌菌株是显而易见的。
“接触”表示细菌例如土壤杆菌与成熟籽粒的胚细胞进行物理接触或者共培养。这些方法包括将组织浸泡到包括细菌的溶液内，或者将细菌滴到成熟籽粒的胚细胞上。在此包括所有本领域已知的用于用细菌特别是土壤杆菌接种植物组织的方法，包括随后植物组织与细菌共培养的方法，条件是胚细胞在其接种细菌之前没有进行诱导愈伤组织形成的组织培养步骤。
优选的足以使得细菌将转移核酸引入到胚细胞内的条件包括在足以使得所述细菌结合或连接到所述胚细胞的条件下用细菌接触胚细胞一段时间。在一个实例中，这些条件也足以使得所述细菌将转移核酸引入到胚细胞内(即共培养)。合适的共培养方法是本领域已知的和/或在此描述的方法。
术语“核酸构建体”应当表示任何包括能够被细菌转运到成熟籽粒的胚细胞内的转移核酸的核酸。例如，核酸构建体可以包括载体例如包括相关转基因的Ti载体或Ri载体。
术语“转移核酸”在此指的是通过细菌(优选地是土壤杆菌)被引入到植物细胞内的核酸构建体的区域或组分。例如，转移核酸可以包括来自Ti载体或Ri载体的转移DNA(T-DNA)，即在转化期间被转移到植物细胞内的Ti载体或Ri载体的一部分。转移核酸通常位于Ti载体或Ri载体的左边界(LB)和右边界(RB)之间，以及任选地包括LB和/或RB系列以及包括所谓“转基因”的插入DNA。本领域人员要知道在细菌介导的转化期间多个拷贝到LB和/或RB可以被引入到植物细胞内。因此，转移核酸可以包括多个拷贝的LB和/或RB。
出于命名的目的，左边界的核苷酸序列被设定为SEQ ID NO1，右边界的核苷酸序列被设定为SEQ ID NO2。
术语“转基因”在此应当表示需要被引入到禾本科植物细胞内并由此产生转基因的禾本科植物细胞的转化核酸的一个区域。本发明的普遍可应用性并不受转基因的性质或者其是否表达或者甚至产生或修饰表型的限制。根据在此所述的描述，合适的转基因对于本领域人员而言是显而易见的。
要明白的是，转基因并不一定要在其所引入的转基因细胞或植物内表达。例如，转基因可以包括能够诱导转录基因沉默的核苷酸序列(例如转录同源性依赖的基因沉默)，或者包括由有助于变体鉴别的分子标签例如特殊DNA系列组成的核苷酸序列。
在一个实例中，转基因在蛋白或RNA水平的表达可以赋予、诱导或增强转基因细胞或植物的表型。示例的转基因能够表达能够降低或阻止基因在植物细胞内的表达的干扰RNA、抗体酶或核酶。或者，转基因能够表达肽、多肽或蛋白例如报告子分子或选择标记物或者仅仅是有助于变体鉴定的标签。术语“表达”在此应当表示至少转录核苷酸序列产生了RNA分子。在本发明的一些实施例中，术语“表达”还表示翻译所述RNA分子产生了肽、多肽或蛋白。对于可表达的转基因而言，优选地是转基因与在禾本科植物细胞内可操纵的启动子相连接，所述禾本科植物细胞优选地是小麦细胞。
术语“启动子”在此取其最广泛的含义，并包括基因组基因的转录调节序列，包括TATA框或启动子元件，这都是正确的转录启动所需的元件，可有或没有附加的调节元件(例如上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，所述附加的调节元件例如应答于发育和/或外界的刺激或以组织特异性方式改变核酸(例如转基因)的表达。在本文中，术语“启动子”被用于描述赋予、激活或增强与其可操纵连接的核酸(例如转基因和/或选择标记物基因和/或可检测标记物基因)的重组的、合成的或融合的核酸或衍生物。优选的启动子可以包含附加拷贝的一种或多种特殊的调节元件，以便进一步增强表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或短暂表达。
术语“可操纵的连接”“相连接”“可操纵地连接于”表示启动子相对于核酸(例如转基因)的定位，使得核酸的表达受到启动子的控制。例如，启动子通常位于核酸的5’端(上游)，其控制所述核酸的表达。为了构建出异源的启动子/核酸组合(例如启动子/转基因和/或启动子/选择标记物基因组合)，优选地是启动子距离基因转录起点的距离与启动子和其在天然环境中控制的核酸(即启动子所来源的基因)之间的距离近似相等。和本领域已知的那样，可以对这个距离进行一些变异，且不丧失启动子功能。
如在此所举例说明的那样，本发明人通过在转化之前去除胚细胞的糊粉和/或种皮已经增强了本方法的转化效率。因此，在一个实例中，本发明的方法还包括在用细菌接触所述细胞之前从胚细胞去除种皮和/或糊粉。本领域人员知道划破(scarification)或去除种皮的方法例如酸蚀作用或机械去除。如果需要特异地转化盾片细胞，可能需要使用不具有硬盾片的种子，以便当去除种皮时能够容许保留这些细胞。当转化上胚层时，这就不是主要的问题。
如在此举例说明的那样，本发明人通过在接种和/或共培养培养基即其中接种细菌和/或共培养胚细胞和细菌的培养基中包含氮源例如从大豆中分离到的氮源已经附加地增加了转化效率。因此，对于在存在提供氮源的化合物中进行的接种和/或共培养而言，优选地使用细菌，优选地是土壤杆菌。本文中优选的氮源包括例如蛋白胨，即植物或动物蛋白的酶消化物或酸水解物。例如，在存在源自大豆的蛋白胨例如大豆蛋白胨时进行接种和/或共培养。其他的蛋白胨对于本领域人员是显而易见的，并包括例如从源自或分离自土壤杆菌能够感染的植物中产生的蛋白胨。
在一个实例中，本发明的方法还包括提供、生产或获得包括核酸构建体的细菌。例如，本发明的方法包括利用本领域已知的方法例如电穿孔或三亲株交配将核酸构建体引入到细菌内。
再者或另外，本发明的方法还包括例如利用本领域已知的或在此所述的方法提供、生产或获得核酸构建体。例如，本发明的方法还包括放置与在禾本科植物细胞内可操纵的启动子可操纵连接的转基因。然后将这种转基因插入到例如克隆到合适的核酸载体内，例如Ti载体或Ri载体。
优选地，本发明的方法还包括删除和/或选择转基因的禾本科植物细胞。为了促进这种选择和/或删除，被引入到禾本科植物细胞内的转移核酸优选地包括在禾本科植物的细胞内可操纵的选择标记物基因和/或可检测的标记物基因。或者，用包括可检测和/或可选择的标记物基因的另一种转移核酸转化(即共转化)转移核酸。根据在此所述的描述，合适的可检测的和/或可选择的标记物对于本领域人员是显而易见的。
例如，在存在D氨基酸例如D-丙氨酸和/或D-丝氨酸时，可选择标记物可以促进禾本科植物细胞或植物的生长(例如可选择标记物是D-氨基酸氧化酶；DAAO)。通过在存在D-丙氨酸和/或D-丝氨酸时生长所述细胞可以选择出表达这种标记物的禾本科植物细胞，这两种氨基酸对于不表达D-氨基酸氧化酶的植物细胞都是有毒的。
本发明还提供了经任一实施方式所述的本发明的方法直接产生的转基因的禾本科植物细胞。
本发明人也举例说明了在利用本发明的方法转化之后，在禾本科植物的转基因细胞内表达异源核酸。因此，本发明的方法还提供了本发明的方法用于生产表达转基因的禾本科植物细胞的用途。例如，本发明的方法还提供了用于在禾本科植物细胞内表达转基因的方法，所述方法包括 (i)产生转基因植物细胞，所述细胞包括与可在禾本科植物细胞内操纵的启动子可操纵连接的转基因，所述的转基因的禾本科植物细胞是通过实施任一实施方式所述的方法产生的。
(ii)在足以能够表达所述转基因的条件下维持所述转基因细胞一段时间。
根据前面的描述对于本领域人员显而易见的是，本发明也提供了用于产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟小麦籽粒或从成熟大麦籽粒或从成熟稻籽粒或从成熟玉米粒获得胚细胞； (ii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入胚细胞内的转移核酸；和 (iii)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一种或多种细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞。
本发明也提供了用于产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟小麦籽粒或从成熟大麦籽粒或从成熟稻籽粒或从成熟玉米粒获得胚细胞； (ii)从胚细胞去除种皮和/或糊粉； (iii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入胚细胞内的转移核酸；和 (iv)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一种或多种细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞。
此外，本发明提供了用于产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞的方法，所述方法包括 (i)从成熟小麦籽粒或从成熟大麦籽粒或从成熟稻籽粒或从成熟玉米粒获得胚细胞； (ii)从胚细胞去除种皮和/或糊粉； (iii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入胚细胞内的转移核酸；其中在存在蛋白胨时实施所述接触；和 (iv)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一种或多种细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，其中在存在蛋白胨时实施所述维持；由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞。
本发明还提供了经任一实施方式中所述的本发明的方法直接产生的转基因小麦细胞。
本发明人也清楚地举例说明了在利用本发明的方法转化之后在转基因小麦细胞内表达异源核酸。因此，本发明还提供了本发明的方法用于生产表达转基因的转基因小麦细胞的用途。例如，本发明的方法还提供了在小麦细胞中表达转基因的方法，所述方法包括 (i)产生包括与在小麦细胞内可操纵的启动子可操纵连接的转基因小麦细胞，所述的转基因小麦细胞是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的；和 (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因细胞一段时间。
用于在禾本科植物中表达转基因的合适条件取决于例如所用的启动子和/或禾本科植物细胞和/或转基因，例如依据在此所述的描述，这些对于本领域人员都是显而易见的。
本领域人员要知道合适的转基因。例如，合适转基因编码诱导或赋予禾本科植物例如小麦植物所需特性例如改良的抗旱性和/或真菌抗性的肽、多肽或蛋白。再者或另外，转基因编码提高植物产量或赋予抗杀虫剂或除草剂的抗性的肽、多肽或蛋白。
本发明还提供了本发明的方法调控禾本科植物细胞中核酸表达的用途。例如，本发明提供了用于调控禾本科植物细胞中核酸表达的方法，所述方法包括 (i)产生包括能够调控核酸表达的转基因的转基因禾本科植物细胞，所述转基因细胞是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的；和 (ii)在足以调控核酸表达的条件下维持所述转基因细胞一段时间。
例如，转基因能够表达抑制禾本科植物细胞中核酸表达(例如细胞内的内源基因或转基因)的核酸。在本发明的一些实施例中，转基因的禾本科植物细胞表达诱导内源基因的共抑制的核酸和/或表达短干扰RNA(siRNA)的核酸和/或表达发夹RNA和/或表达微RNA。在一个实例中，本方法包括在足以表达转基因据此调控核酸表达的条件下维持转基因禾本科植物细胞一段时间。
但是，转基因不必一定要在禾本科植物细胞中有所表达以便据此调控禾本科植物细胞中核酸的表达。例如，如上讨论的那样，本发明包括将能够诱导转录基因沉默(例如转录同源依赖性基因沉默)的转基因引入到植物细胞内。
在本发明的这些实施例中，方法任选地还包括检测转基因的表达和/或选择包括和/或表达所述转基因的细胞。
本发明也可用于产生转基因的禾本科植物或小植物或植物部分(例如转基因的小麦植物或小植物或植物部分)。因此，在一个实例中，本发明提供了用于产生转基因的禾本科植物或小植物或植物部分的方法，所述方法包括 (i)通过实施在任一实施方式中所述的本发明的方法产生转基因禾本科植物细胞； (ii)从在(i)中产生的转基因禾本科植物细胞再生出转基因禾本科植物或小植物或植物部分，由此产生转基因植物或小植物或植物部分。
在一个实例中，方法包括在足以产生愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞的条件下，用诱导愈伤组织形成和/或诱导转基因细胞(或其所衍生出的细胞)的分化和/或诱导从所述转基因细胞产生未分化细胞的化合物接触所形成的转基因禾本科植物细胞一段时间。合适的化合物对于本领域人员是显而易见的，例如化合物是选自由2，4-二氯苯氧乙酸、3，6-二氯-o-茴香酸、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸及其混合物组成的组。
优选地，在足以使得苗能够发育的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞一段时间，由此产生小植物。
优选地，在足以启动根生长产生小植物的条件下，用诱导根产生的化合物接触接触愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞一段时间。在这种情况中，可以用诱导苗形成的化合物和产生根形成的化合物同时或连续地接触愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞。
优选地，诱导苗形成和/或根产生的化合物选自由吲哚-3-乙酸、苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、塞苯隆、激动素、2iP及其混合物组成的组。
优选地，用于产生转基因植物的方法还包括在足以使得小植物发育成整个植物(例如生根或发芽或生长成熟)的条件下维持小植物。
优选地在植物再生时或期间选择包括和/或表达转基因的细胞。因此，在一个实例中，用于产生转基因禾本科植物的方法还包括选择包括转移核酸以及优选地包括转基因的细胞。例如，在转化后和/或在转化后至少约1周、或3周或5周时选择包括转移核酸的细胞。例如，在转化后至少约1周时选择包括转移核酸的细胞。例如，在转化后至少约3周时选择包括转移核酸的细胞。例如，在转化后至少约5周时选择包括转移核酸的细胞。根据在此所述的描述，用于选择包括转基因的细胞的方法对于本领域人员是显而易见的。
因为本发明的转化方法优先将转移核酸引入到上胚层或盾片的细胞内，优选地在选择之前或期间分离出这些细胞，以减少未转化细胞的数目。在这个方面，在转化禾本科植物细胞期间(例如接种之后)或转化之后(例如共培养之后)或再生之前或期间分离出这些细胞。因此，用于产生本发明的转基因植物的方法还优选地包括在从成熟种子获得胚细胞之后和/或在接种所述胚细胞之后和/或在共培养所述胚细胞之后分离出上胚层细胞和/或盾片细胞。
优选地，在此所述的用于产生转基因禾本科植物的本发明的方法还包括选择其中单个转移核酸或转基因已经整合到所述细胞、或所述愈伤组织细胞、小植物或植物的基因组内的转基因禾本科植物细胞或愈伤组织或小植物或植物。如在此所述的那样，包括具有单一拷贝的转基因(或转移核酸)的细胞的转基因植物对于育种和/或生长的调节体例如农夫而言是优选的。用于选择包括具有单一拷贝的转移核酸或转基因的细胞的转基因植物细胞或愈伤组织或小植物或植物的方法对于本领域人员是已知的。例如，进行Southern杂交以便确定出所述细胞、或所述愈伤组织、小植物或植物的细胞的基因组中的所述转移核酸或转基因的拷贝数。
通过在此所述的描述，对于本领域人员显而易见的是，本发明提供了用于产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的方法，所述方法包括 (i)通过实施如下方法产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞，所述方法包括以下步骤 (a)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；和 (b)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一种或多种细胞内的条件下接触所述胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸；由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞；和 (ii)通过实施如下方法从在(i)中产生的转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞再生出转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物，所述方法包括以下步骤 (a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞一段时间； (b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间； (c)在足以启动根产生的条件下，用诱导根产生的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和 (d)在足以产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的条件下，生长小植物一段时间。
本发明也提供了用于产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的方法，所述方法包括 (i)通过实施如下方法产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞，所述方法包括以下步骤 (a)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；和 (b)从胚细胞去除种皮和/或糊粉； (c)在足以使得所述土壤杆菌结合和/或附着于所述胚细胞的条件下，用包括核酸构建体的土壤杆菌接触所述胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸；和 (d)在足以使得所述土壤杆菌将所述转移核酸引入到一种或多种细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞；和 (ii)通过实施如下方法从在(i)中产生的转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞再生出转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物，所述方法包括以下步骤 (a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞一段时间； (b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间； (c)在足以启动根产生的条件下，用诱导根产生的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和 (d)在足以产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的条件下，生长小植物一段时间。
本发明也提供了用于产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的方法，所述方法包括 (i)通过实施如下方法产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞，所述方法包括以下步骤 (a)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；和 (b)从胚细胞去除种皮和/或糊粉； (c)在足以使得所述土壤杆菌结合和/或附着于所述胚细胞的条件下，用包括核酸构建体的土壤杆菌接触所述胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在存在蛋白胨时实施所述接触；和 (d)在足以使得所述土壤杆菌将所述转移核酸引入到一种或多种细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，其中在存在蛋白胨时实施所述维持，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞；和 (ii)通过实施如下方法从在(i)中产生的转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞再生出转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物，所述方法包括以下步骤 (a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞一段时间； (b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间； (c)在足以启动根产生的条件下，用诱导根产生的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和 (d)在足以产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的条件下，生长小植物一段时间。
本发明也可用于生产具有所需特性的转基因禾本科植物。例如，转基因禾本科植物包括编码诱导和/或增强和/或赋予所需特性的肽、多肽或蛋白的转基因禾本科植物。再者或另外，转基因调控禾本科植物中与所述特性相关的核酸的表达。用于利用在任一实施方式中所述的本发明的方法产生转基因禾本科植物的方法可以经必要的调整被应用于本发明的这个实施方式。
例如，转基因编码与提高禾本科植物例如小麦的产量相关的蛋白，例如通过赋予和/或诱导和/或增强其中表达所述转基因的禾本科植物对植物病原体的抗性(例如，蛋白是小麦奇甜蛋白样蛋白或小麦线条花叶病毒外壳蛋白)。或者，转基因诱导和/或增强和/或赋予其中表达所述转基因的禾本科植物(例如小麦)的抗旱性和/或耐干性和/或耐盐性和/或耐寒性。例如，转基因是拟南芥DREB1A基因。
再者或另外，转基因编码提高或修饰其中表达所述转基因的转基因禾本科植物的产物的营养品质的蛋白，例如转基因提高或修饰其中表达所述转基因的转基因小麦植物产生的面粉的营养品质。例如，转基因是高分子量麦谷蛋白亚基1Ax1基因。
再者或另外，转基因表面修饰禾本科植物的产物的营养品质的核酸。例如，转基因表达降低或阻止小麦颗粒结合性淀粉合酶I基因表达的siRNA。
在另一种情况中，转基因赋予了来自其中表达所述转基因的禾本科植物的产物的营养食品质量。术语“营养食品”在此应当表示任何可以被当作食品或食品一部分以及提供医疗或保健益处包括预防和治疗疾病的物质。
例如，转基因编码B型肝炎病毒表面抗原。
在一个实例中，本发明产生转基因禾本科植物的方法还包括在足以产生种子的条件下生长转基因植物一段时间。优选地，方法还包括获得所述种子。因此，本发明还提供了用于从禾本科植物优选地从小麦植物产生转基因种子的方法。
在另一个实例中，本发明的产生转基因禾本科植物的方法还包括从所述植物获得植物部分(例如生殖材料或繁殖材料或种质)。
在一个实例中，用于产生转基因禾本科植物的方法还包括提供所述植物和/或其子代和/或其种子和/或其繁殖材料和/或其生殖材料和/或其种质。
本发明还包括用于产生转基因禾本科植物子代的方法。因此，本发明还提供了用于繁殖转基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)通过实施在任一实施方式中所述的方法产生转基因禾本科植物；和 (ii)繁殖在(i)中产生的转基因植物，由此产生所述植物的子代。
在这种情况中，可以用转基因或非转基因植物繁殖转基因植物，即所产生的子代可以是转基因的纯合子或杂合子。
优选地，方法包括选择或鉴定转基因植物的子代，所述子代包括在此所述的转移核酸，优选地包括转基因。
很清楚，本发明还包括利用在任一实施方式中所述的本发明的方法产生的转基因植物、转基因植物的子代、转基因植物的种子或转基因植物的繁殖材料或转基因植物的繁殖材料或转基因植物的种质。优选地，植物是小麦植物。
本发明还包括用于繁殖转基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)利用任一实施方式中所述的方法产生转基因禾本科植物或转基因禾本科植物的子代或转基因禾本科植物的种子或转基因禾本科植物的繁殖材料；和 (ii)提供了用于繁殖目的的植物、子代、种子或繁殖材料。
在另一个实例中，本发明提供了用于繁殖转基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)获得通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的转基因禾本科植物或转基因禾本科植物的子代；和 (ii)繁殖转基因植物或子代； 或者，方法包括 (i)获得通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的转基因禾本科植物的种子或转基因禾本科植物的繁殖材料； (ii)利用种子或繁殖材料生长或产生转基因植物；和 (iii)繁殖在(ii)中产生的转基因植物。
用于繁殖禾本科植物的方法对于本领域人员是显而易见的，并在此有所描述。
本发明也提供了用于生产在任一实施方式中所述的转基因禾本科植物细胞或转基因禾本科植物的方法在植物育种中的用途。优选地，禾本科植物是小麦植物。
对于本领域人员显而易见的是，用于产生转基因禾本科植物的方法也可用于在植物中表达转基因。因此，本发明提供了用于在禾本科植物中表达转基因的方法，所述方法包括 (i)产生包括与在禾本科植物细胞中可操纵的启动子可操纵连接的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的或子代；和 (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因植物一段时间。
在此描述了合适的转基因，并且将其经必要的调整应用于本发明的实施方式中。本发明也提供了用于调控禾本科植物中核酸表达的方法，所述方法包括 (i)产生包括能够调控所述核酸表达的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的或子代； (ii)在足以调控所述核酸表达的条件下维持所述转基因一段时间。
在一个实例中，转基因被放置于与启动子可操纵的连接，并表达能够调控核酸表达的核酸(例如siRNA或微RNA)。在这个实施方式中，方法包括在足以表达转基因并据此调控核酸表达的条件下维持转基因植物一段时间。
在此描述了合适的转基因，并且将其经必要的调整应用于本发明的实施方式中。
对于本领域人员显而易见的是，用于在禾本科植物中表达转基因的方法、或用于调控禾本科植物中核酸表达的方法也可用于赋予禾本科植物表型或者调控禾本科植物的特性。因此，本发明也提供了在任一实施方式中所述的用于在禾本科植物中表达转基因的方法用于赋予禾本科植物的特性或者调控禾本科植物的特性的用途。例如，本发明提供了用于赋予禾本科植物的特性或调控禾本科植物的特性的方法，所述方法包括 (i)产生包括能够赋予或调控所述特性的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的； (ii)在足以赋予或调控特性的条件下维持所述转基因一段时间。
例如，转基因表达能够赋予或提高或增强特性的肽、多肽或蛋白。在本实施方式中，方法包括在足以使所述转基因表达并据此赋予或调控所述特性的条件下维持转基因植物一段时间。
或者，转基因能够调控禾本科植物中与特性相关的核酸的表达。
优选的特性包括例如禾本科植物例如小麦植物的产量、禾本科植物的抗旱性、病原体抗性、禾本科植物产物例如糠的营养品质或者禾本科植物的营养食品质量。在此描述了与这些质量相关的转基因，并经必要的调整将其应用到本发明的实施方式中。
本发明也提供了用于提高禾本科植物的产量的方法，所述方法包括 (i)产生包括编码与提高产量相关的蛋白的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述转基因与在禾本科植物细胞中可操纵的启动子可操纵相连，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的； (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因一段时间；和 (iii)在足以产生籽粒的条件下生长所述转基因植物一段时间，据此增强禾本科植物的产量。
本发明也提供了用于提高禾本科植物的籽粒的营养品质的方法，所述方法包括 (i)产生包括编码营养蛋白的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述转基因与在禾本科植物细胞中可操纵的启动子可操纵相连，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的； (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因一段时间；和 (iii)获得所述植物的籽粒，所述籽粒具有提高了的营养品质。
此外，本发明提供了用于调控禾本科植物的籽粒的营养品质的方法，所述方法包括 (i)产生包括编码能够调控与禾本科植物的营养品质相关的核酸的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述转基因与在禾本科植物细胞中可操纵的启动子可操纵相连，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的； (ii)在足以调控所述转基因表达的条件下维持所述转基因一段时间；和 (iii)获得所述植物的籽粒，所述籽粒具有提高了的营养品质。
本发明也提供了用于赋予禾本科植物的营养食品质量的方法，所述方法包括 (i)产生包括编码治疗性或预防性或免疫原性蛋白的转基因的转基因禾本科植物或其子代，所述转基因与在禾本科植物细胞中可操纵的启动子可操纵相连，所述植物是通过实施在任一实施方式中所述的方法产生的； (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因一段时间；和 (iii)获得其中表达转基因的植物部分，据此增强禾本科植物的营养食品质量。
任选地，本发明的方法还包括给对象(例如动物或人类对象)喂食所获得的植物部分。
因为禾本科植物例如小麦是(例如人类)消费品的主要来源，因此本发明还包括含有本发明的或利用本发明的方法产生的转基因植物的植物材料的产品。优选地，标识所述产品以指示出产品的性质。
术语“标识以便指示出产品的性质”应当表示标识产品，以便指示出其包括转基因禾本科植物例如源自其中的小麦或植物材料，或者指示出产品包括来自利用细菌介导的转化例如土壤杆菌介导的转化产生的转基因禾本科植物的植物材料或者产品包括来自利用本发明的方法产生的转基因禾本科植物的植物材料。



图1是显示在任一实施方式中所述的用于转化小麦胚的方法的一个实例的示意图。简单地，所述的方法包括表面消毒成熟小麦籽粒，从籽粒中分离出胚，用合适的土壤杆菌菌株接种胚以及共培养胚和土壤杆菌。
图2A是一份显示成熟小麦籽粒的照片图，从中分离出胚，并用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因小麦细胞或转基因小麦植物的方法。
图2B是一份显示成熟小麦籽粒的放大图的照片图，从中分离出胚，并用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因小麦细胞或转基因小麦植物的方法。
图2C是一份显示从干燥的小麦籽粒颖果中切下来的胚组织(用箭头标出)的照片图。然后用分离的胚进行接种和共培养，例如如图1所示。
图2D是一份显示利用图所示的方法经载体pCAMBIA1305.2转化并在接种3天后被染色以检测出gusA活性的胚的照片图，深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图2E是一份显示利用图1所示的方法经载体pLM301(pSB1_Ubi1::DsRed2-nos)转化的胚的照片图。
图2F是一份显示在图2E所示的胚内表达DsRed2的照片图。表达DsRed2的细胞显示为灰色区域，用箭头标出其实例。
图2G是一份显示利用图1所示的方法经载体pLM301(pSB1_Ubi1::DsRed2-nos)转化的胚的照片图。
图2H是一份显示在图2E所示的胚内表达DsRed2的照片图。表达DsRed2的细胞显示为灰色区域，用箭头标出其实例。
图3A是显示在任一实施方式中所述的用于从转化的小麦胚再生出小麦植物的方法的实施例的示意图。简单地，所述的方法包括在所述的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织诱导；在所述的再生培养基中诱导再生以及在所述的根诱导培养基中诱导根诱导。
图3B是一份显示进行再生的小麦植物的照片图。
图3C是一份显示进行根诱导的T0小麦植物的照片图。
图3D是一份显示生长在苗圃基质中的T1小麦植物的照片图。
图3E是一份显示生长在苗圃基质中的T1小麦植物的照片图。
图4A是显示用于检测T1植物中是否存在潮霉素选择标记物的定量聚合酶链反应(PCR)结果的示意图。检测来自T1系SE36的植物，在图的右侧标识出来自这些检测的结果。来自阳性和阴性对照的结果也被标识在图的右侧。在X轴上显示出所进行的循环次数以及在Y轴上显示出荧光单位。
图4B是显示用于检测T1植物中是否存在土壤杆菌菌株EHA105的virC基因的定量聚合酶链反应(PCR)结果的示意图。检测来自T1系SE36的植物，在图的右侧标识出来自这些检测的结果。来自阳性和阴性对照的结果也被标识在图的右侧。在X轴上显示出所进行的循环次数以及在Y轴上显示出荧光单位。
图4C是是显示用于检测T1植物中是否存在潮霉素选择标记物的定量聚合酶链反应(PCR)结果的示意图。检测来自T1系DV92-88的植物，在图的右侧标识出来自这些检测的结果。来自阳性和阴性对照的结果也被标识在图的右侧。在X轴上显示出所进行的循环次数以及在Y轴上显示出荧光单位。
图4D是显示用于检测T1植物中存在潮霉素选择标记物的定量聚合酶链反应(PCR)结果的示意图。检测来自T1系DV100-92的植物，在图的右侧标识出来自这些检测的结果。来自阳性和阴性对照的结果也被标识在图的右侧。在X轴上显示出所进行的循环次数以及在Y轴上显示出荧光单位。
图5是其中可以检测到gusA表达灶的经实施例1所述的方法转化的各种小麦基因型的外植体的百分比。X轴显示出每种基因型(即小麦品种)的名字。Y轴显示出具有gusA表达灶的外植体的百分比。
图6A是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(Carinya品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6B是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(Chara品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6C是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(Diamondbird品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6D是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(Sapphire品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6E是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(W12332品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6F是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(RAC 1262品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6G是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(Krichauff品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图6H是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的小麦胚(Ventura品种)的照片图。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图7是显示利用图3A所示的方法进行的各种小麦基因型的植物再生的频率。根据具有再生出整个植物的外植体的比例计算出再生频率。X轴显示出小麦基因型(即品种)，Y轴显示出再生频率百分比。
图8A是一份显示根据图3A所示的方法进行再生的Bobwhite品种的小麦外植体的照片图。
图8B是一份显示根据图3A所示的方法进行再生的Fame品种的小麦外植体的照片图。
图8C是一份显示根据图3A所示的方法进行再生的Carinya品种的小麦外植体的照片图。
图8D是一份显示根据图3A所示的方法进行再生的Kirchauff品种的小麦外植体的照片图。
图8E是一份显示根据图3A所示的方法进行再生的Ventura品种的小麦外植体的照片图。
图9是显示SoytoneTM对转化效率的作用的示意图。在不同浓度的SoytoneTM中，用携带pCAMBIA1305.2载体的土壤杆菌接种并共培养小麦胚，确定出接种3天后gusA表达染色阳性的表达灶的数目。在图的下方显示出SoytoneTM的浓度。
图10是显示SoytoneTM和/或种皮去除对转化效率的作用的示意图。在各种条件下(有或没有种皮和/或存在SoytoneTM或者存在糖)，用携带pCAMBIA1305.2载体的土壤杆菌接种并共培养小麦胚，确定出接种3天后gusA表达染色阳性的表达灶的数目。在图的下方显示出所用的处理。
图11A是一份显示来自其中分离出用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因大麦细胞或转基因大麦植物的方法中的胚的成熟大麦籽粒的照片图。
图11B是一份显示来自其中分离出用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因大麦细胞或转基因大麦植物的方法中的胚的成熟大麦籽粒的放大图像的照片图。
图11C是一份显示从干的大麦籽粒颖果中切下来的胚组织(用箭头标出)的照片图。所分离到的胚然后被用于合适细菌的接种和共培养，由此产生转基因大麦细胞。
图11D是一份显示从干的大麦籽粒颖果中切下来的胚组织(用箭头标出)的照片图。所分离到的胚然后被用于合适细菌的接种和共培养，由此产生转基因大麦细胞。
图11E是一份显示已经土壤杆菌悬浮液直接接种并共培养的大麦胚组织的照片图。
图11F是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的大麦胚。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图12是一份显示从利用土壤杆菌介导的转化方法所转化的成熟大麦胚再生出大麦植物的照片图。
图13A是一份显示来自其中分离出用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因稻细胞或转基因稻植物的方法中的胚的成熟稻籽粒的照片图。
图13B是一份显示来自其中分离出用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因稻细胞或转基因稻植物的方法中的胚的成熟稻籽粒的放大图像的照片图。
图13C是一份显示从干的稻籽粒颖果中切下来的胚组织(用箭头标出)的照片图。所分离到的胚然后被用于合适细菌的接种和共培养，由此产生转基因稻细胞。
图13D是一份显示从干的稻籽粒颖果中切下来的胚组织(用箭头标出)的照片图。所分离到的胚然后被用于合适细菌的接种和共培养，由此产生转基因稻细胞。
图13E是一份显示已经土壤杆菌悬浮液直接接种并共培养的稻胚组织的照片图。
图13F是一份显示经载体pCAMBIA1305.2转化并被染色以检测出gusA活性的稻胚。深染细胞表达gusA(用箭头标出)。
图14A是一份显示来自其中分离出用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因玉米细胞或转基因玉米植物的方法中的胚的成熟玉米粒(籽粒)的照片图。
图14B是一份显示来自其中分离出用于在任一实施方式中所述的用于产生转基因玉米细胞或转基因玉米植物的方法中的胚的成熟玉米粒(籽粒)的放大图像的照片图。
图14C是一份显示从干的玉米粒中切下来的胚组织(用箭头标出)的照片图。所分离到的胚然后被用于合适细菌的接种和共培养，由此产生转基因玉米细胞。
图14D是一份显示对切的玉米胚的照片图。对切胚然后被用于合适细菌的接种和共培养，由此产生转基因玉米细胞。
图14E是一份显示在载体LM227转化后再生出玉米外植体的照片图。
图14F是一份显示图14E所示的外植体中的DsRed2表达水平的照片图。更亮的细胞为表达DsRed2的组织，用箭头标出其实例。
图15是pBPS0054载体的示意图。该载体包括驱动双丙氨膦抗性基因(bar)表达的玉米遍在蛋白启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。bar基因与nos多腺苷酸化信号可操纵的连接。pBPS0054载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图16是pBPS0055二元载体的示意图。该载体包括驱动gusA报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。gusA基因与花椰菜花叶病毒35S多腺苷酸化信号可操纵的连接。pBPS0055载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图17是pBPS0056二元载体的示意图。该载体包括驱动改良绿色荧光蛋白(sGFP)报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。sGFP基因与花椰菜花叶病毒35S多腺苷酸化信号可操纵的连接。pBPS0056载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图18是pBPS0057二元载体的示意图。该载体包括驱动改良gusA报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。gusA基因与花椰菜花叶病毒35S多腺苷酸化信号可操纵的连接。也位于LB和RB之间的是被放置与玉米遍在蛋白启动子和nos终止子可操纵的连接的植物选择性bar基因。pBPS0057载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图19是pBPS0058二元载体的示意图。该载体包括驱动改良sGFP报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。sGFP基因与花椰菜花叶病毒35S多腺苷酸化信号可操纵的连接。也位于LB和RB之间的是被放置与玉米遍在蛋白启动子和nos终止子可操纵的连接的植物选择性bar基因。pBPS0058载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图20是pPZPMV T2 R4R3二元基础载体的示意图。该载体包括两个分离的T-DNA，并已经被构建成有助于标记物切除。一个T-DNA含有适用于模块表达框的多个克隆位点，另一个T-DNA含有R4R3多位点重组盒。多个克隆位点是由13个六核苷酸限制性位点、6个八核苷酸限制性位点和5个罕见的归巢内切酶位点组成的，以便促进模块化。
图21是pBPS0059载体的示意图。该载体包括驱动bar抗性基因表达的玉米遍在蛋白启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。bar基因与nos终止子可操纵的连接。pBPS0059载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因以及用于同源重组到超二元受体载体pSB1内的区域。标出了限制性内切酶切割位点。
图22是pBPS0060载体的示意图。该载体包括驱动gusA报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。gusA基因与花椰菜花叶病毒35S终止子可操纵的连接。pBPS0060载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因以及用于同源重组到超二元受体载体pSB1内的区域。标出了限制性内切酶切割位点。
图23是显示pBPS0061载体的示意图。该载体包括驱动sGFP报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。sGFP基因与花椰菜花叶病毒35S终止子可操纵的连接。pBPS0061载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因以及用于同源重组到超二元受体载体pSB1内的区域。标出了限制性内切酶切割位点。
图24是显示pBPS0062载体的示意图。该载体包括驱动改良gusA报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。gusA基因与花椰菜花叶病毒35S多腺苷酸化信号可操纵的连接。也位于LB和RB之间的是被放置与玉米遍在蛋白启动子和nos终止子可操纵的连接的植物选择性bar基因。pBPS0062载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因以及用于同源重组到超二元受体载体pSB1内的区域。标出了限制性内切酶切割位点。
图19是pBPS0063载体的示意图。该载体包括驱动改良sGFP报告子基因表达的稻肌动蛋白1 1D启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。sGFP基因与花椰菜花叶病毒35S多腺苷酸化信号可操纵的连接。也位于LB和RB之间的是被放置与玉米遍在蛋白启动子和nos终止子可操纵的连接的植物选择性bar基因。pBPS0063载体也包括用于细菌选择的壮观霉素耐药基因以及用于同源重组到超二元受体载体pSB1内的区域。标出了限制性内切酶切割位点。
图26是超二元载体pSB1的示意图。该载体包括一组源自土壤杆菌菌株A281的pTiBo542质粒的一组致病基因(virG、virB和virC)。该载体能够与根瘤土壤杆菌中pBPS0059到pBPS0063的任一质粒重组，以产生杂合载体。pSB1载体也包括用于细菌选择的四环素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图27是显示含有两个分离T-DNA的pSB11 T2 R4R3超二元供体基础载体的示意图。一个T-DNA含有适用于选择标记物盒的多个克隆位点，另一个T-DNA含有R4R3多位点重组盒。标出了限制性内切酶切割位点。
图28是显示含有两个分离T-DNA的pSB11ubnT2R4R3超二元供体基础载体的示意图。一个T-DNA含有适用于选择标记物盒的多个克隆位点，另一个T-DNA含有R4R3多位点重组盒。ubi::bar-nos选择标记物盒已经被克隆到了该载体的多个克隆位点内。标出了限制性内切酶切割位点。
图29是显示pPZP200ubi::bar-nos R4R3基础载体的示意图。该载体包括驱动双丙氨膦抗性基因(bar)表达的玉米遍在蛋白启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。bar基因与nos多腺苷酸化信号可操纵的连接。pPZP200ubi::bar-nos R4R3载体也含有多位点重组盒以及用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图30是显示pPZP200 ubi::dao1-nos R4R3基础载体的示意图。该载体包括驱动D-氨基酸氧化酶基因(dao1)表达的玉米遍在蛋白启动子两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。dao1基因与nos多腺苷酸化信号可操纵的连接。pPZP200ubi::bar-nos R4R3载体也含有多位点重组盒以及用于细菌选择的壮观霉素耐药基因。标出了限制性内切酶切割位点。
图31是显示pPZP200ubidao1-nos_act1D::rfa-RGA2-rfa(as)-35ST RNAi基础载体的示意图。该载体包括ubi::dao1-nos选择标记物盒和act1D::rfa-RGA2-rfa(as)-35ST盒两侧的左边界(LB)和右边界(RB)区。RGA2是小麦内含子序列，以及rfa和rfa(as)是用于有义和反义克隆RNAi沉默序列的重组位点。
优选实施方式详述 1、合适的植物株和栽培品种 本发明人已经证实任一实施方式中所述的用于产生转基因禾本科植物细胞或植物的方法普遍地适用于各种禾本科植物株。因此，本发明包括任一种类/株/系/品种/栽培品种的禾本科植物。例如，本发明包括产生选自由Acamptoclados、Achlaena、芨芨草属、尖稃草属、酸竹属、细无脊草属、尖稃草属、乱毛颖草属、凤头黍属、射枝竹属、山羊草属、羊须草属、獐茅属、非洲虎尾草属、童颜草属、Agnesia、冰草属、冰草属(Agropyropsis)、剪股颖属、银须草属(Aira)、银须草属(Airopsis)、Alexfloydia、非洲奇草属、奇鳞草属、毛颖草属、看麦娘属、阿尔芬竹属、无芒山羊草属、燥地砂草属、Ammophila、藤带禾属、湿燕麦属、双果雀稗属、澳三芒草属(Amphipogon)、兄弟草属、兄弟草属、钩草属、Ancistragrostis、须芒草属、翼颖草属、风羽针茅属、沟稃草属、Amsopogon、畸苞草属、拟银鳞草属、银鳞草属、柄花草属、花禾属、黄花茅属、浮燕麦属、Apera、隐血草属、水蔗草属、离颖草属、离枝竹属、瑞氏楔颖草、阿波[竹+禾]属、寒翦股颖属、喜极禾属、三芒草属、燕麦草属、北澳黍属、荩草属、节芒草属、内门竹属、青衡竹属、野古草属、芦竹属、克莱东芦竹属、柔草属、阿司吹禾属、密穗竹属、纺锤花竹属、牧笛竹属、澳麦草属、澳洲虎尾草属、Austrodanthonia、澳羊茅属、澳针茅属、Avellinia、燕麦属、地毯草属、Bambusa、染轴粟属、Bealia、Beckeropsis、菵草属、Bellardiochloa、非洲千金子属、印比草属、荒漠草属、肋禾属、糙雀麦属、Boivinella、北风箭竹属、孔颖草属、垂穗草属、臂形草属、短毛草属、非洲矮草属、短颖草属、短柄草属、Briza、雀麦草属、雀麦属、扁穗草属、野牛草属、野牛草属(Buchlomimus)、伊里安[竹+禾]属、拂子茅属、沙茅属、丝柄穗顶草属、Calosteca、昆士兰隐草属、Camusiella、细柄草属、堡垒草属、沿沟草属、小沿沟草属、实心草属、绳柄草属、Cathestechum、蒺藜草属、酸模芒属、巴西雀稗属、白霜草属、空竹属、Chaboissaea、刚毛草属、南非雀麦属、东非早熟禾属、刚须草属、Chaetostichium、短针狗尾草属、喀拉拉草属、Chasechloa、开口草属、假叶柄草属、隐节草属、山涧草属、刚竹属、葫芦草属、白穗茅属、Chloachne、虎尾草属、东非绿苞草属、金草属、金须茅属、Chumsriella、丘斯夸竹属、单蕊草属、木本画眉草属、闭穗草属、闭壳草属、澳隐黍属、Cliffordiochloa、Cockaynea、小丽草属、Coelachyropsis、天壳草属、空轴茅属、薏米、短序竹属、莎禾属、鞘柄茅属、Commelinidium、Cornucopiae、蒲苇属、棒芒草属、寇蒂禾属、Craspedorhachis、Crinipes、类大麦属、隐花草属、隐藏[竹+禾]属、栉茅属、Ctenopsis、海滨草属、锡金杯禾属、匍匐圆穗草属、香茅属、Cymbosetaria、狗牙根属、洋狗尾草属、薹草禾属、驼蜀黍属、Cypholepis、弓果黍属、鸭茅属、Dactylocteninm、Dahiopholis、Dallwatsonia、Danthonia、Danthoniastrum、Danthonidium、Danthoniopsis、Dasyochloa、Dasypoa、Dasypyrum、Davidsea、Decaryella、Decaryochloa、Dendrocalamus、Dendrochloa、Deschampsia、Desmazeria、Desmostachya、Deyeuxia、Diandrochloa、Diandrolyra、Diandrostachya、Diarrhena、Dichaetaria、Dichanthelium、Dichanthium、Dichelachne、Diectomis、Dielsiochloa、Digastrium、马唐属、Digitariopsis、Dignathia、Diheteropogon、Dilophotriche、Dimeria、Dimorphochloa、Dinebra、Dinochloa、Diplachne、Diplopogon、Dissanthelium、Dissochondrus、Distichlis、Drake-Brochnania、Dregeochloa、Drepanostachyum、Dryopoa、Dupontia、Duthiea、Dybowskia、Eccoilopus、Eccoptocarpha、Echinaria、Echinochloa、Echinolaena、Echinopogon、Ectros[iota]a、Ectrosiopsis、Ehrharta、Ekmanochloa、蟋蟀草属、Elionurus、Efymandra、野麦属、Elytrigia、Elytrophorus、Elytrostachys、Enneapogon、Enteropogon、Entolasia、Entoplocamia、Eragrostiella、Emgrostis、Eremium、Eremochloa、Eremopoa、Eremopogon、Eremopyrum、Eriachne、Erianthecium、蔗茅属、Eriochloa、Eriochrysis、Erioneuron、Euchlaena、Euclasta、Eulalia、Eulaliopsis、Eustachys、Euthryptochloa、Exotheca、Fargesia、Farrago、Fasciculochloa、羊茅属、Festucella、Festucopsis、Fingerhuthia、Froesiochloa、Garnotia、Gastridium、Gaudinia、Gaudiniopsis、Germainia、Gerritea、Gigantochloa、Gilgiochloa、Glaziophyton、甜茅属、Glyphochloa、Gouinia、Gouldochloa、Graphephorum、Greslania、Griffithsochloa、Guaduella、Gymnachne、Gymnopogon、Gynerium、Habrochloa、Hackelochloa、Hainardia、Hakonechloa、Halopyrum、Harpachne、Harpochloa、Helictotrichon、Helleria、Hemarthria、Hemi sorghum、Henrardia、Hesperostipa、Heterachne、Heteranthelium、Heteranthoecia、Heterocarpha、Heteropholis、Heteropogon、Hibanobambusa、Hickelia、Hierochloe、Hilaria、Hitchcockella、Holcolemma、绒毛草属、Homolepis、Homopholis、Homozeugos、Hookerochloa、Hordelymus、大麦属、Hubbardia、Hubbardochloa、Humbertochloa、Hyalopoa、Hydrochloa、Hydrothauma、Hygrochloa、Hygroryza、Hylebates、Hymenachne、Hyparrhenia、Hyperthelia、Hypogynium、Hypseochloa、Hystrix、Ichnanthus、Imperata、Indocalamus、Indopoa、Indosasa、Isachne、Isalus、Ischaemum、Ischnochloa、Ischnurus、Iseilema、Ixophorus、Jansenella、Jardinea、Jouvea、Joycea、Kampochloa、Kaokochloa、Karroochloa、Kengia、Kengyilia、Kerriochloa、Koeleria、Lagurus、Latnarckia、Lamprothyrsus、Lasiacis、Lasiorhachis、Lasiurus、Lecomtella、Leersia、Lepargochloa、Leptagrostis、Leptaspis、Leptocarydion、Leptochloa、Leptochlopsis、Leptocoryphium、Leptoloma、Leptosaccharum、Leptothrium、Lepturella、Lepturidium、Lepturopetium、Lepturus、Leucophrys、Leucopoa、滨麦属、Libyella、Limnas、Limnodea、Limnopoa、Lindbergella、Linkagrostis、Lintonia、Lithachne、Littledalea、Loliolum、黑麦草属、Lombardochloa、Lophacme、Lophatherum、Lopholepis、Lophopogon、Lophopyrum、Lorenzochloa、Loudetia、Loudetiopsis、Louisiella、Loxodera、Luziola、Lycochloa、Lycurus、Lygeum、Maclurolyra、Maillea、Malacurus、Maltebrunia、Manisuris、Megalachne、Megaloprotachne、Megastachya、Melanocenchris、Melica、Melinis、Melocalamus、Melocanna、Merostachys、Merxmuellera、Mesosetum、Metasasa、Metcalfia、Mibora、Micraira、Microbriza、Microcalamus、Microchloa、Microlaena、Micropyropsis、Micropyrum、Microstegium、Mildbraediochloa、Milium、Miscanthidium、Miscanthus、Mnesithea、Mniochloa、Molinia、Monachather、Monanthochloe、Monelytrum、Monium、Monocladus、Monocymbium、Monodia、Mosdenia、乱子草属、Munroa、Myriocladus、Myriostachya、Narduroides、Nardus、Narenga、Nassella、Nastus、Ne画眉草属、Neesiochloa、Nematopoa、Neobouteloua、Neohouzeaua、Neostapfia、Neostapfiella、Nephelochloa、Neurachne、Neurolepis、Neyraudia、Notochloe、Notodanthonia、Ochlandra、Ochthochloa、Odontelytrum、Odyssea、Olmeca、Olyra、Ophiochloa、Ophiuros、Opizia、Oplismenopsis、Oplismenus、Orcuttia、Oreobambos、Oreochloa、Orinus、Oropetium、Ortachne、Orthoclada、稻属、Oryzidium、落芒草属、Otachyrium、Otatea、Ottochloa、Oxychloris、Oxyrhachis、Oxytenanthera、黍属、Pappophorum、Parafestuca、Parahyparrhenia、Paraneurachne、Parapholis、Paratheria、Parectenium、Pariana、Parodiolyra、Pascopyrum、Paspalidium、雀稗属、狼尾草属、Pentameris、Pentapogon、Pentarrhaphis、Pentaschistis、Pereilema、Periballia、Peridictyon、Perotis、Perrierbambus、Perulifera、Petriella、Peyritschia、Phacelurus、Phaenanthoecium、Phaenosperma、草芦属(Phalaris)、Phar us、Pheidochloa、Phippsia、梯牧草属、Pholiurus、Phragmites、Phyllorhachis、Phyllostachys、Pilgerochloa、Piptatherum、Piptochaetium、Piptophyllum、Piresia、Piresiella、Plagiantha、Plagiosetum、Planichloa、Plectrachne、Pleiadelphia、Pleioblastus、Pleuropogon、Plinthanthesis、Poa-Bluegrass(grass)、Pobeguinea、Podophorus、Poecilostachys、Pogonachne、Pogonarthria、Pogonatherum、Pogoneura、Pogonochloa、Pohlidium、Poidium、Polevansia、Polliniopsis、Polypogon、Polytoca、Polytrias、Pommereulla、Porteresia、Potamophila、Pringleochloa、Prionanthium、Prosphytochloa、Psammagrostis、Psammochloa、Psathyrostachys、Pseudanthistiria、Pseudarrhenatherum、Pseudechinolaena、Pseudobrornus、Pseudochaetochloa、Pseudocoix、Pseudodanthonia、Pseudodichanthium、Pseudopentameris、Pseudophleum、Pseudopogonatherum、Pseudoraphis、Pseudoroegneria、茶轩竹属、Pseudosorghum、Pseudostachyum、Pseudovossia、Pseudoxytenanthera、Pseudozoysia、Psilathera、Psilolemma、Psilurus、Pterochloris、Ptilagrostis、Puccinellia、Puelia、总序竹属、Raddia、Raddiella、Ratzeburgia、Redfieldia、Reederochloa、Rehia、Reimarochloa、Reitzia、Relchela、Rendlia、Reynaudia、Rhipidocladum、Rhizocephalus、Rhomboelytrum、Rhynchelytrum、Rhynchoryza、Rhytachne、Richardsiella、Robynsiochloa、Rottboellia、Rytidosperma、Saccharum、Sacciolepis、Sartidia、赤竹属、Sasaella、Sasamorpha、Saugetia、Schaffnerella、Schedonnardus、Schenckochloa、Schismus、Schizachne、Schizachyrium、葸劳竹属(Schizostachyum)、Schmidtia、Schoenefeldia、Sclerachne、Sclerochloa、Sclerodactylon、Scleropogon、Sclerostachya、Scolochloa、Scribne[eta]a、Scrotochloa、Scutachne、Secale、Sehima、Semiarundinaria、Sesleria、Sesleriella、Setaria、Setariopsis、Shibataea、Silentvalleya、Simplicia、Sinarundinaria、Sinobambusa、Sinochasea、Sitanion、Snowdenia、Soderstromia、Sohnsia、Sorghastrum、Sorghum、Spartina、Spartochloa、Spathia、Sphaerobambos、Sphaerocaryum、Spheneria、Sphenopholis、Sphenopus、鬣刺属、Spodiopogon、Sporobolus、Steinchisma、Steirachne、Stenotaphrum、Stephanachne、Stereochlaena、Steyermarkochloa、Stiburus、Stilpnophleum、针茅属、Stipagrostis、Streblochaete、Streptochaeta、Streptogyna、Streptolophus、Streptostachys、Styppeiochloa、Sucrea、Suddia、Swallenia、Swa[iota]lenochloa、Symplectrodia、Taeniatherum、Taeniorhachis、Tarigidia、Tatianyx、Teinostachyum、Tetrachaete、Tetrachne、Tetrapogon、Tetrarrhena、筱竹属、Thaumastochloa、Thelepogon、Thellungia、Themeda、Thinopyrum、Thrasya、Thrasyopsis、Thuarea、Thyridachne、Thyridolepis、Thyrsia、Thyrsostachys、Thysanolaena、Torreyochloa、Tovarochloa、Trachypogon、Trachys、Tragus、Tnbolium、Tricholaena、Trichoneura、Trichoptet[gamma]x、Tridens、Trikeraia、Trilobachne、Triniochloa、三齿稃属、Triplachne、Triplasis、Triplopogon、Tripogon、Tripsacum、Triraphis、Triscenia、Trisetum、Tristachya、小麦属、Tsvelevia、Tuctoria、Uniola、Uranthoecium、Urelytrum、Urochloa、Urochondra、Vahlodea、Vaseyochloa、Ventenata、Vetiveria、Vietnamochloa、Vietnamosasa、Viguierella、Vossia、Vulpia、Vulpiella、Wangenheimia、Whiteochloa、Willkommia、Xerochloa、Yakirra、Ystia、玉山竹属、Yvesia、玉蜀黍属、Zenkeria、Zeugites、Zingeria、菰属、Zizaniopsis、Zonotriche、Zoysia、Zygochlo组成的组中的属的转基因植物或细胞。
在一个实例中，禾本科植物是大麦属属。大麦属属中的合适种类对于本领域人员是显而易见的，并包括例如H.chilense、H.cordobense、H.euclaston、H.flexuosum、H.intercedens、H.muticum、H.pusillum、H.stenostachys、H.arizonicum、H.comosum、H.jubatum、H.lechleri、H.procerum、H.pubiflorum、H.bulbosum、H.bulbosum、H.bulbosum、H.bulbosum、H.murinum ssp glaucum、H.murinum ssp leporinum、H.murinum ssp murinum、H.vulgare ssp spontaneum、H.vulgare ssp vulgare、H.bogdanii、H.brachyantherum ssp brachyantherum、H.brachyantherum ssp californicum、H.brevisubulatum ssp brevisubulatum、H.capense、H、depressum、H.erectifolium、H.guatemalense、H.marinum ssp marinum、H.marinum ssp gussoneanum、H.parodii、H.patagonicum ssp magellanicum、H.patagonicum ssp mustersii、H.patagonicum ssp patagonicum、H.patagonicum ssp santacrucense、H.patagonicum ssp setifolium、H.roshevitzii、H.secalinum或H.tetraplodum。
在另一个实例中，禾本科植物是裸麦草。合适的裸麦草种类对于本领域人员也是显而易见的。例如，合适的裸麦草种类包括多年生黑麦草、浮床黑麦草、L.rigidum或毒麦。
在另一个实例中，禾本科植物是稻。合适的稻种类和/或变体对于本领域人员也是显而易见的。例如，合适的稻变体包括koshihikari、opus、millin、amaroo、jarrah、illabong、langi、doongara、kyema、basmati、bombia、carnaroli、baldo、roma、nero或Arborio。
在另一个实例中，禾本科植物是玉米。合适的玉米种类和/或变体对于本领域人员也是显而易见的。例如，合适的玉米变体包括algans、aldante、avenir、Hudson、loft、tasilo、GH128、GH390、QK694和Hycorn 1、General和PX75。
优选地，禾本科植物是小麦。例如，小麦是二倍体小麦例如一粒小麦。
或者，小麦是四倍体小麦，例如波斯小麦(例如品种硬粒小麦(T.durum)、波兰小麦(T.polonicum)、欧毒麦、东方小麦(T.turanicum)或波斯小麦)或硬粒小麦。
优选地，小麦是六倍体小麦。例如，小麦株/系/品种/栽培品种是冬小麦株/系/品种/栽培品种和/或春小麦株/系/品种/栽培品种。
在一个实例中，小麦株/系/品种/栽培品种是例如在澳大利亚生长或生产的株/系/品种/栽培品种。例如，小麦株或品种选自由Halberd、Cranbrook、Chuan Mai18(CmI8)、Vigour18(Vl8)、Gba Sapphire、Wyalkatchem、Annuello、Wawht2499、Ega Eagle Rock、Gba Ruby、Gba Shenton、Carnamah、Arrino、Babbler、Barunga、Batavia、Baxter、Blade Older、、Brookton、Cadoux、Calingiri、Camm、Carnamah、Cascades、Chara、Condor、Cunningham、Dollarbird、Diamondbird、Eradu、Excalibur、Frame、Goldmark、Goroke、H45、Hartog、Hybrid Mercury、Janz、Kelalac、Kennedy、Krichauff、Lang、Machete、Meering、Mitre、Ouyen、Petrie、Silverstar、Spear Older、Stiletto、Strzelecki、Sunbri、Sunbrook、Sunco、Sunlin、Sunstate、Sunvale、Trident、Westonia、Whistler、Worrakatta、Wylah、Yitpi及其杂交体和杂合体组成的组。
在另一个实例中，小麦株/系/品种/栽培品种是通常生长在北美的株/系/品种/栽培品种，例如，Fielder、Wawawai、Zak、Scarlet、Tara、Neeley、UC1036、Karl、Jagger、Tam106、Bobwhite、Crocus、Columbus、Kyle、Chinese Spring、Alpowa、Hank、Edwall、Penawawa、Calorwa、Winsome、Butte86、Challis、Maron、Eden、WPB926、WA7839、WA7859、WA7860、WA7875、WA7877、WA7883、WA7884、WA7886、WA7887、WA7890、WA7892、WA7893、WA7900、WA7901、WA7904、WA7914或WA7915。
在另一个实例中，小麦株/系/品种/栽培品种是通常生长在欧洲的株/系/品种/栽培品种，例如，Terra、Brigadier And Hussar、Hunter、Riband、Mercia、Hereward、Spark、Pastiche、Talon、Rialto、Shiraz、FAP75141、Boval、Renan、Derenb Silber、FAP75337、Iena、Cappelle、Champlein、Roazon、VPM、Kanzler、Monopol、Carstacht、Vuka、Tamaro、M.Huntsman、Rektor、Bernina、Greif、Caribo、Ares、Kraka、Kronjuwel、Granada、Apollo、Basalt、FAP75527、FAP75507、Galaxie、Obelisk、Forno、Heinevii、Kormoran、Merlin、Bussard、Sperber、FAP75517、Arina、Zenith、FAP754561、Probus、FAP75468、FAP62420、Bezostaja、Kavkas、Timmo、Maris Butler、Sicco、Broom Highbury、Avalon、Fenman、Bounty、Copain、Baron、Norman、Hustler、Kador、Sentry、Flanders、Armada、Brigand或Rapier。
在进一步的实施例中，小麦株/系/品种/栽培品种是良种的株/系/品种/栽培品种。在这个方面，“良种”株/系/品种/栽培品种一般显示出改良了的生长特性例如对植物病原体的抗性或抗旱性或抗干性。
在另一个实例中，小麦株/系/品种/栽培品种是小麦的合成衍生物。利用通过培育小麦与非培育小麦的杂交产生这种合成衍生物，据此提高或增强所述小麦的遗传多样性。大量的合成小麦衍生物是本领域已知的，并包括例如波斯小麦和T.taschii之间的杂交体。这种杂交模拟了天然发生的产生了现有的六倍体面包小麦的杂交过程。这些合成小麦衍生物的合适来源对于本领域人员是显而易见的，并包括例如CIMMYT(国际玉米和小麦改良中心；Km.45，Carretera Mexico-Veracruz.El Batan，Texcoco，Edo.de Mexico，CP56130 Mexico)。
合成小麦衍生物的实例包括例如CIGM90.590、CIGM88.1536-0B、CIGM90.897、CIGM93.183、CIGM87.2765、CIGM87.2767、CIGM90.561、CIGM88.1239、CIGM88.1344、CIGM92.1727、CIGM90.845、CIGM90.846、CIGM90.257-1、CIGM91.61-1、CIGM90.462、CIGM90.248-1、CIGM90.250-2、CIGM90.412、CIGM90.590、CIGM87.2765-1B-0PR-0B、CIGM88.1175-0B、CIGM87.2767-1B-0PR-0B、CIGM87.2775-1B-0PR-0B、CIGM87.2768-1B-0PR-0B、CIGM86.946-1B-0B-0PR-0B、CIGM87.2770-1B-0PR-0B、CIGM88.1194-0B、CIGM87.2771-1B-0PR-0B、CIGM88.1197-0B、CIGM88.1200-0B、CIGM86.959-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM88.1209-0B、CIGM90-561、CIGM86.1211-0B、CIGM86.940-1B-0B-0PR-0B、CIGM87.2760-0B-0PR-0B、CIGM88.1212-0B、CIGM86.953-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM87.2761-1B-0PR-0B、CIGM88.1214-0B、CIGM88.1216-0B、CIGM88.1219-0B、CIGM86.950-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM86.942-1B-0PR-0B、CIGM90.525、CIGM88.1270-0B、CIGM88.1273-0Y、CIGM88.1288-0B、CIGM88.1313、CIGM88.1313、CIGM88.1344-0B、CIGM88.1273-0Y、CIGM88.1363-0B、CIGM88.1362-0Y、CIGM90.566、CIGM90-590、CIGM89.506-0Y、CIGM89.525-0Y、CIGM89.537-0Y、CIGM89.538-0Y、CIGM90.686、CIGM90.760、CIGM89.559、CIGM89.559、CIGM89.479-0Y、CIGM89.561-0Y、CIGM90.543、CIGM89.564-0Y、CIGM86.944-1B-0Y、0B-0PR-0B、CIGM86-3277-1B-0B-0PR-0B、CIGM88.1239-2B、CIGM89.567-1B、CIGM90.799、CIGM90.808、CIGM90.812、CIGM90.815、CIGM90.818、CIGM90.820、CIGM90.824、CIGM90.845、CIGM90.846、CIGM90.863、CIGM90.864、CIGM90.865、CIGM90.869、CIGM90.871、CIGM90.878、CIGM90.897、CIGM90.898、CIGM90.906、CIGM90.911、CIGM90.910、CIGM92.1647、CIGM92.1665、CIGM92.1666、CIGM92.1667、CIGM92.1682、CIGM92.1713、CIGM92.1721、CIGM92.1723、CIGM92.1727、CIGM92.1871、CIGM93.183、CIGM93.229、CIGM93.237、CIGM93.388、CIGM93.261、CIGM93.395、CIGM93.266、CIGM93.297、CIGM93.300、CIGM93.406、CIGM93.306、CIGM88.1182-0Y、CIGM87.2754-1B-0PR-0B、CIGM86.951-1B-0B-0PR-0B、CIGM86.955-1M-1Y-0B-0PR-0B、CIGM88.1217-0B、CIGM88.1228-0B、CIGM88.1240-0B、CIGM90.809、CIGM90.826、CIGM90.896、CIGM93.377、CIGM93.299、CIGM93.302、CASW94Y00092S、CASW94Y00095S、CASW94Y00116S、CASW94Y00130S、CASW94Y00144S、CASW94Y00151S、CASW94Y00155S、CASW94Y00156S、CASW94Y00230S、CASW95Y00102S、CASW96Y00555S、CASW96Y00568S、CASW96Y00573S、CASW98B00011S、CASW98B00031S、CASW98B00032S、CASW98B00036S、CASW98B00044S、CASW98B00049S或CASW98B00061S。在这个方面，CIGM编号或CASW编码指的是上面对应于CIMMYT所采用的应用于小麦株的杂交鉴定编号。
或者，例如在Oliver et al，Crop Science，451353-1360，2005中描述了合成小麦衍生物。
在另一个实例中，小麦品种或品种(或基因型)选自由Bobwhite、Chara、Camm、Krichauff、Diamondbird、Yitpi、Wedgetail、Wyalkatchem、Calingiri、Babbler、Silverstar、Sapphire、Frame、Aus29597、Aus29614、Canon、Sunco、Cherinya、Ventura、Tammarin Rock、Kukri、Janz、Sunco、Tasman、Cranbrook、Halberd DH、CIMMYT非合成衍生物、例如澳大利亚小麦育种企业例如西澳大利亚农业部和Australian Grain Technologies Pty Ltd产生的优良育种系以及其杂交体和杂合体组成的组。
在进一步的实施例中，小麦品种或品种(或基因型)选自由Bobwhite、Chara、Camm、Krichauff、Diamondbird、Yitpi、Wedgetail、Wyalkatchem、Calingiri、Babbler、Silverstar、Sapphire、Frame、Aus29597、Aus29614及其杂交体和杂合体组成的组。
本领域人员能够确定出任何其他的可被本发明的方法转化的小麦株、品种/栽培品种或育种系。
2、从成熟籽粒获得胚 本领域人员知道用于确定出禾本科植物的籽粒发育期的方法，例如用于确定籽粒是否完成了籽粒灌浆的方法。例如，成熟的小麦种子包括近似35％水分。因此，通过选择具有约35％或更少水分的小麦种子，可以选出成熟的籽粒。利用湿度计(例如购自Perten Instruments，Springfield，IL，USA)或者利用射频监视器(例如Lawrence and Nelson，Sensor Update，7377-392，2001所述)确定出小麦种子的水分。
或者，确定出籽粒胚乳细胞的核内复制水平。用于确定胚乳细胞的核内复制水平的合适方法对于本领域人员是显而易见的，并包括例如Dilkes et al，Genetics，1601163-1177，2002所述的那些方法。例如，分离(例如切取)出小麦籽粒的胚乳，并将其在适用于裂解植物细胞的缓冲液中匀浆化。然后利用流式细胞术例如通过检测每个核内与核酸结合的4′，6-二脒基-2-苯吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole)水平来确定出先前确定出的核数目中的核酸水平。其中没有或者极少有正在进行核内复制的细胞的胚乳被认为是来自成熟籽粒。
或者，确定出籽粒例如小麦籽粒的胚乳中的淀粉水平，以便鉴定出成熟籽粒。例如，利用基于淀粉葡糖苷酶/α淀粉酶的方法(例如Megazyme总淀粉检测法)确定出籽粒胚乳中的淀粉水平。这种方法一般包括利用淀粉葡糖苷酶/α淀粉酶水解并溶解来自禾本科植物胚乳的淀粉。淀粉糊精被水解成葡萄糖，然后用例如利用4-氨基安体比林的葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶反应定量出葡萄糖的量。例如在McLeary et al，J.Cereal Set，2051-58，1994中描述了这种方法。
或者，利用肉眼观察确定出成熟籽粒。例如，其中颖片和花梗不再为绿的以及植物仍残留有少量绿色的小麦籽粒被认为是成熟的小麦籽粒。同样，其中粒为硬的但是仍可被指甲压扁的小麦籽粒和/或源自完全黄色植物的小麦籽粒都被认为是成熟籽粒。
在另一个实例中，从怀疑包括成熟籽粒的植物中收集到籽粒。例如，利用Bauer、Fanning、Enz和Eberlein提出的生长度计算方法估计出小麦籽粒的成熟度(1984，Use of growing-degree days to determine spring wheat growthstages.North Dakota Coop.Ext.Ser.EB-37.Fargo，ND)。
在分离出成熟籽粒之后，例如通过从籽粒中切下或割下胚细胞分离出籽粒的胚细胞。用于从成熟籽粒获得胚细胞的方法对于本领域人员是显而易见的，并在例如Delporte et al，Plant Cell Tiss.Organ Cult.6773-80，2001中有所描述。例如，用刀片(例如解剖刀)切下胚。在一个实例中，在水中浸泡种子一段时间(例如1到2个小时)，以便有助于从籽粒中获得所述胚细胞。
在一个实例中，去除成熟胚的种皮。用于去除种皮的方法对于本领域人员是显而易见的。例如，利用刀片(例如解剖刀)切下成熟胚的种皮。
或者，通过用刀子或磨料破裂或磨破种皮来去除种皮。例如也可以通过用酸(例如硫酸)或溶剂(例如丙酮或乙醇)接触胚一段足以去除种皮的时间来去除种皮。
3、细菌对成熟胚的转化 3.1 合适的细菌菌株 用于将核酸引入到禾本科植物细胞内的合适细菌对于本领域人员是显而易见的。例如Broothaerts et al.，Nature 433629-633，2005描述了利用根瘤菌NGR234或Sinorhizobium meliloti或Mesorhizobium loti产生转基因植物。因此，利用这些细菌中的任一种细菌或者用土壤杆菌属进行在任一实施方式中所述的本发明的转化方法是优选的。在各种情况中，用Ti载体装载被转移到转基因植物中的核酸。此外，转化方法与用于土壤杆菌的那些方法相似。因此，在此提供的关于用于土壤杆菌的载体和转化方法的描述都应当依照实施情况应用于利用一种或多种先前所述的细菌进行的转化。
在本发明的一个实例中，利用土壤杆菌将核酸引入到禾本科植物细胞内。土壤杆菌属的成员是其天然环境为土壤携带的、革兰阴性、杆状的植物致病性细菌，它会引起冠瘿病或毛根病。术语“土壤杆菌”包括但不限于菌株根瘤土壤杆菌(常常引起受感染植物的冠瘿病)和毛根土壤杆菌(常常引起受感染宿主植物的毛根病)。植物细胞感染土壤杆菌一般会造成受感染细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，会引起胭脂碱产生的土壤杆菌(例如菌株LBA4301、C58、A208、GV3101)被称作“胭脂碱型”土壤杆菌；会引起章鱼碱产生的土壤杆菌(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)被称作“章鱼碱型”土壤杆菌；以及引起农杆碱产生的土壤杆菌(例如菌株EHA105、EHA101、A281)被称作“农杆碱型”土壤杆菌。
在一个实例中，利用根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌将核酸引入到禾本科植物内。优选地，根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌是减毒(disarmed)土壤杆菌。在这个方面，减毒土壤杆菌包括感染植物细胞所需的基因(例如vir基因)，但是缺少引起植物疾病例如冠瘿病所需的核酸。
一般由菌株的染色体背景以及菌株中所有的固有或内源性Ti质粒定义出根瘤土壤杆菌菌株。表1给出了合适的土壤杆菌菌株及其染色体背景和Ti质粒的实例

在一个实例中，用于本发明的根瘤土壤杆菌具有提高了的感染植物细胞的能力。具有提高感染性的合适的菌株是本领域已知的。例如，已经产生了包括增加水平的virG或增加水平的活性virG的菌株(Zupan et al，Plant J，2311-28，2000)。virG表达或活化水平的增加造成了vir簇中剩余基因表达的增加，据此增强了根瘤土壤杆菌的感染性。
再者或另外，根瘤土壤杆菌包括增强了的virE1表达(Zupan et al，同上)。VirE1表达单链DNA结合蛋白，其结合转移的T-DNA的T链，据此增强了T-DNA向植物细胞内的引入。
根瘤土壤杆菌的其他菌株对于本领域人员是显而易见的，并包括例如A281(Hood et al，J.Bacteriol 1681291-1301，1986)。
合适的毛根土壤杆菌菌株对于本领域人员是显而易见的。例如，所述菌株选自由R1601、R1000、ATCC15834、MAFF03-01724、A4RS、LBA9402和LMG 1500组成的组(Han et al，Can.J.For.Res.，27464-470，1997或Baiset al，Current Science，8083-87，2001)。合适的毛根土壤杆菌来源对于本领域人员是显而易见的。本领域人员也知道在利用毛根土壤杆菌将核酸引入到植物细胞内之后，诱导了根产生。然后利用本领域已知的和/或在此所述的方法用根再生出小植物(如产生苗)。
3.2 核酸构建体 因为本发明的转化方法使用细菌(优选地是土壤杆菌)，因此合适的核酸构建体一般包括或者是由Ti质粒(对于根瘤土壤杆菌而言)或者Ri质粒(对于毛根土壤杆菌而言)组成的。在本发明的上下文中，这种载体一般包括被引入到植物细胞的转移核酸内的相关转基因。下面更详细地描述了合适的转基因。本节描述了用于向植物细胞内引入核酸的合适的构建体。
在一个实例中，核酸构建体包括缺陷重复DNA(也称作左边界(LB)和右边界(RB))位于两侧或者给定界线的相关转基因，SEQ ID NO1和2分别给出了示例LB和RB的核苷酸序列。优选地，用于本发明方法中的合适的核酸构建体包括合适的LB和RB。
3.2.1 启动子 在另一个实例中，核酸构建体包括与合适启动子可操纵连接的转基因和/或选择标记物基因和/或检测标记物基因。
在另一个实例中，相关转基因和/或选择/检测标记物基因与在植物细胞内可操纵的启动子可操纵的连接。在这个方面，启动子不必一定是在经本发明的方法最初被转化的植物细胞内可操纵的，而是启动子在特殊的细胞类型或发育阶段可以是可诱导的和/或可操纵的。
适用于在植物内表达的核酸构建体中的启动子(例如驱动转基因和/或选择/检测标记物基因的表达)包括例如那些源自病毒基因、酵母基因、霉菌基因、细菌基因、昆虫基因、鸟类基因、哺乳动物基因和植物基因的能够在禾本科植物细胞内发挥功能的启动子。就其表达所发生的组织而言，或者就其表达所发生的发育阶段而言，或者应答于外在刺激例如生理应激、病原体或金属离子等等，启动子可以组成地或分化地调节基因表达。
用于实施本发明的启动子实例包括CaMV35S启动子(SEQ ID NO3)、玉米遍在蛋白启动子(SEQ ID NO4)、稻肌动蛋白1启动子(SEQ ID NO5)、玉米乙醇脱氢酶1启动子、pEMU合成启动子(Last et al，Theor.Appl.Genet.81，581-588，1991)、来自拟南芥的rd29a诱导型启动子(SEQ ID NO6)、来自甘蔗杆菌病毒的ScBV启动子(SEQ ID NO6)、来自大麦的basi启动子(SEQ ID NO7)或来自裸麦草的cad2启动子。
除了在此给出的特殊启动子外，所谓持家基因的细胞启动子包括肌动蛋白启动子或组氨酸编码基因的启动子也是有用的。
或者，使用诱导型启动子。诱导型启动子是由特殊刺激例如应激状态包括光、温度、化学物、干旱、高盐度、渗透冲击、氧化状态或致病性所诱导的启动子。
3.2.2 选择和/或检测标记物 在另一个实例中，核酸构建体包括一个或多个选择和/或检测标记物，其有助于对包括所述核酸构建体或其片段的细菌细胞和/或植物细胞的选择和/或检测。
细菌选择标记物 在一个实例中，核酸构建体包括编码在细菌细胞内可操纵的选择和/或检测标记物的核酸。这种选择和/或检测标记物有助于选择或鉴定出包括核酸构建体的细菌细胞。但是，如上讨论的那样，一些细菌菌株例如土壤杆菌菌株也包括编码选择和/或检测报告子的基因。在这个方面，优选地是核酸内的选择和/或检测报告子基因要不同于细菌菌株所用的报告子基因。
一般而言，核酸构建体包括赋予细菌细胞对细胞毒化合物的抗性的选择标记物。例如，核酸构建体包括编码赋予对卡那霉素、庆大霉素、四环素、链霉素或壮观霉素的抗性的多肽的选择标记物。
植物选择和/或检测标记物 在另一个实例中，核酸构建体包括编码在植物细胞内可操纵的选择和/或检测标记物的核酸。这种选择和/或检测标记物有助于选择和/或鉴定出已经本发明的方法转化的植物细胞。对于本领域人员显而易见的是，这种选择和/或检测标记物优选地位于构建体的转移核酸内，据此有助于其被引入到植物细胞内。
在一个实例中，核酸包括在植物内可操纵的选择标记物。合适的选择标记物对于本领域人员是显而易见的。例如，选择标记物是编码L-2-氨基-4(羟基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinothricin)乙酰转移酶(pat)(SEQ ID NO9)的bar基因(双丙氨膦抗性基因)(SEQ ID NO8)。
或者，选择标记物提供了对抗生素的耐药性。例如，选择标记物是由细菌新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因(SEQ ID NO10)编码的，其提供了对氨基糖甙抗生素的耐药性。或者，选择标记物是由潮霉素磷酸转移酶基因(SEQ ID NO12)(提供了对潮霉素B的耐药性)或aacC3基因或aacCA基因(提供了对庆大霉素的耐药性)或氯霉素乙酰转移酶基因(SEQ ID NO14)(提供了对氯霉素的耐药性)。
在另一个实例中，选择标记物赋予了对杀虫剂的抗性。例如，选择标记物是编码5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate)合酶(SEQ ID NO16)或L-2-氨基-4(羟基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinothricin)合酶(SEQ ID NO18)的基因，其分别提供了对草甘膦和/或草胺磷杀虫剂的抗性。来自土壤杆菌菌株4的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(CPA)(SEQ ID NO20)基因和草甘膦氧化还原酶(GOX)基因(SEQ ID NO22)也编码提供了对草甘膦铵杀虫剂的抗性的多肽(Zhouet al，Plant Cell Reports，15159-163，1995)。
在另一个实例中，选择标记物赋予了能够在未转化植物细胞不能生长和/或存活的化合物中存活和/或生长的能力。例如，选择标记物是由大肠杆菌的mana基因(SEQ ID NO24)编码的甘露糖-6-磷酸异构酶(MPI)(Hansenand Wright，Trends in Plant Sciences，4226-231，1999)。MPI容许转化细胞在以甘露糖为碳源的条件下生长。
或者，选择标记物是由氰酰胺水合酶(Cah)基因(SEQ ID NO26)(如USSN 09/518,988所述)编码的。氰酰胺水合酶通过将氰酰胺转化为尿素来容许转化植物细胞生长在氰酰胺中。
在一个实例中，选择标记物是例如包括SEQ ID NO28所设核苷酸序列的核酸编码的D-氨基氧化酶(DAAO)。如上讨论的那样，DAAO容许转化植物细胞或植物在D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的条件下生长。用于产生包括DAAO作为选择标记物的核酸构建体的合适方法是本领域已知的和/或在Erikson et ah，Nature Biotechnology，22455-458，2004或国际出版物WO2003/060133中所述的方法。根据WO2003/060133的描述，用于利用D-氨基酸选择的其他合适的选择标记物对于本领域人员是显而易见的。例如，选择标记物是由大肠杆菌的D-氨基酸解氨酶编码的。
在另一个实例中，核酸构建体包括检测标记物基因，优选地，转移核酸包括检测标记物基因。合适的检测标记物基因包括例如β葡糖苷酸酶基因(GUS，通过代谢5-溴-4-氯-3-吲哚-1-葡糖苷酸产生蓝色沉淀来检测所述基因的表达)(SEQ ID NO30)、细菌萤光素酶基因(SEQ ID NO32)、萤火虫萤光素酶基因(在用萤光素接触植物细胞后可检测到)、或β半乳糖苷酶基因(通过代谢5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷产生蓝色沉淀来检测所述基因的表达)(SEQ ID NO34)。
在另一个实例中，检测标记物是荧光标记物。例如，荧光标记物是单体圆盘海葵(discosoma)红色荧光蛋白(dsRED、SEQ ID NO36)或Aequoreacoerulescens的单体GFP(SEQ ID NO38)。优选地，标记物是dsRED。用于检测荧光蛋白的方法对于本领域人员是显而易见的，并包括例如将植物细胞或植物暴露于合适波长的光，以便激发所述荧光蛋白，并检测出从所述植物细胞或植物中发射出的光。
3.2.3 核酸构建体的产生 用于产生核酸构建体的方法是本领域已知的和/或在Ausubel et al(InCurrent Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987)、Sambrook et al(InMolecular CloningMolecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Third Edition 2001)中所述的方法。通常用已知的方法分离出编码核酸构建体的组成组分的核酸，所述方法包括例如扩增(用PCR或剪切重叠延伸)或利用一种或多种限制性内切面从生物体的核酸中分离出或者从核酸文库中分离出所述组分的核酸。这些分离的方法对于本领域一般熟练人员都是显而易见的。
或者，利用聚合酶链反应(PCR)分离出编码用于本发明方法中的构建体的核酸组分的核酸。PCR方法在本领域是已知的并在Dieffenbach(ed)andDveksler(ed)(InPCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratories，NY，1995)中有所描述。一般而言，用于PCR的两个非互补的包括至少约20个核苷酸长度以及更优选地至少25个核苷酸长度的核酸引物分子与核酸模板分子的不同链杂交，酶扩增出模板的特异的核酸拷贝。优选地，引物与相关核酸(例如转基因、启动子和/或编码检测标记物或选择标记物的核酸)邻近的核酸杂交，据此有助于核酸的扩增。在扩增之后，用本领域已知的方法分离出扩增核酸，优选地将其克隆到合适的载体内，例如在此所述的载体内。
用于产生本发明核酸的其他方法对于本领域人员是显而易见的，并在本发明的范围之内。例如，通过将相关转基因克隆到二元载体内产生核酸构建体。
3.2.4 二元载体 在一个实例中，核酸构建体是包括相关转基因的Ti质粒或Ri质粒。
优选地，Ti质粒或Ri质粒包括经根瘤土壤杆菌将核酸引入植物细胞内所需的各个vir基因。
优选地，核酸构建体是二元Ti质粒或Ri质粒。根据T-DNA(转移到植物细胞内的核酸)和转移T-DNA所需的vir基因可能位于不同质粒上的观察(Hoekema et al，Nature，303179-180，1983)，产生二元Ti质粒或Ri质粒。在这个方面，一般通过被用于转化植物细胞的土壤杆菌(例如上述的土壤杆菌菌株)内固有的或内源性的减毒Ti质粒提供vir功能。
因此，二元Ti质粒或Ri质粒包括位于转移核酸(例如T-DNA)内的转基因。这种包括转基因的转移核酸的两侧一般都是LB和RB，或者所述核酸是由LB和RB给出边界的。
合适的二元载体是本领域已知的和/或可商品化获得的。例如，表2描述了二元Ti载体的选择。
表2可用于土壤杆菌介导的转化的二元Ti质粒
其他的二元载体例如在Hellens and Mullineaux Trends in Plant Science 5446-451，2000中有描述。
合适的Ri质粒也是本领域已知的，并包括例如pRiA4b(Juouanin，Plasmid，1291-102，1984)、pRil724(Moriguchi et al，J.MoI Biol.307771-784，2001)、pRi2659(Welter et al，Plant Pathol.4P43-50，2000)或pRil855(O′Connell et al，Plasmid 75156-163，1987)。
本发明人还提供了多种适用于将核酸(例如报告子基因)转移转化到植物内的二元载体。再者或另外，这些载体适用于进行用于将相关核酸转化到植物内的修饰。图8到22描述了每个载体的载体图谱。
具体的，本发明人提供了5种用于进行禾本科植物的细菌介导转化的二元载体(见表3和图15到19)。每个载体都具有pPZP200载体骨架(Hajdukiewicz et al，Plant MoI Biol 25989-94，1994)，并包含嵌合的act1D::gusA或ctlD::sgfp以及有或没有嵌合的ubi::bar选择标记物盒。
本发明也提供了包含两个有助于标记物切割的分离T-DNA的二元基础载体(图20)。一个T-DNA含有适用作模块表达框的多克隆位点，另一个含有适用作选择标记物盒的R4R3多位点重组盒。多克隆位点是由13个六核苷酸限制性位点、6个八核苷酸限制性位点和5个罕见的归巢核酸内切酶位点组成，以便有助于模块化(如Goderis et al，Plant Mol Biol 5017-27，2002所述)。利用这个模块化系统，可以将最多6个不同的表达框克隆到一个二元载体内。
表3细菌的二元载体 本发明人也提供了用于禾本科植物细胞例如小麦细胞的细菌介导转化的5个超二元供体和1个超二元受体载体(图21到25)。每个供体载体都是由pSB11载体骨架(Komari et al，Plant J 10165-174，1996)组成的，其含有嵌合的act1D::gusA或act1D::sgfp，有或没有嵌合的ubir::bar选择标记物盒。
pSB1受体载体(图26)含有一组源自土壤杆菌菌株A281的pTiBo542质粒的致病基因(virG、virB和virC)(Komari，见上)。供体和受体载体都共享有2.7Kb片段，在细菌例如根瘤土壤杆菌的这个区域内发生同源重组(单交叉)，形成杂合体载体。
本发明也提供了含有两个有助于标记物切割的分离T-DNA的超二元供体基础载体(图27)。一个T-DNA含有适用作模块表达框(例如嵌合的ubir::bar)的多克隆位点，另一个含有适用作嵌合的act1D::gusA或act1D::sgfp的R4R3多位点重组盒。ubi::bar-nos选择标记物盒已经被克隆到这个基础载体内(图28)。
此外，本发明提供了两个二元基础载体(图29和30)。T-DNA含有多克隆位点、嵌合的选择标记物和R4R3多位点重组盒。载体pPZP200ubi::bar-nos R4R3载体(图29)包括在多克隆位点上与玉米遍在蛋白启动子可操纵连接的bar基因。载体pPZP200ubi::dao1-nos R4R3(图30)包括来自酵母R.gracilis的在多克隆位点上与玉米遍在蛋白启动子可操纵连接的D-氨基氧化酶基因(dao1)。
本发明人还提供了用于表达抑制性RNA(例如RNAi)的二元基础载体(见图31所示)。该载体包括T-DNA，所述T-DNA包括ubi::dao1-nos选择标记物盒。载体还包括用于克隆相对于RNAi分子的表达为有义或反义定位的核酸的rfa和raf(as)重组位点。
例如，在表2所述的每个参考文献中也都描述用于生产其他的二元载体的方法。
3.3 向细菌内引入核酸 用于向细菌内引入核酸的方法是本领域已知的。例如，在一个实例中，利用电穿孔将核酸构建体引入到或转化到细菌内。根据这个实施方式，利用本领域已知的方法制备出转化感受态细菌。然后在能够破坏细胞膜的条件下，用核酸构建体接触所述细胞并将其暴露于电脉冲中一段时间。在一段使得能够在细菌内表达有功能的报告子基因的合适时间之后，通过将细胞生长在抗生素中来选择出包括表达载体的那些细胞。用于利用电穿孔转化细胞的方法是本领域已知的和/或在den Dulk-Ras and Hooykaas，Methods Mol.Biol.5563-72，1995或Tzfira et al，Plant Molecular Biology Reporter，15219-235，1997中所述的方法。
在另一个实例中，利用三亲杂交将核酸构建体引入到细菌内。简单的，三亲杂交包括一起培养三种细菌类型，以便有助于核酸构建体从一种细胞类型转移到另一种细胞类型。例如，在大肠杆菌内产生核酸构建体。但是，大肠杆菌和例如根瘤土壤杆菌不能杂交。因此，使用能够与两种细胞类型杂交的辅助细胞，有助于将核酸构建体从大肠杆菌动员或转移到根瘤土壤杆菌。
在另一个实例中，利用冻融方法例如Gynheung Methods in Enzymol，153292-305，1987所述的方法将核酸构建体引入到细菌内。例如，用核酸构建体接触细菌，并用液氮冷冻细菌一段时间例如一分钟。然后在足以诱导其所含的选择标记物表达的条件下，培养细胞一段时间，选出包括所述构建体的那些细胞。
3.4细菌和胚的接种以及共培养 在一个实例中，转化方法包括在足以使得所述细菌结合或附着于所述胚细胞的条件下，用包括核酸构建体的细菌接触胚细胞一段时间(即接种)。例如，在足以使得细菌结合或附着于所述胚细胞的条件下，将胚细胞完全或部分地浸泡在其中已经生长有包括核酸构建体的细菌的培养基中。
因此，在一个实例中，通过实施如下方法用包括如上所述的核酸构建体的细菌接种胚细胞，所述方法包括以下步骤 (i)在足以产生包括核酸构建体的细菌群的条件下，将所述细菌在培养基中生长一段时间；和 (ii)在所述细菌群生长之后，将胚细胞完全或部分地浸泡在所述培养基中，其中在足以使得所述细菌结合或附着于所述胚细胞的条件下，将所述胚细胞浸泡在所述培养基中一段时间。
本领域人员知道用于用细菌接种植物的合适条件。
例如，用细菌接触胚细胞一段范围从约5分钟(Cheng et al，In Vitro CellDev Biol-Plant.39595-604，2003)到约2天的时间。更优选地，用细菌接触胚细胞一段范围从约30-60分钟(Weir et al.，Aust J Plant Physiol.28807-818，2001)到约1天的时间。甚至更优选地，用细菌接触胚细胞从约60分钟到约4个个小时，更优选地是为约3个小时(如在此举例说明的和/或在Chenget al，Plant Physiol.115971-980，1997中所述的)。
优选地，在约21℃到约28℃的温度下实施接种。更优选地，在约23℃到约26℃的温度下实施接种。甚至更优选地，在约室温的温度下实施接种。
一般而言，都在支持胚细胞和细菌生长和/或生存的培养基中实施接种。合适的培养基是本领域已知的，并包括例如Murashige和Skoog培养基(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)或其稀释形式。
在一个实例中，用包括酚诱导剂例如乙酰丁香酮、松柏醇或丁香醛的培养基接种胚细胞。在这个方面，已经显示出乙酰丁香酮显著地增加了土壤杆菌对T-DNA的转运(Wu et al，Plant Cell Reports.；21659-668，2003)。优选地，用包括约100μM到约500μM乙酰丁香酮的培养基接种禾本科胚细胞。更优选地，用包括约200μM到约400μM乙酰丁香酮的培养基接种胚细胞。甚至更优选地，用包括约200μM乙酰丁香酮的培养基接种胚细胞。
也已经报道表面活性剂可以增加细菌例如土壤杆菌的T-DNA转运(Wuet al.，同上)。因此，在一个实例中，用包括表面活性剂的培养基接种胚细胞。合适的表面活性剂的实例包括

(Monsanto)或Tween 20。优选地，培养基包括从约0.01％表面活性剂到约0.5％表面活性剂，更优选地是从约0.1％到约0.4％表面活性剂。
在一个实例中，在暗处实施接种。或者，在亮处下实施接种。
本发明人也已经清楚地证实了在存在细菌氮源的情况下实施的接种可以显著地增加成熟胚细胞的转化效率。因此，在本发明的一个实例中，用包括细菌氮源的培养基接种禾本科胚细胞。例如，合适的氮源是植物或动物的蛋白提取物的酶消化物或对植物或动物提取物部分水解产生的水可溶性部分，例如蛋白胨。例如，蛋白胨来自植物例如大豆、蚕豆、小麦或马铃薯。或者，蛋白胨来自动物或动物产品例如猪皮、肉或酪蛋白。蛋白胨的合适的商品化来源对于本领域人员是显而易见的，并包括例如Sigma Aldrich、Organo Technie、GE Healthcare或Novogen。
在一个实例中，用包括大豆蛋白胨(例如SoytoneTM)的培养基接种禾本科胚细胞。例如，用包括从约0.001％到约0.1％蛋白胨(w/v)，更优选地从约0.01％到约0.05％蛋白胨(w/v)以及更优选地约0.02％蛋白胨(w/v)的培养基接种禾本科胚细胞。例如，用包括0.02％大豆蛋白胨(w/v)的培养基接种禾本科胚细胞。
不受理论或行为模式的限制，蛋白胨造成的转化效率增高可能是细菌例如土壤杆菌增加纤维素微纤维产生的结果，据此增强了所述细菌结合植物胚细胞的能力。因此，在一个实例中，用包括能够诱导细菌例如土壤携带细菌(优选地是土壤杆菌)产生纤维素微纤维的化合物的培养及接种胚的禾本科植物细胞。
在接种之后，一般利用例如真空或吸液去除培养基和未结合的细菌。然后，共培养胚的禾本科植物细胞以及在接种后与之结合的细菌。因此，在一个实例中，本发明的方法包括在足以使得所述细菌感染所述胚细胞的细胞或者所述细菌据此将所述核酸构建体中的转移核酸引入到所述胚细胞的细胞内的条件下维持培养细胞和包括核酸构建体的细菌。
本领域人员知道用于共培养植物细胞和细菌的合适条件。
例如，在适用于所述胚的禾本科植物细胞和结合细菌的生长和/或存货的培养基内维持胚的禾本科植物细胞和结合细菌一段时间，范围从约1天到约5天(Wu et al.，Plant Cell Reports.21659-668，2003)。优选地，共培养胚的禾本科植物细胞和结合细菌一段从约2天到约3天的时间(Weir et al，同上)。在本发明的一个实例中，共培养胚的禾本科植物细胞和结合细菌约3天的时间。
细菌例如土壤杆菌介导成功转化所需的vir基因最佳地在低于约28℃的温度下表达(Morbe et al，Molecular Plant-Microbe Interactions，2301-308，1989)。因此，优选地，在低于28℃的温度下实施共培养。优选地，在范围从约23℃到约28℃的温度下实施共培养。更优选地，温度范围是从约23℃到约26℃。更优选地，在室温下实施共培养。
或者，在多个温度下实施共培养。例如，在约27℃下实施共培养1天以及在约22℃下实施共培养约2天(Klianna and Daggard，Plant Cell Reports.21429-436，2003)。
细菌例如土壤杆菌介导成功转化所需的vir基因最佳地在细菌生长在酸性条件下时表达(Morbe et al，同上)。因此，优选地在酸性条件下实施共培养。例如，在低于约pH6.5，更优选地不到约6.0，更优选地不到约5.0的pH值条件下实施共培养。
在一个实例中，在酚诱导剂(例如乙酰丁香酮)和/或表面活性剂中实施共培养。合适的表面活性剂和/或乙酰丁香酮或表面活性剂的浓度如上所述，并经必要的调整应用于本发明的本实施方式中。
在一个实例中，在酚诱导剂和甜菜碱中实施共培养。已经显示在乙酰丁香酮中加入甜菜碱增强了土壤杆菌vir基因的诱导作用(Vernade et al，J.Bacterial.，1705822-5829，1988)。
显示能够增加vir基因表达和/或增加转化效率的其他因素包括例如糖(例如蔗糖)(Andenbauer et al，Journal of Bacteriology 1726442-6446，1990)。因此，在本发明的一个实例中，在蔗糖中实施共培养，例如为从约0.1％到约4％的蔗糖，更优选地从约0.2％到约2％的蔗糖。本发明人已经清楚地证实当在存在蛋白胨的情况下实施共培养时显著地增加了转化效率。在这个方面，合适的蛋白胨如上所述，并被经必要的调整应用于本发明的这个实施方式。
在一个实例中，在足以选择出包括核酸构建体的细菌的条件下实施接种和/或共培养。例如，如上所述，优选地核酸构建体包括在细菌中有活性的选择标记物。或者，一些细菌菌株包括选择标记物，以及利用细菌对其耐药的抗生素(不会抑制或阻止胚细胞的生长和/或存活)实施接种和/或共培养。
Roberts等(Proc.Natl.Acad.Set USA，1006634-6639，2003)证实了在细菌介导转化之前抑制嘌呤合成能增加转化效率。因此，在一个实例中，在接种和/或共培养之前，用抑制嘌呤合成的化合物接触胚性禾本科植物细胞。在这个方面，优选地在接种之前不洗去胚性禾本科植物细胞的嘌呤合成抑制剂。合适的嘌呤合成抑制剂对于本领域人员是显而易见的，并包括例如偶氮丝氨酸或阿西维辛或咪唑立宾。
在另一个实例中，在用细菌接种和/或共培养之前，弄伤胚性禾本科植物细胞。Bidney等(Plant Mol.Biol.，18301-313，1992)显示，与未受伤的细胞相比较，利用微粒轰击造成的创伤会显著地增加转化效率。用于弄伤胚性禾本科植物细胞的合适方法对于本领域人员是显而易见的。
在共培养之后，优选地去除仍与胚性禾本科植物细胞结合的任何细菌。例如通过洗涤胚细胞可以实现这一点。优选地，用包括例如对细菌例如土壤杆菌有毒的但对植物细胞无毒的抗生素的溶液洗涤胚细胞。例如，用头孢噻肟或羧苄西林洗涤胚细胞(Matthias and Boyd，Plant Sci 46217-233，1986)。
4、转基因植物或其部分的再生 4.1 愈伤组织诱导 在一个实例中，利用用在此所述的方法产生的转化胚性禾本科植物细胞再生出植物或植物部分或小植物。
优选地，在足以诱导愈伤组织形成的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转化禾本科胚植物细胞一段时间。
再者或另外，在足以诱导细胞去分化的条件下，用诱导细胞去分化的化合物接触转基因禾本科胚植物细胞一段时间。再者或另外，在足以生长未分化细胞的条件下，用诱导未分化细胞生长的化合物接触转基因禾本科胚植物细胞一段时间。
诱导愈伤组织形成和/或诱导未分化和/或去分化细胞产生的化合物对于本领域人员是显而易见的，并包括例如植物生长素例如2，4-D、3，6-二氯-o-茴香酸(3，6-dichloro-o-anisic acid)(麦草畏(Dicambia))、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸(4-amino-3，5，6-thrichloropicolinic acid)(毒莠定(Picloram))或塞苯隆(TDZ)。
在这个方面，优选地将转化胚细胞维持在愈伤组织诱导或加速培养基中。
这种培养基还可以包括一种或多种有助于愈伤组织产生/去分化或未分化细胞生长的化合物。例如，Mendoza和Kaeppler(In vitro Cell Dev.Biol.，3839-45，2002)发现包括麦芽糖的培养基比包括蔗糖的培养基更能增强2，4-D中的愈伤组织产生。
再者或另外，还用肌醇基础胚细胞。研究已经显示肌醇能用于维持愈伤组织中的细胞分裂(Biffen and Hanke，Biochem.J.265809-814，1990)。
同样，酪蛋白水解物显示能够诱导愈伤组织的细胞分裂以及维持愈伤组织形态产生性应答。因此，在另一个实例中，还用酪蛋白水解物接触胚性禾本科植物细胞。
用于从成熟胚性禾本科植物细胞诱导愈伤组织形成和/或细胞去分化和/或未分化细胞生长的合适培养基和方法都是本领域已知的和/或在Mendozaand Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol，，3839-45，2002；Ozgen et al，Plant CellReports，18331-335，1998；Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，31-11；Zale et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76277-281，2004和Delporte etal，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，80139-149，2005中有所描述的。
4.2 形成苗和/或根 在愈伤组织诱导、细胞去分化和/或未分化细胞生长之后，在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触胚性禾本科植物细胞和/或其所衍生的细胞(例如其所衍生的愈伤组织和/或去分化细胞或未分化细胞)一段时间。用于诱导苗形成的合适的化合物和方法都是本领域已知的，并在Mendoza and Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol，3839-45，2002；Ozgen et al，Plant Cell Reports，18331-335，1998；Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，31-11；Zale et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76277-281，2004；Murashige and Skoog，Plant Physiol，15473-479，1962或Kasha et al，(InGenemanipulation in plant improvement II，Gustafson ed.，Plenum Press，1990)中有所描述。
例如，用一种或多种诱导苗形成的植物生长调节剂接触愈伤组织、未分化细胞或去分化细胞。合适的化合物(即植物生长调节剂)的实例包括吲哚-3-乙酸(IAA)、苄腺嘌呤(BA)、吲哚-丁酸(IBA)、玉米素、α-萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(BAP)、塞苯隆、激动素、2iP或其组合。
包括用于诱导苗形成的化合物的培养基的合适来源是本领域已知的，并包括例如Sigma。
再者或另外，在足以诱导苗形成并产生小植物的条件下，将愈伤组织或未分化细胞或去分化细胞维持在不包括植物调节剂的培养基中一段时间。
在苗形成的同时或者在苗形成之后，在足以启动生根并产生小植物的条件下，优选地用诱导生根的化合物接触愈伤组织或未分化细胞或去分化细胞一段时间。
合适的诱导生根的化合物是本领域人员已知的，并包括植物生长调节剂例如上面所述的。
用于诱导生根的合适方法是本领域已知的和/或在Mendoza andKaeppler，In vitro Cell Dev.Biol，3839-45，2002；Ozgen et al，Plant CellReports，18331-335，1998；Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，31-11；Zale et al，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76277-281，2004；Murashigeand Skoog，Plant Physiol，15473-479，1962或Kasha et al，(InGenemanipulation in plant improvement II，Gustafson ed.，Plenum Press，1990)中所述的方法。
在本发明的一个实例中，在足以诱导苗形成的条件下用包括玉米素的培养基接触愈伤组织或未分化细胞或去分化细胞一段时间，以及在足以诱导生根的条件下，用包括NAA的培养基接触愈伤组织或未分化细胞或去分化细胞一段时间。然后在被盆栽(例如盆栽混合物和/或沙土中)和生长之前，将小植物生长一段足以生根的时间。
4.3 选择 在植物再生期间，优选地对转化胚细胞施加选择，据此减少细菌例如土壤杆菌的生长以及阻止不包括核酸构建体的植物细胞的生长。为了有助于这种选择，优选地是核酸构建体包括编码合适选择标记物的核酸。合适的选择标记物是本领域已知的和/或在此所述的。
例如，当选择标记物表达时，其赋予了对抗生素或杀虫剂的抗性。在愈伤组织诱导和/或植物再生期间，用所述抗生素或杀虫剂接触转化胚性禾本科植物细胞。结果，只有表达所述选择标记物的那些细胞才能在选择标记物中存活和/或生长，由此产生转基因植物(例如克隆转化体)。
在一个实例中，选择标记物有助于植物或植物细胞在对未转化细胞或植物有毒的化合物中生长。优选地，选择标记物基因编码有助于植物在D-氨基酸氧化酶中生长的蛋白。例如，选择标记物基因编码D-氨基酸氧化酶(DAAO)，例如再次所述的DAAO。其他合适的选择标记物基因对于本领域人员是显而易见的和/或在此所述的和/或在发表国际申请WO2003/060133中所述的。例如，选择标记物基因表达选自由D-丝氨酸氨裂解酶、D-谷氨酸氧化酶、D-天冬氨酸氧化酶、D-谷氨酸消旋酶和D-丙氨酸转氨酶组成的组中的蛋白。表达这种选择标记物基因的植物或植物细胞能够代谢D-氨基酸例如D-丙氨酸或D-丝氨酸。相反地，不表达选择标记物基因的植物或植物细胞不能在这种D-氨基酸中生长。事实上，一定浓度的D-氨基酸对于不表达合适选择标记物基因的植物或植物细胞是有毒的。为了选出转基因细胞和/或植物，在阻止未转化细胞生长或者诱导所述细胞死亡的条件下，用D-氨基酸例如D-丙氨酸和/或D-丝氨酸接触转化胚性禾本科植物细胞一段时间。例如，将细胞或愈伤组织或植物维持在至少约2Mm D-氨基酸或者至少约3mM D-氨基酸或者至少约4mM D-氨基酸或者至少约5mM D-氨基酸中一段时间。例如在愈伤组织诱导和/或植物再生期间，施加这种选择。
在另一个实例中，通过检测所述构建体表达的检测标记物来鉴定出包括核酸构建体的细胞或愈伤组织。合适的检测标记物是在此所述的。例如，检测和分离(例如通过切割)出表达dsRED标记物的愈伤组织，并将其用于再生转基因植物。在一个实例中，在愈伤组织诱导和/或植物再生的时候实施转化细胞的选择。
在另一个实例中，在开始植物再生之后开始转化细胞的选择。例如，在开始愈伤组织诱导之后约2周或3周或4周或5周才开始选择。
在一个实例中，分离出用本发明的方法已经转化的或者可能已经转化的细胞。在这个方面，本发明方法通常造成核酸被整合到胚的上胚层和/或盾片内。因此，在一个实例中，本发明方法包括在愈伤组织诱导之前、愈伤组织诱导期间和/或植物再生期间分离出上胚层和/或盾片细胞。然后用这种细胞再生出转基因植物。
通过检测所述构建体表达的检测标记物(例如dsRED)可以鉴定出包括核酸构建体的上胚层细胞或盾片细胞，分离出所述细胞，并用其再生出植物。
4.4 植物育种 用任一方式例如克隆繁殖或经典育种技术都可以繁殖出再生的转化植物。例如，第一代(或T1)转化植物进行自我受精，产生纯合子第二代(或T2)转化体，然后通过经典育种技术繁殖T2植物。或者，用经典育种技术育种第一代，产生杂合子植物，然后用其杂交产生纯合子植物。
在此提及的再生的转化植物可以是多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体或者克隆转化体(例如所有细胞都被转化成包含转移核酸或转基因)。
在一个实例中，再生的转化植物或其子代生长成熟，从成熟植物中获得种子或繁殖材料(例如生殖组织)。
本发明显然涉及利用本发明的方法产生的植物的子代和/或本发明的方法产生的植物的种子或种质或繁殖材料。根据在此的描述，用于生产这种子代、种子、种质或繁殖材料的方法对于本领域人员是显而易见的。
5、用于产生转基因禾本科细胞或再生植物的方法的实例 在一个实例中，本发明提供了用于再生转基因禾本科细胞的方法，所述方法包括 (i)从干燥的禾本科籽粒例如小麦籽粒或大麦籽粒或稻籽粒或玉米籽粒获得胚细胞； (ii)从胚细胞去除种皮和/或糊粉； (iii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在存在蛋白胨的情况下实施所述接触，以及其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；和 (iv)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到其中一个或多个细胞的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，其中在存在蛋白胨的情况下实施所述维持，由此产生转基因禾本科细胞。
例如，方法包括 (i)从干禾本科籽粒例如小麦籽粒或大麦籽粒或稻籽粒或玉米籽粒切下胚细胞； (ii)例如通过切割从胚细胞去除种皮和/或糊粉； (iii)在乙酰丁香酮、大豆蛋白胨和2，4-二氯苯氧乙酸中，用包括核酸构建体的根瘤土壤杆菌接触胚细胞至少约3个小时，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；和 (iv)将胚细胞和结合的土壤杆菌维持在乙酰丁香酮和2，4-二氯苯氧乙酸中至少约3天，据此容许土壤杆菌将转移核酸引入到其中一个或多个胚细胞中，由此产生转基因禾本科细胞。
在每个先前的实施方式中，优选地在约0.01％到约0.04％(w/v)蛋白胨例如约0.02％蛋白胨中实施土壤杆菌接触胚细胞的步骤。
也优选地在从约1mg/L 2，4-D到约4mg/L 2，4-D例如约2mg/L 2，4-D中实施土壤杆菌接触胚细胞以及维持胚细胞和结合的土壤杆菌的步骤。
也优选地在从约100μM乙酰丁香酮到约400μM乙酰丁香酮例如约200μM乙酰丁香酮中实施土壤杆菌接触胚细胞以及维持胚细胞和结合的土壤杆菌的步骤。
本发明也提供了用于从植物细胞再生植物的方法。例如，这种方法包括 (a)在足以产生愈伤组织的条件下用诱导愈伤组织形成的化合物接触植物细胞一段时间； (b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间； (c)在足以启动生根的条件下，用诱导生根的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和 (d)在足以产生植物的条件下，生长小植物一段时间。
例如，方法包括 (i)用包括2，4-D或麦草畏或TDZ或毒莠定的溶液接触转基因细胞，以便产生愈伤组织； (ii)用包括玉米素和/或TDZ的溶液接触(i)中产生的愈伤组织，以便产生苗； (iii)用包括α萘乙酸的溶液接触(ii)中产生的苗，以便开始生根，由此产生小植物。
例如，用包括从约1mg/L 2，4-D到约4mg/L 2，4-D例如约2mg/L 2，4-D的溶液接触转基因细胞。或者，用包括从约2mg/L麦草畏到约8mg/L麦草畏例如约4mg/L麦草畏的溶液接触转基因细胞。或者，用包括从约1mg/LTDZ到约6mg/L TDZ以及约1mg/L毒莠定到约4mg/L毒莠定，例如约3mg/LTDZ和约2mg/L毒莠定的溶液接触转基因细胞。
在另一个实例中，用包括从约1mg/L玉米素到约4mg/L玉米素例如约2mg/L玉米素的溶液接触愈伤组织。或者，用包括从约0.25mg/L TDZ到约2mg/L TDZ例如约1mg/L TDZ的溶液接触愈伤组织。
在进一步的实施例中，用包括从约0.25mg/L NAA到约2mg/L NAA例如约1mg/L NAA的溶液接触苗。
根据在此所述的描述，其他合适的化合物对于本领域人员是显而易见的，并应当经必要的调整将其应用于本发明的实施方式中。
对于本领域人员显而易见的是，任何先前段落中所讨论的用于再生植物的方法也能用于从在此所述的任一实施方式中的方法产生的转基因细胞再生出转基因植物。
6、植物表型的调控 通过先前的描述对于本领域人员显而易见的是，本发明提供了用于在禾本科植物中表达转基因或者调控基因表达的方法，例如，这种方法包括 (i)利用在此所述的任一实施方式中的方法产生转基因禾本科植物细胞，其中所述转基因细胞包括与在禾本科植物细胞中可操纵的启动子可操纵的连接的转基因； (ii)从所述细胞再生出转基因植物； (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因植物一段时间。
在另一个实例中，本发明提供了用于修饰禾本科植物中的核酸表达的方法，所述方法包括 (i)利用在此所述的任一实施方式中的方法产生转基因禾本科植物细胞，其中所述转基因细胞包括能够调控核酸表达的转基因； (ii)从所述细胞再生出转基因植物； (ii)在足以调控所述转基因的表达的条件下维持所述转基因植物一段时间。
这种方法显然能够用于调控植物或植物细胞的表型，例如通过表达赋予所需表型的基因或抑制赋予不良表型的基因的表达。
6.1 转基因在植物中的表达 在一个实例中，本发明提供了调控植物或其种子或其繁殖材料的表型的方法，所述方法包括利用在此所述的任一实施方式中的方法表达调控植物种子或繁殖材料的所述表型的转基因。或者，方法包括增强或诱导或赋予植物的表征。
例如，本发明提供了用于产生具有改良营养品质的禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)通过实施在此所述的任一实施方式中的方法，用包括编码与改良营养品质相关的蛋白的转基因的核酸构建体转化禾本科植物细胞； (ii)从所述细胞再生出转基因植物；和 (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因植物一段时间，由此产生具有改良营养品质的植物。
或者，本发明提供了用于生产表达药用蛋白或营养食品用蛋白的禾本科植物的方法。所述方法包括 (i)通过实施在此所述的任一实施方式中的方法，用包括编码药用蛋白或营养食品用蛋白的转基因的核酸构建体转化禾本科植物细胞； (ii)从所述细胞再生出转基因植物；和 (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因植物一段时间，由此产生表达药用蛋白或营养食品用蛋白的植物。
优选地，本发明的方法还包括产生或提供包括转基因的表达构建体和/或产生和/或提供包括所述表达构建体的细菌例如土壤杆菌。在这个方面，根据在此的描述，本领域人员知道用于产生包括这种核酸构建体的这种表达构建体和/或细菌的合适方法。
本发明显然也包括具有改良营养或药物质量的禾本科植物或其子代或其种子或起种质。例如，用在此所述的任一实施方式中的方法产生禾本科植物、子代、种子或种质。
例如，本发明能够用于生产表达药用、免疫用或营养用蛋白或者生产药用、免疫用或营养用的二级产物所需的酶、或能够修饰二级代谢途径中的底物利用的蛋白的转基因植物。这些蛋白对于本领域人员是已知的，并包括例如一组结构和功能都不同的抗原蛋白(例如源自感染人或以籽粒产品为食的动物的病原体的抗原蛋白)、富硫蛋白(例如巴西坚果蛋白、向日葵子白蛋白、2S蛋白、Aspl合成蛋白)、钙结合蛋白(例如钙调蛋白、钙网织蛋白、或隐钙素)、铁结合蛋白(例如血红蛋白)和产生渗透保护剂所需的生物合成酶，例如甜菜碱(例如胆碱氧化酶、甜菜碱醛脱氢酶)、脂肪酸(例如Δ-12去饱和酶)、植物甾醇(例如S-腺苷-L-甲硫氨酸-Δ24-甾醇甲基转移酶(SMTI或SMTII)、C-4去甲基化酶、环桉烯醇到钝叶醇异构酶、14α-甲基去甲基化酶、Δ8至Δ7异构酶、Δ7-甾醇-C-5去饱和酶、24，25-还原酶)、花青苷或其他色素(原花青素(proanthocyaninidin)还原酶)、木质素(例如桂皮烯醇脱氢酶、咖啡酸O-甲基转移酶、或苯丙氨酸氨裂解酶)、抗营养蛋白、能够改变苯基丙酸类(phenylpropanoid)途径中的底物的酶(例如胆碱氧化酶、甜菜碱醛脱氢酶、阿魏酸脱羧酶)、能够作用于胆碱以修饰苯基丙酸类途径中其他酶对胆碱的利用的胆碱代谢酶(例如胆碱氧化酶、甜菜碱醛脱氢酶、阿魏酸脱羧酶)、涉及麦苗处理过程的酶(例如高pI-α淀粉酶、低pI-α淀粉酶、EII-(1-3，1-4)-β葡聚糖酶、组织蛋白酶β样蛋白酶、α-葡糖苷酶、木聚糖酶或阿拉伯呋喃糖酶)、能够作用于糖醇的酶、或者能够作用于肌醇的酶等。在科学文献中可公开获得或描述了编码这些蛋白的核酸。在美国国立医学图书馆的国立生物技术信息中心的数据库(8600 Rockville Pike，Bethesda，MD20894，USA)中充分描述了这些核酸及其编码的蛋白的结构(例如序列)。对于本领域人员显而易见的是，这种核酸是用于本发明方法中的合适转基因。
在一个示例的实施方式中，本发明的方法被用于产生表达在天然HMW-GS调节序列控制下的杂合体高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的转基因植物，例如Blechl and Anderson Nature Biotechnology，14875-879，1996所述。
再者或另外，用在此所述的任一实施方式中的方法将编码HMW-GS1Ax1基因(SEQ ID NO40)的转基因引入到小麦细胞内，然后用其产生转基因小麦植物。优选地，在核酸构建体中，HMW-GS Ax1基因被可操纵的放置于其内源性启动子的控制之下。通过增加小麦籽粒中的HMW-GS水平，可以增强用小麦制成的面团的弹性，据此增强小麦面粉的面包制作性能。
禾本科植物的籽粒也被广泛地用作非反刍动物的动物饲料。黑曲霉的植酸酶(SEQ ID NO42)被用作提高可消化性以及提高磷和矿物质的生物利用度的饲料添加剂。在一个实例中，本发明的方法被用于产生组成地或者在籽粒或种子的胚乳中表达黑曲霉的phyA基因的转基因禾本科植物。
在另一个实例中，本发明的方法被用于产生表达治疗性蛋白例如疫苗或抗体片段的禾本科植物。改良植物抗体载体(例如Hendy et al.J.Immunol.Methods 231137-146，1999所述)和纯化策略使得这种方法成为生产重组免疫球蛋白的实际的和有效的工具，所述免疫球蛋白不仅用于人类和动物的治疗，还用于工业应用(例如催化抗体)。此外，植物产的抗体已经显示出是安全和有效的，并且避免了动物源性材料的使用，因此避免了传染性海绵状脑病(TSE)病原体的污染危险。此外，植物和哺乳动物产的抗体之间的糖基化模式的差异对抗原结合或特异性都只有很小的或者没有影响。另外，在接受局部口服施用的植物源性分泌性二聚体IgA抗体的患者中没有观察到毒性或HAMA的证据(见see Larrick et al.Res.Immunol.149603-608，1998)。
各种方法都可以被用于在转基因植物中表达抗体。例如，可以将抗体重链和轻链单独地克隆到核酸构建体内，随后用本发明的方法体外转化植物细胞。之后，再生出表达单个链的整个植物，再通过它们的有性杂交最终造成完全装配的和有功能的抗体的产生(见例如Hiatt et al.Nature 34216-87，1989)。在各种实施例中，可以利用信号序列通过它们指导链进入合适的植物环境内来促进未装配链的表达、结合和折叠。
在这个方面，将编码抗体片段例如相关抗体的重链和轻链的核酸都克隆到在此所述的表达构建体内。然后将此构建体引入到细菌内，然后用所述细菌产生表达抗体片段的转基因植物。利用标准方法可以从植物例如种子中分离出这种片段。
在另一个实例中，在植物内表达能够引发宿主体内的免疫应答的肽或多肽，例如，将编码乙型肝炎病毒表面抗原(SEQ ID NO44)的转基因插入到在此所述的核酸构建体内，并用在此所述的任一实施方式中的方法利用所述构建体产生转基因禾本科植物。在这个实施方式中，然后将利用禾本科植物或其部分(例如小麦麦麸)产生的食品作为医疗食物或口服疫苗施用给人(例如给人喂养)。
在另一个实例中，本发明的方法被用于产生雄性不育植物，据此有助于杂合体植物的产生。在这个方面，雄性不育植物不能自我受精，据此有助于产生植物系。例如，产生包括在合适启动子(例如绒毡层(tapetum)特异性启动子)控制下的Barnase转基因(SEQ ID NO46)的核酸构建体。然后将该构建体引入到细菌内，用在此所述的任一实施方式中的方法产生转基因禾本科植物。该基因的表达阻止了花药发育特殊阶段的花粉发育，由此产生了雄性不育植物。
在进一步的实施例中，本发明的方法被用于产生具有抗生物应激(例如真菌病原体)的抗性的转基因植物。因此，在另一个实例中，本发明提供了产生具有抗生物应激的抗性的转基因禾本科植物，所述方法包括 (i)用在此所述的任一实施方式中的方法产生包括编码赋予或增强对生物应激的抗性的蛋白的转基因的转基因禾本科植物细胞； (ii)从所述细胞再生出转基因植物；和 (ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因植物一段时间，由此产生具有抗生物应激抗性的转基因禾本科植物。
在一个实例中，上面所述的方法经必要的调整应用于提高或增强植物对生物应激的抗性的方法。
在另一个实例中，生物应激是植物病原体例如真菌、病毒、细菌或为禾本科植物或禾本科植物的一部分(例如禾本科植物的种子或籽粒)为食的昆虫。赋予对这种植物病原体的抗性的蛋白是本领域人员已知的，并包括例如一组结构和功能都不同的植物防御蛋白或致病相关蛋白(例如壳多糖酶特别是酸性壳多糖酶或内切壳多糖酶；β葡聚糖酶特别是β-1，3-葡聚糖酶；核糖体失活蛋白(RJP)、γ高梁醇溶蛋白；wheatwin或WPR4)、硫素特别是γ硫素；奇甜蛋白或奇甜蛋白样蛋白例如玉米素；蛋白酶抑制剂例如胰蛋白酶或糜蛋白酶；或Sormatin)、病毒外壳蛋白或将一种或多种病原体毒素转化成无毒产物的蛋白。在科学文献中可公开获得或描述了编码这些蛋白的核酸。在美国国立医学图书馆的国立生物技术信息中心的数据库(8600 Rockville Pike，Bethesda，MD 20894，USA)中充分描述了这些核酸及其编码的蛋白的结构(例如序列)。对于本领域人员显而易见的是，这种核酸是用于本发明方法中的合适转基因。
例如，产生编码小麦线条花叶病毒的外壳蛋白(SEQ ID NO48)的核酸构建体，然后用其产生转基因小麦植物。优选地，在小麦的种子中表达基因，但是，组成型表达也是被打算的。这种表达赋予了抗小麦线条花叶病毒的抗性。
在另一个实例中，在利用在此所述的任一实施方式中的方法产生小麦植物的过程中使用了赋予或增强了小麦对河谷镰刀菌(赤霉病)的抗性的蛋白。在这个实施方式中，赋予或增强抗河谷镰刀菌的保护性的蛋白选自由(i)赋予小麦抗真菌病原体河谷镰刀菌保护性的小麦奇甜蛋白样蛋白(即SEQID NO50)；(ii)抗河谷镰刀菌产生的单端孢霉烯的小麦的修饰核糖体蛋白L3(即wRPL3Cys 258；SEQ ID NO52)和(iii)具有单端孢霉烯O-乙酰转移酶活性并且能够将河谷镰刀菌产生的单端孢霉烯转化成无毒产物的多肽(即SEQ ID NO54)组成的组。
或者，可以用大麦的壳多糖酶基因产生具有抗小麦白粉病菌(Erisiphegraminis)抗性的转基因小麦植物。
或者，可以用来自玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的杀手蛋白产生具有抗小麦腥黑穗菌(Tilletia tritici)抗性的转基因小麦。
或者，可以用大麦胰蛋白酶抑制剂CMe产生具有抗为种子为食的昆虫幼虫抗性的转基因小麦植物。
仍在进一步的实施例中，本发明提供了用于产生具有抗非生物应激抗性的转基因禾本科植物的方法，所述方法包括 (i)用在此所述的任一实施方式中的方法产生包括编码赋予或增强对非生物应激的抗性的蛋白胨转基因的转基因禾本科植物细胞； (ii)从所述细胞再生出转基因植物；和 (iii)在足以诱导所述核酸表达的条件下维持所述转基因植物一段时间，由此产生具有抗非生物应激抗性的转基因禾本科植物。
优选地，上面所述的方法经必要的调整应用于提高或增强植物对非生物应激抗性的方法中。
在进一步的实施例中，非生物应激是干旱或干燥。表达晚期胚产生蛋白的转基因可用于产生具有干旱或干燥抗性或耐受性的转基因禾本科植物，所述晚期胚产生蛋白在种子干燥时发生蓄积以及当植物感受到缺水时蓄积在营养组织内。例如，用编码大麦HVA1的核酸(SEQ ID NO56)产生在此所述的表达构建体。然后利用在此所述的任一实施方式中的方法，用这个表达构建体产生转基因植物。
在另一个实例中，用编码拟南芥DREB1A(SEQ ID NO58)产生转基因禾本科植物，所述转基因禾本科植物除了具有对低温和/或盐度的耐受性外还具有提高了的抗旱性。
6.2 调控禾本科植物中的表达 要明白本发明也可以扩展到产生表达不会编码蛋白的转基因的转基因植物。例如，转基因编码干扰RNA、核酶和抗体酶、共抑制分子、基因沉默分子或基因靶向分子，其阻止或减少了相关核酸的表达。
用于产生干扰RNA或核酶或抗体酶的合适方法是本领域已知的。
例如，已经鉴定出了多种类型的核酶。一组核酶是源自多种能够在植物中自我解离和复制的小环状RNA。示例包括来自鳄梨日斑病类病毒素的RNA和来自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。在例如Haseloff et al.Nature，534585-591(1988)中描述了编码能够选择性解离靶向RNA的转基因的设计和用途。
或者，转基因表达能够诱导对靶向核酸的有义抑制的核酸。例如，产生包括被设置成有义方向上的作为靶向核酸的启动子的核酸的转基因。例如在Napoli et al，The Plant Cell 2279-2891990；或美国专利5,034,323中描述了这种方法。
为了通过有义抑制减少或阻止核酸的表达，转基因不必与核酸绝对相同。此外，对于通过有义抑制减少或阻止所述核酸的表达而言，转基因不必包括核酸的完整序列。
RNA干扰也可以用于减少或阻止核酸的表达。在Marx，Science，2551370-1372，2000中描述了RNAi的合适方法。在WO 99/49029、WO99/53050和WO0/75164中描述了用于减少或阻止核酸表达的示例方法。简单的，产生表达与靶向核酸的核苷酸序列互补的核酸的转基因。转基因还表达与靶向核酸的所述核苷酸序列基本上相同的核酸。转基因所表达的两个核酸能够杂交并减少或阻止靶向核酸的表达，推测是在转录后水平。
例如，可能需要表达例如减少或阻止感染禾本科植物所需的真菌核酸的表达的抑制性RNA。例如，多种昆虫和真菌病原体完成生命周期都需要S-腺苷-L-甲硫氨酸-Δ24-甾醇甲基转移酶(SMTI或SMTII)，表达抗该酶的抑制性RNA可以阻止病原体成熟为成体，据此阻止病原体在禾本科植物中的播散。
或者，在小麦中表达编码减少或阻止小麦线条花叶病毒(WSMV)的运动蛋白的抑制性RNA分子，以便抑制病毒从果皮运动到植物的脉管系统。
在另一个实例中，转基因编码抑制性RNA、核酶、抗体酶、共抑制分子、基因沉默分子或基因靶向分子，据此增强或改变禾本科植物的营养特征。例如，小麦籽粒主要是由淀粉组成的，所述淀粉是两种聚合物的混合物殆线性直链淀粉和高度分支的支链淀粉。通过改变支链淀粉与直链淀粉的比例，可以改变小麦的物理化学性能和/或终用途。为了改变支链淀粉与直链淀粉的比例，在转基因小麦植物中表达减少或阻止颗粒结合性淀粉合酶I基因(编码GBSSI或WAXY蛋白)表达的抑制性RNA，据此改变所述植物中的直链淀粉水平。来自表达这种转基因并具有相对于支链淀粉的低水平直链淀粉的植物的面粉是制作面条所需要的，因为它提高了面条的质感。因此，通过减少颗粒结合性淀粉核酶I基因的表达，提高了小麦的面条制作的质量。
本发明显然可以扩展到具有在此所述的改变了的表型或改变了的基因表达的植物、子代、种子、繁殖材料。优选地，用本发明的方法产生这种植物、子代、种子、繁殖材料。
8、其他方法 本发明也提供了用于从植物细胞再生出植物或小植物或植物部分得方法。例如，这种方法包括 (a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触植物细胞； (b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间； (c)在足以启动生根的条件下，用诱导生根的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和 (d)在足以产生植物或小植物或植物部分的条件下，生长小植物一段时间。
例如，方法包括 (i)用包括2，4-D或麦草畏或TDZ或毒莠定的溶液接触转基因细胞，以便产生愈伤组织；和 (ii)用包括玉米素或TDZ的溶液接触(i)中产生的愈伤组织，以便产生苗； (iii)用包括α萘乙酸的溶液接触(ii)中产生的苗，使得开始生根，由此产生小植物。
例如，用包括从约1mg/L 2，4-D到约4mg/L 2，4-D例如约2mg/L 2，4-D的溶液接触转基因细胞。或者，用包括从约2mg/L麦草畏到约8mg/L麦草畏例如约4mg/L麦草畏的溶液接触转基因细胞。或者，用包括从约1mg/LTDZ到约6mg/L TDZ以及约1mg/L毒莠定到约4mg/L毒莠定，例如约3mg/LTDZ和约2mg/L毒莠定的溶液接触转基因细胞。
在另一个实例中，用包括从约1mg/L玉米素到约4mg/L玉米素例如约2mg/L玉米素的溶液接触愈伤组织。或者，用包括从约0.25mg/L TDZ到约2mg/L TDZ例如约1mg/L TDZ的溶液接触愈伤组织。
在进一步的实施例中，用包括从约0.25mg/L NAA到约2mg/L NAA例如约1mg/L NAA的溶液接触苗。
根据在此所述的描述，其他合适的化合物对于本领域人员是显而易见的，并且应当经必要的调整应用于本发明的实施方式。
在一个实例中，再生植物或小植物或植物部分的方法是用于再生转基因植物或小植物或植物部分的方法，其中转基因植物或小植物或植物部分表达选择标记物，以及方法还包括选出表达所述选择标记物的转基因植物或小植物或植物部分或转基因植物细胞。
在此描述了合适的选择方法，并经必要的调整应用于本发明的实施方式中。
本发明也提供了选择表达选择标记物基因的转基因植物或小植物或植物部分或转基因植物细胞，其中所述选择标记物基因将有毒底物转化成无毒底物和/或容许表达所述选择标记物基因的植物或小植物或植物部分或植物细胞在有毒底物中生长，所述方法包括在足以杀死或阻止未表达选择标记物基因的植物或小植物或植物部分或植物细胞生长的条件下，用所述有毒底物接触所述转基因植物或小植物或植物部分或植物细胞一段时间，据此选出转基因植物或小植物或植物部分或转基因植物细胞。
在此描述了合适的选择标记物基因和选择方法，并经必要的调整应用于本发明的实施方式中。
本发明也提供了检测或鉴定出表达检测标记物基因的转基因植物或小植物或植物部分或转基因植物细胞的方法，其中当在植物、小植物、植物部分或植物细胞中表达所述检测标记物基因时，其会产生检测信号，据此检测或鉴定出转基因植物或小植物或植物部分或转基因植物细胞。
在一个实例中，方法还包括选择表达检测标记物基因的植物或小植物或植物部分或植物细胞。
在此描述了合适的检测标记物基因和检测或鉴定的方法，并经必要的调整应用于本发明的实施方式中。
还参照下面非限制性实施例进一步描述了本发明。
实施例1小麦胚细胞的转化 将普通小麦(Bobwhite)的小麦籽粒在0.8％(v/v)NaOCl溶液中表面消毒30分钟，并在无菌蒸馏水中漂洗至少4次。
从经表面消毒的籽粒中切下成熟胚，去除种皮，将其直接用于土壤杆菌介导的转化。图1总结了成熟小麦籽粒的土壤杆菌感染的过程。图2显示了从干小麦籽粒中分离出具有完整上胚层和盾片的胚的过程。
外植体被直接用于土壤杆菌介导的转化。在50mL Falcon管中，用包括pCAMB1A1305.2载体(表达在CaMV35s启动子的控制下的GUS报告子基因)或pLM301(pSB1_Ubi1::DsRed2-nos)的土壤杆菌菌株EHA105接种10到15ml加有100μg/mL利福平和卡那霉素的LB，在27℃到28℃下温育24到48个小时。对于接种而言，用100μl土壤杆菌培养物接种25mL加有卡那霉素的新鲜LB，并温育24个小时。在室温下，将该完全浓度(fullstrength)的接种物在3000rpm离心10分钟，所形成的沉淀重悬于液体接种培养基(MS[1/10])中，使得OD600＝0.25-0.8。该接种培养基是由1/10浓度的液体Murashige和Skoog(Murashige and Skoog，Physiol Plant，15473-497，1962)基本盐(MS[1/10])以及2mg/L2，4-D、200μM乙酰丁香酮和0.02％(w/v)SoytoneTM组成。
轻微搅拌下，将土壤杆菌感染在室温下标准化3个小时。随后，在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、以及200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto琼脂组成的培养基中21℃、暗处共培养3天，其中胚轴优选地朝下。
任选地用没有乙酰丁香酮或SoytoneTM但加有250mg/L头孢噻肟的液体MS[1/10]充分地洗涤外植体。或者，用加有250mg/L头孢噻肟的无菌水洗涤外植体，直到不再看到土壤杆菌残留的征象(即洗涤溶液在洗涤后仍是清亮的)。
利用组织化学GUS检测法(Jefferson，Plant Mol.Biol.Rep.5387-4051987)或利用带DsRED1光学滤器的Leica立体显微镜的观察来确定出含150mg/L特美汀(Timentin)的诱导培养基上的3天后(或其他时间点)取样的外植体上的一过性gusA或DsRed2的表达(见图2)。
对于组织化学的gusA表达检测而言，将外植体在含1mM X-Gluc、100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾和0.1％(v/v)Triton X-100的缓冲液中、37℃下培育过夜。在显微镜下计数出蓝色gusA表达灶，通过计数至少有一个gusA表达灶的外植体以及计数出每个胚的表达灶数目可以评价T-DNA转运。为了检测稳定的gusA表达愈伤组织，将来自再生小植物的苗和叶片段都在37℃下培育过夜，如果需要再在25℃下培育1到2天。如图2所示，在接种3天后的转化胚中可以检测到gusA和DsRed2的表达。
实施例2用于诱导愈伤组织和再生转基因植物的方法1 在对如实施例1所示产生的转化胚进行共培养和任选的洗涤之后，将外植体放置在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素组成的培养基上，还加有200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto琼脂进行体胚诱导，以及还加有潮霉素B(5-15mg/L)或5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)。在一些情况中，直到接种后5周才施加选择。
将成熟胚外植体在暗处培育3周，之后它们在选择培养基上产生愈伤组织。将在选择培养基上显示出愈伤组织产生的外植体在加有选择剂和抗生素的新鲜培养基中进行规律的亚培养。
在至少3周的愈伤组织诱导之后，将胚产生愈伤组织转移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L玉米素和0.8％-2.0％(w/v)Bacto琼脂以及10mg/L潮霉素B和控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)组成的再生培养基中。
将外植体在亮处再培养最少1到2个周期的2到3周，将推测的转基因小植物/愈伤组织转移到新鲜的再生培养基中。
再过10天之后，将再生小植物转移到加有用于启动生根的1mg/L NAA的MS[1/2]中。将任何在生根培养基中存活超过3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)组成的苗圃混合物中，并维持于22℃到24℃以及苗圃湿度箱系统的高湿度下。在2周之后，从湿度箱中取出植物，手工浇水以及给予液体AquasolTM直到成熟。图3显示了从成熟胚的愈伤组织诱导和再生的示意图以及再生转基因小麦的结果。
实施例3用于诱导愈伤组织和再生转基因植物的方法2 在对如实施例1所示产生的转化胚进行共培养和任选的洗涤之后，将外植体放置在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)麦芽糖、1.95g/L MES、0.69g/L脯氨酸、20mg/L盐酸硫胺素、4mg/L麦草畏(Dicamba)和0.8％(w/v)Bacto琼脂以及潮霉素B(5-15mg/L)和/或优选地5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)组成的愈伤组织诱导培养基(CIM-D)中。在一些情况中，直到接种后5周才施加选择。
将成熟胚外植体在暗处培育3周，之后它们在选择培养基上产生愈伤组织。将在选择培养基上显示出愈伤组织产生的外植体在加有选择剂和抗生素的新鲜CIM-D中进行规律的亚培养。
在至少3到4周的愈伤组织诱导之后，将胚产生愈伤组织转移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、20mg/L盐酸硫胺素、750mg/L谷氨酰胺、5μM CuSO4、1.95g/L MES、3％(w/v)麦芽糖、1mg/L TDZ和0.8％(w/v)Bacto琼脂以及10mg/L潮霉素B和/或5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)组成的再生培养基(SGM)中。
将外植体在亮处再培养最少1到2个周期的2到3周，将推测的转基因小植物/愈伤组织转移到新鲜的再生培养基中。
再过10天之后，将再生小植物转移到用于启动生根的由MS[1/2]、1mg/LNAA和10mg/L潮霉素B和/或5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和抗生素(例如头孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)组成的RM培养基中。将任何在生根培养基中存活超过3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)组成的苗圃混合物中，并维持于22℃到24℃以及苗圃湿度箱系统的高湿度下。在2周之后，从湿度箱中取出植物，手工浇水以及给予液体AquasolTM直到成熟。图3显示了从成熟胚的愈伤组织诱导和再生的示意图以及再生转基因小麦的结果。
实施例4用于诱导愈伤组织和再生转基因植物的方法3 在对如实施例1所示产生的转化胚进行共培养和任选的洗涤之后，将外植体放置在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)麦芽糖、1.95g/L MES、0.69g/L脯氨酸、20mg/L盐酸硫胺素、3mg/L TDZ、2mg/L毒莠定和0.8％(w/v)Bacto琼脂以及潮霉素B(5-15mg/L)和/或优选地5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)组成的愈伤组织诱导培养基(CIM-TP)中。在一些情况中，直到接种后5周才施加选择。将成熟胚外植体在暗处培育3周，之后它们在选择培养基上产生愈伤组织。将在选择培养基上显示出愈伤组织产生的外植体在加有选择剂和抗生素的新鲜CIM-TP中进行规律的亚培养。
在至少3到4周的愈伤组织诱导之后，将胚产生愈伤组织转移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、1g/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、20mg/L盐酸硫胺素、750mg/L谷氨酰胺、5μM CuSO4、1.95g/L MES、3％(w/v)麦芽糖、1mg/L TDZ和0.8％(w/v)Bacto琼脂以及10mg/L潮霉素B和/或优选地5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)组成的再生培养基(SGM)中。
将外植体在亮处再培养最少1到2个周期的2到3周，将推测的转基因小植物/愈伤组织转移到新鲜的再生培养基中。
再过10天之后，将再生小植物转移到用于启动生根的由MS[1/2]、1mg/LNAA和10mg/L潮霉素B和/或优选地5-7.5mM D-丝氨酸或D-丙氨酸和抗生素(例如头孢噻肟250mg/L和/或特美汀150mg/L)组成的RM培养基中。将任何在生根培养基中存活超过3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)组成的苗圃混合物中，并维持于22℃到24℃以及苗圃湿度箱系统的高湿度下。在2周之后，从湿度箱中取出植物，手工浇水以及给予液体AquasolTM直到成熟。图3显示了从成熟胚的愈伤组织诱导和再生的示意图以及再生转基因小麦的结果。
测试了一组浓度的D-氨基酸(D-丝氨酸和D-丙氨酸)对从源自品系Bobwhite的成熟干籽粒的胚再生出小麦以及苗形成情况的影响。如表4和5所示，当D-丝氨酸和D-丙氨酸水平分别超过7.5mM和5mM时，它们都减少了小麦植物的再生和萌芽。在小麦基因型Ventura中也观察到了相似的结果(表6和7)。
表4D-丝氨酸和D-丙氨酸对从源自品系Bobwhite的成熟干籽粒的胚再生出小麦的影响。数据是3周后再生的外植体的比例(％)(n＝20)。

表5D-丝氨酸和D-丙氨酸对品系Bobwhite的成熟干籽粒萌芽的影响。数据是1周后萌芽的外植体的比例(％)(n＝20)。

表6D-丝氨酸和D-丙氨酸对从源自品系Ventura的成熟干籽粒的胚再生出小麦的影响。数据是3周后再生的外植体的比例(％)(n＝20)。

表7D-丝氨酸和D-丙氨酸对品系Ventura的成熟干籽粒萌芽的影响。数据是1周后再生的外植体的比例(％)(n＝20)。

实施例5用Q-PCR检测转基因小麦 对T0和T1植物的基因组DNA取样进行分子分析。用

探针进行所有的Q-PCR，以检测扩增。已经建立了对gusA和DsRed2基因和bar、dao1、dsdA和hph选择标记物基因的Q-PCR

筛选。为了确保阳性的Q-PCR信号不是由于土壤杆菌的偶然存在所造成的，已经建立对来自T-DNA外面的virC基因的Q-PCR

筛选。
每个候选基因的标准实时PCR混合物都含有2x

主要混合物、300nM每种引物、250nM探针、10到20ng基因组DNA以及水，终体积为10μl。PCR的热循环条件是1个循环的50℃ 2分钟，1个循环的95℃ 5分钟以及40个循环的95℃ 15秒、60℃1 分钟。在Stratagene MX3000p实时PCR热循环仪中进行Q-PCR和数据分析。
如图4A-D所示，利用

检测法在独立的Ti转基因小麦系中检测到了转基因的存在。
实施例6用Southern杂交检测转基因小麦 用Southern印迹法分析T1或T2植物的基因组DNA，以便检测出转基因的稳定整合以及引入的拷贝数目。根据Dellaporta et al Plant Mol Biol Rep.，419-21，1983的方法，从小麦叶中分离出总基因组DNA。用合适的限制性酶消化20到30微克基因组DNA，并将其溶解在0.8-1％琼脂糖凝胶上，并将其印迹到尼龙膜上(Hybond N，Amersham，UK)。
为了检测出含来自载体pCAMBIA1305.2的T-DNA的转基因小麦，用经限制性酶EcoR1消化过的基因组DNA制备出印迹，所述酶在T-DNA区域内切割一次。首先对印迹探查是否存在hph，随后探查是否存在gusA。gusA探针是利用引物CAT CCT CGA CGATAG CAC CC(SEQ ID NO72)和TCATGT TTG CCAAAG CCC TT(SEQ ID NO73)从pCAMBIA1305.2PCR扩增到的501bp长的产物；hph探针是利用引物CGC ATA ACA GCGGTC ATT GAC TGG AGC(SEQ ID NO74)和GCT GGG GCG TCG GTTTCC ACT ATC GG(SEQ ID NO75)从pCAMBIA1PCR扩增产生的375bp长的产物。
对于含有来自载体pMPB0057(pUbi1::bar-nos_Act1D::gusA(int))的T-DNA的转基因小麦而言，用经限制性酶HindIII消化过的基因组DNA制备出印迹，所述酶在T-DNA区域内切割一次。首先对印迹探查是否存在bar，随后探查是否存在gusA。gusA探针是利用引物ATG AAC TGT GCG TCACAG CC(SEQ ID NO76)和TTG TCA CGC GCT ATC AGC C(SEQ ID NO77)从pMPB0057PCR扩增到的451bp长的产物；hph探针是利用引物GTCTGC ACC ATC GTC AAC C(SEQ ID NO78)和GAA GTC CAG CTG CCAGAAAC(SEQ ID NO79)从pMPB0057PCR扩增产生的425bp长的产物。
对于含有来自载体pSB1_Ubi1::dsdA-ocs_Ubi1::DsRed2-nos的T-DNA的转基因小麦而言，用经限制性酶SphI消化过的基因组DNA制备出印迹，所述酶在T-DNA区域内切割一次。首先对印迹探查是否存在DsRed2，随后探查是否存在dsdA。DsRed2探针是利用引物CTG TCC CCC CAG TTC CAGTA(SEQ ID NO80)和CGATGG TGTAGT CCT CGT TGT G(SEQ ID NO81)从pSB1_Ubi1::dsdA-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR扩增到的450bp长的产物；dsdA探针是利用引物GTG GGC TCAACC GGAAAT CT(SEQ ID NO82)和GCA GTT GTT CTG CGC TGA AAC(SEQ ID NO83)从pSB1_Ubi1::dsdA-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR扩增产生的750bp长的产物。
对于含有来自载体pSB1_Ubi1::dao1A-ocs_Ubi1::DsRed2-nos的T-DNA的转基因小麦而言，用经限制性酶SpeI消化过的基因组DNA制备出印迹，所述酶在T-DNA区域内切割一次。首先对印迹探查是否存在DsRed2，随后探查是否存在dao1。DsRed2探针是利用引物CTG TCC CCC CAG TTC CAGTA(SEQ ID NO80)和CGATGG TGTAGT CCT CGT TGT G(SEQ ID NO81)从pSB1_Ubi1::dao1A-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR扩增到的450bp长的产物；dao1探针是利用引物ACATCACGC CAAATTACC GC(SEQ ID NO84)和GCC CCA ACT CTG CTG GTA TC(SEQ ID NO85)从pSB1_Ubi1::dao1A-ocs_Ubi1::DsRed2-nos PCR扩增产生的700bp长的产物。
主要依据产品说明书，用Megaprime DNA标记试剂盒(AmershamInternational Inc，UK)产生α-32P dCTP来放射性标记上述的探针。将印迹在由0.5M磷酸钠缓冲液(pH7.5)、7％(w/v)SDS和1mM EDTA(pH7.5)组成的预杂交缓冲液中预杂交最少4个小时。在40rpm的旋转分子杂交仪内，用由0.5M磷酸钠缓冲液(pH7.5)、7％(w/v)SDS和1mM EDTA(pH7.5)组成的新鲜杂交缓冲液按每平方厘米膜约1ml杂交缓冲液的比例在65℃下实施与α-32P dCTP标记探针的杂交共16到24个小时。用下面的溶液依次洗涤Southern杂交印迹50ml洗涤溶液#165℃下洗涤30分钟共3次；洗涤溶液#265℃下洗涤30分钟共2次。洗涤溶液#1包括40mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、5％SDS和1mM EDTA(pH7.5)以及洗涤溶液#2包括40mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、1％SDS和1mM EDTA(pH7.5)。从杂交瓶中取出膜，并将其置入到Whatman纸上，以便去除过多的洗涤溶液，用塑料密封膜包好，并将其暴露于磷显像荧光屏或者置于x射线膜上。
对土壤杆菌介导转化的Southern杂交分析通常发现低的整合拷贝数(1到超过6个拷贝)以及高比例的单个拷贝事件。从利用pCAMBIA1305.2和限制性酶EcoR1的Southern分析鉴定到的片段大小通常是在2到30Kb之间。
小麦植物中转基因的分离遵循着转基因基因座的正常的孟德尔遗传规律。对于单一基因座和两个基因座事件而言，预计分离率分别是3:1和15:1。通过转基因种子在选择剂中的萌芽可以观察到转基因基因组在T1和T2子代种子中的分离。例如，在大于5mM D-丝氨酸中的萌芽容许区分出转基因的和未转基因的pSB1_Ubi1::dao1-ocs_Ubi1::DsRed2-nos植物。
实施例7不同类小麦基因型的转化 为了确定出本发明的方法用于转化小麦成熟胚的普遍可应用性，用基本上同实施例1所述的方法转化从多种小麦基因型(表8)的干籽粒中新鲜分离到的小麦成熟胚。
在接种后3天，基本上如实施例1所述的方法确定出gusA表达。如图5和6所示，转化方法能够转化所有在本研究中测试的变体，说明本发明的普遍可应用性。
表8用于土壤杆菌介导的转化的小麦基因型 实施例8各种小麦基因型的植物再生 为了确定出本发明方法用于产生转基因植物的普遍可应用性，对冲实施例4的小麦品种的干籽粒中新鲜分离到的成熟胚进行利用基本上如实施例1所述方法的土壤杆菌介导转化以及利用基本上如实施例2到4所述方法的再生。
图7和8显示了不同类小麦基因组的再生频率的变异性。
实施例9SoytoneTM对转化效率的影响 土壤杆菌培养基中的蛋白胨增加了与纤维素生物合成相关基因的表达(Matthysse et al，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，101986-991，2004)。为了测试是否蛋白胨有助于土壤杆菌介导的转化，实施了在实施例1中所述的转化方法，但是，接种和共培养培养基中的SoytoneTM浓度是不同的。
基本上如实施例1所述，通过计算出接种3天后每个外植体的平均gusA表达灶数目可以确定出转化效率。如图9所示，甚至在没有SoytoneTM时，转化方法也能产生转基因小麦植物。但是，SoytoneTM的存在(例如0.2％或0.4％(w/v))显著地增加了每个外植体的平均gusA表达灶数目。这些浓度几乎使得每个外植体的平均gusA表达灶数目加倍。
实施例10影响表达效率的因素 为了确定出转化的最佳条件，修饰了实施例1所述的方法来测试各种条件。例如，测试了培养基中不同浓度的营养物、胚是否存在种皮、有或无SoytoneTM和/或特殊的糖的影响。具体的，测定了以下条件的影响 ●1:20稀释的Murashige和Skoog培养基； ●1:10稀释的Murashige和Skoog培养基； ●1:2稀释的Murashige和Skoog培养基，以及去除了胚的种皮； ●加入SoytoneTM以及去除种皮； ●加入2％山梨糖醇； ●加入2％麦芽糖； ●加入2％葡萄糖；和 ●加入2％蔗糖。
基本上如实施例1所述，通过计算出接种3天后表达gusA灶的外植体的平均比例可以确定出转化效率。
如图10所示，测试的所有条件都造成了小麦细胞的转化，说明转化方法的稳健性能。图10也显示出了最佳的转化条件包括加入SoytoneTM和种皮去除。
实施例11PPT抗性转基因小麦植物 11.1 载体pBPS0054及向小麦胚内的转化 载体pBPS0054是基于在Hajdukiewicz et al，Plant Mol Biol.25989-94，1994中所述的载体pPZP200。但是，该载体被修饰成包括在组成型玉米遍在蛋白启动子控制下的PPT抗性的bar基因。图7显示了pBPS0054的载体图谱。
表8显示了用实施例1所示的方法经pBPS0054转化的小麦品种。
11.2 转基因小麦植物的再生 在共培养以及随后的洗涤之后，将外植体放置在如实施例1所示的愈伤组织诱导培养基上，没有进行选择，但是所述培养基具有控制土壤杆菌生长的抗生素(头孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)。容许成熟胚外植体在暗处3周产生愈伤组织。将显示出愈伤组织的外植体转移到加有抗生素的新鲜培养基中进行亚培养。在亚培养期间，去除非胚产生性愈伤组织，留下上胚层以及盾片组织的应答区。
在至少3周的愈伤组织诱导之后，将胚产生性愈伤组织转移到由1xMurashige和Skoog(同上)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L玉米素和0.8％(w/v)Bacto琼脂以及控制土壤杆菌生长的抗生素(例如头孢噻肟250mg/L或特美汀150mg/L)组成的再生培养基中。将外植体在亮处再培养2周，然后将其转移到加有2.5-10mg/L L-2-氨基-4(羟基)(甲基)氧膦基丁酸(phosphinothricin)和抗生素的新鲜再生培养基中。通过被转移到加有化学选择剂的新鲜再生培养基中的推测转基因小植物/愈伤组织进行1到2个2到3周到亚培养周期来传代再生组织。
再过10天之后，将再生小植物转移到加有用于启动生根的1mg/L NAA的MS[1/2]中。将任何在生根培养基中存活超过3周以及具有健康生根的再生小植物栽培到由泥炭和沙土(1:1)组成的苗圃混合物中，并维持于22℃到24℃以及苗圃湿度箱系统的高湿度下。在2周之后，从湿度箱中取出植物，手工浇水以及给予液体AquasolTM直到成熟。给T0植物取样进行基因组DNA和分子分析，并收集成熟的T1种子。
11.3 确定PPT抗性 对于所产生的每个植物系，选出来自不同分蘖的三片健康的看起来等大的叶子，进行叶子涂抹。用棉签施用BASTA杀虫剂(Bayer Crop Sciences)形式的PPT(0.2g/L和2g/L)以及湿化剂Tween-20(0.1％)，涂抹所选叶子远端半部的上表面(7-10cm)，单独的Tween-20(0.1％)作为对照。在7天后，根据在经杀虫剂溶液涂抹表面上的坏死比例确定出PTT抗性。
11.4 PCR分析植物以检测出bar基因的存在 根据产品说明书用Qiagen Mini植物DNA提取试剂盒分离出基因组DNA。在PCR之前，用纳米滴分光光度仪测定出DNA的量。
PCR的引物序列是wknox4D5′-CAA CAG GAG AGC CAG AAG GT-3′和5′-AGG TCA CCG GTAACG GTAAG-3′。该引物作为扩增250bp Knotted14D等位基因的阳性PCR内对照；bar5′-GTC TGC ACC ATC GTC AAC C-3′(SEQ ID NO63)和5′-GAA GTC CAG CTG CCA GAAAC-3′(SEQ ID NO64)。
利用标准的技术循环PCR反应，检测bar基因的反应的退火时间为57℃。每个PCR分析要重复至少两次。
对反应物进行琼脂糖凝胶电泳分析，出现444bp扩增产物是测试样品中存在转基因的指示。
实施例12用于植物转化的Ti载体 用标准技术进行DNA和RNA加工处理。酵母R.gracilis生长在含有30mM D-丙氨酸的液体培养基中，以诱导dao1(编码DAAO的基因)。从酵母中提取出总RNA，用于cDNA合成。通过PCR用PCR引物5′-ATTAGATCTTACTACTCGAAGGACGCCATG-3′(SEQ ID NO64)和5′-ATTAGATCTACAGCCACAATTCCCGCCCTA-3′(SEQ ID NO65)从cDNA模板中扩增出dao1基因。将PCR片段亚克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)内，随后将其用于取代pPZP200ubi::bar-nos_R4R3中的bar抗性基因，以产生pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3。测序分析载体，以检查它们是否含有正确的结构。
利用包括序列attB1-ATGGCCTCCTCCGAGGAC(SEQ ID NO66)和attB2-GCCACCATCTGTTCCTTTAG(SEQ ID NO67)的引物以及从Clontech获得的作为模板的pdsRED载体PCR扩增出编码dsRED的核酸。将PCR片段重组到pDONOR221载体(Invitrogen)内，产生pDONOR/dsRED输入克隆。
利用包括序列attB4-ATCGACTAGTCCCATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC(SEQ ID NO68)和attB1-ATCGGCGGCCGCCCCATCCTCGGCGCTCAGCCATCTTCTACC(SEQ ID NO69)的引物PCR扩增出包括2175bp稻的5’未翻译启动子序列act1D(act1D)的核酸。将PCR片段重组到pDONORP4-P1R载体(Invitrogen)内，产生pDONOR/act1D输入克隆。此外，利用包括序列attB2-ATCGCCACCGCGGTGGAGTCCGCAAAAATCACCAGTCTC(SEQIDNO70)和attB3-ATCGCCACCGCGGTGGaGGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG(SEQID NO71)的引物PCR扩增出包括CaMV35s多腺苷化信号的核酸。将PCR片段重组到pDONORP2R-P3载体(Invitrogen)内，产生pDONOR/35ST输入克隆。
将输入克隆pDONOR/act1D、pDONOR/dsRED、pDONOR/35ST都重组到目的载体pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3内，产生载体pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::dsRED-35ST。测序分析载体，以确认其是否含有正确的结构。
基本上如实施例1所示，将pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::dsRED-35表达载体转化到植物胚内。然后利用安装在倒置显微镜(Axiovert 100)上的Zeiss(Jena，Germany)LSM 510 CLSM分析转化胚切片的dsRED表达情况。激发光是由488nmAr激光提供，并受acousto optical tuneable滤光器的控制。为了分开激发光和发射光，使用了两个二色分光镜。用HFT488二色分光镜反射激发光并传递荧光发射。用镜子将发射的荧光反射到NFT545第二个分光镜上。经NFT545分光镜传递的荧光经565到590nm带通滤光器过滤，形成了红色通道。用Zeiss plan-neofluar 40x(N.A.1.3)油镜进行扫描。
然后选出那些dsRED表达阳性的胚切片，进行基本上如实施例2到3中任一所述的植物再生。胚和愈伤组织在包括5mM D-丙氨酸和5mM D-丝氨酸的生长培养基中生长。用D-丙氨酸和D-丝氨酸选择转基因植物。
实施例13具有改良面包制作表征的转基因小麦 13.1 具有增强HMW-GS 1Ax1表达的小麦 质粒pHMW1Ax1含有小麦的HMW-GS1Ax1基因，所述基因的表达是受其自身的胚乳特异性启动子驱动的(Halford et al，Theoret.Appl Genet.53373-378，1992)。从pHMW1Ax1中切下HMW-GS1Ax1基因，并将其克隆到pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::dsRED-35内，取代dsRED。产生载体pPZP200ubi::dao1-nos_HMW-35。
然后将载体pPZP200ubi::dao1-nos_HMW-35转化到不同基因型的小麦胚内。然后用基本上如实施例2到4中所述的任一方法再生出转基因小麦植物。T0植物生长到成熟，并自我受精产生T1植物。然后收集T0和T1植物的种子。
13.2 蛋白分析 通过用研钵和研杵单个地碾碎成熟干种子制备出蛋白提取物。用200μl样品缓冲液(2％SDS、5％β-巯基乙醇、0.001％派罗宁Y、10％甘油、0.063M Tris HCl，pH6.8)涡旋10到14mg每个种子产生的粉末，并在旋转摇晃器(250rpm)中温育2个小时。离心提取物(10分钟，14,000rpm)，煮沸上清液5分钟，以变性蛋白。用SDS-PAGE分离蛋白(基本上同Laemmli，Nature 227680-685，1970)。简单的，将20到30μl每个样品加样到13cm含有10％(w/v)丙烯酰胺、0.8％(w/v)双丙烯酰胺的凝胶内，跑胶，直到染料前端已经达到了凝胶底部，使得总提取蛋白仍保留在凝胶上。从HMW-GS停留处解离出1Ax1带，其中两者不能完全彼此分开。首先将凝胶在没有染料的染色溶液中固定0.5到1个小时，然后在考马斯亮蓝R-250中染色4到6个小时(基本上同Neuhoff et al，Electrophoresis 9255-262，1988)。通过在5％甲醇和7％乙酸(体积/体积)的水溶液中脱色到获得清晰的背景可以显露出蛋白条带。将凝胶储存在7％乙酸水溶液(体积/体积)中。用数字显像系统例如Alpha Innotech(San Leandro，CA)IS-1000数字显像系统扫描染色凝胶。通过带间背景消减校正电泳道和峰值。从近140kDa的每个HMW-GS1Ax1带的顶部确定出每个电泳道的背景强度。计算出相对于校正的电泳道值或校正的HMW-GS值的HMW-GS1Ax1的量。为了计算出总HMW-GS水平，将每个电泳道的蛋白含量标准化。
13.3 Southern分析 通过CTAB方法从能够在D-丝氨酸和D-丙氨酸中生长的植物叶子中分离出基因组DNA(基本上同Lassner et al，Plant Molec.Biol.Rep.7116-128，1989所述)。用XbaI消化纯化DNA(20到25μg)，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，并印迹到Hybond-N膜(Amersham)上。杂交探针包括来自源于pHMW1Ax1的EcoRI和HindIII消化后的HMW-GS1Ax1基因编码区的2.2kb片段。用随机引物标记试剂盒(GIBCO-BRL)标记探针。在65℃实施杂交24个小时，用放射自显像术显示出信号。
13.4 分离分析 为了确定出转基因DAAO在T1代中的分离率，将每个转基因系的20个胚在加有D-丙氨酸和D-丝氨酸的培养基中萌芽半浓度MS盐和维生素(同上)以及15g/L蔗糖、2.5g/L Gelrite、5mM D-丙氨酸、5mM D-丝氨酸，pH5.8(B3培养基)。通过在B3培养基上测试所有HMW-GS1Ax1蓄积系的最多到12株T1植物的20个胚的萌芽率来鉴定出T2种子中DAAO纯合子的系。用SDS-PAGE单个地分析每种纯合子DAAO系的10个种子中的HMW-GS1Ax1，以便确定出是否发生了共分离。
实施例14表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的小麦 14.1 表达HBsAg的小麦 利用含有attB1和attB2的引物从质粒pWR/HBs-3中PCR扩增出HBsAgDNA编码序列(Cattaneo，Nature 305336-338，1983)。将该片段重组到pDONOR221内，产生输入克隆pDONOR/HBsAg。然后将该片段以及输入克隆pDONOR/act1D和pDONOR/35ST都重组到目的载体pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3内，产生pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::HbsAg-35ST。
14.2 pCAMBIAdao1/dsRED-HBsAg向根瘤土壤杆菌的转移 将质粒pCAMBIAdao1/dsRED-HBsAg转移到从Clontech Laboratories，Inc获得的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404。
将根瘤土壤杆菌培养在AB培养基中(An，Meth.Enzymol.153292-305，1987)，知道培养物的600纳米处(600nm)的光密度(O.D.)达到约0.5。然后在2000g离心细胞，获得细菌细胞沉淀。将土壤杆菌沉淀重悬于1ml冰冷的20mM CaCl2中。将质粒(0.5μg)加入到1.5ml微离心管的0.2ml根瘤土壤杆菌的氯化钙悬浮液中，并在冰上孵育60分钟。将质粒和根瘤土壤杆菌细胞混合物在液氮中冷冻1分钟，在25℃水箱中融化，然后与5倍体积的富MGL培养基(An，同上)混合。然后轻微摇晃下在25℃温育质粒和根瘤土壤杆菌混合物4个小时。将混合物在含有100μg/ml壮观霉素的Luria肉汤琼脂培养基上铺板。在选择所形成的含有带质粒的转化土壤杆菌的克隆之前，将培养板在25℃温育3天。
14.3 小麦的转化 利用基本上如实施例1所述的方法将pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::HBsAg-35ST载体转化到各种小麦基因型的小麦胚内。然后用基本上如实施例2到4中的任一方法再生出转基因小麦植物。T0植物生长到成熟，并自我受精产生T1植物。然后收集T0和T1植物的种子。
14.4 生物化学检测和免疫化学检测 收集植物的根、茎、叶和种子样品。将每种组织都在含1.0mM EDTA和作为蛋白酶抑制剂的0.5mM PMSF的100mM磷酸钠(pH7.4)中匀浆化。在5000xg下离心匀浆液10分钟。然后将每种上清液的一小部分用于Lowry法的蛋白浓度测定。剩下的上清液用于利用两种标准检测法的HBsAg表达水平的测定(a)HBsAg放射免疫检测法，试剂购自Abbott实验室和(b)利用先前所述的Peng和Lam的方法(Vis.Neurosci.6357，1991)以及购自Zymed实验室的抗HBsAg的单克隆抗体进行的免疫印迹法。
实施例15具有抗小麦线条花叶病毒(WSMV)抗性的转基因小麦 15.1 稳定表达WSMV外壳蛋白的小麦 对质粒pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3进行遗传加工，引入编码WSMV外壳蛋白的核酸(SEQ ID NO48)。所形成的质粒称作pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::WSMV-35ST。
利用基本上如实施例1所述的方法将pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::WSMV-35ST载体转化到各种小麦基因型的小麦胚内。然后用基本上如实施例2到4中的任一方法再生出转基因小麦植物。T0植物生长到成熟，并自我受精产生T1植物。然后收集T0和T1植物的种子。
15.2 确定WSMV抗性的检测法 从转基因小麦植物和野生型(未转化)小麦植物中分离出种子。用包括WSMV的溶液机械地接种种子。然后种植被接种的种子，野生型和转基因的幼苗都生长在培育箱中。
在足够长的容许叶形成的生长之后，观察叶子上的WSMV感染的肉眼症状，例如叶子发黄、叶子变形和/或缩叶。
只要野生型植物发生了WSMV感染的症状并显示出了WSMV包被基因的表达，就可以推定那些没有显示出这些症状的转基因植物是抗这种病原体感染的。
实施例16抗小麦赤霉病(head scab)小麦 16.1 稳定表达奇甜蛋白样基因的小麦的产生 修饰pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3以便将奇甜蛋白样基因(SEQ ID NO50)以及act1D启动子和35S多腺苷酸化信号都克隆到R4R3框内。基本上如Kuwabara et al.，Physiol.Plantarum 115101-110，2002所述的获得奇甜蛋白样蛋白。奇甜蛋白样蛋白是应激应答蛋白，其在治疗植物病原体方面是特别有效的，因为它们能够抑制这种病原体感染植物。
所形成的质粒称作pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::TL1-35ST。
利用基本上如实施例1所述的方法将pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::TL1-35ST载体转化到各种小麦基因型的小麦胚内。然后用基本上如实施例2到4中的任一方法再生出转基因小麦植物。T0植物生长到成熟，并自我受精产生T1植物。然后收集T0和T1植物的种子。
16.2 小麦赤霉病抗性的检测法 在被用于生物检测之前，将转化小麦的幼苗生长在经蒸气消毒(60℃30分钟)的培育箱的盆栽混合物中(Terra-lite Rediearth，W.R.Grace，Cambridge，Mass.)，25℃、14h光照/天共生长约8周。在澄清的V-8液体琼脂糖上、25℃下、12h光照/天共7天产生禾谷镰刀菌分离株Z3639的分生孢子接种物，同时通过接种板并在25℃温育48个小时在TSA/5上产生每种微生物菌株的生物量。用禾谷镰刀菌3639的分生孢子接种每个微生物菌株两个小麦穗的中花(middle floret)。将接种的小麦植物放在温室架上的透明塑料套内72个小时，以促进高的相对湿度。然后在接种后16天，去除塑料套，并计数出观察到镰刀菌的穗枯萎症状的小麦穗。那些没有显示出镰刀菌穗枯萎征象的小麦被认为是表达了赋予抗赤霉病保护性的蛋白。
16.2 赤霉病抗性的温室检测法 如上所述，将转化和野生型幼苗每盆两株生长在经巴斯德消毒过的盆栽混合物中共8周。如上所述的在CV-8琼脂糖上产生禾谷镰刀菌分离株Z3639、DOAM和Fg-9-96的分生孢子。8周后，将小麦植物转移到温室架上约1周。在小麦穗开始开花时(一般在温室架上1周结束时)，开始生物控制的生物检测。用禾谷镰刀菌接种小麦穗的中花。将接种的小麦植物放在温室架上的透明塑料套内72个小时，以促进最佳地镰刀菌穗枯萎发生所必需的高相对湿度和游离水分。然后在接种后16天，去除塑料套，并根据0到100％分级的小麦穗量表(Stack et al，North Dakota State UniversityExtension Service Bulletin PP-1095，1995)以及0到100％疾病发生率量表计数出小麦穗的严重度。在穗成熟后测定出粒的重量。健康穗中完全发育的粒具有高100粒重，而受禾谷镰刀菌感染的穗中枯萎粒具有更低的100粒重。从显示出疾病发生症状的随机挑选的穗中回收到了禾谷镰刀菌。
实施例17耐旱小麦 17.1 稳定表达DREB1A的小麦 修饰pPZP200ubi::dao1-nos_R4R3以便将DREB1A cDNA(SEQ ID NO58)以及act1D启动子和35S多腺苷酸化信号都克隆到重组盒内。基本上如Wang et al，Plant MoI Biol.28605-617，1995所述的获得DREB1A cDNA。DREB1A是当植物暴露于干旱时表达的晚期胚产生富裕(LEA)蛋白。
也用rd29A启动子取代pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::DREB1A-35ST中的act1D启动子，因为组成型启动子控制下的表达已经显示其造成了植物在正常环境下的严重生长迟缓(Kasuga et al，Nature Biotechnology 17287-291，1999)。
所形成的蛋白称作pPZP200 ubi::dao1-nos_rd29a::DREB1A-35ST。
利用基本上如实施例1所述的方法将pPZP200ubi::dao1-nos_rd29a::DREB1A-35ST载体转化到各种小麦基因型的小麦胚内。然后用基本上如实施例2到4中的任一方法再生出转基因小麦植物。T0植物生长到成熟，并自我受精产生T1植物。然后收集T0和T1植物的种子。
17.2 转基因植物对冷冻、干旱和高盐度应激的耐受性 将植物种植在填满1:1珍珠岩和金精石混合物的9cm盆中。植物在22℃近2500勒克斯的连续光照下生长。将3周大植物的不同样品暴露于冷冻和干旱应激。
通过将植物暴露于-6℃温度2天，然后恢复到22℃5天来产生冷冻应激。
通过停止浇水2周来产生干旱应激。
通过将生长在琼脂糖板上并且轻轻地从生长培养基中拔出的植物浸泡在600mM NaCl溶液中2个小时来产生高盐度应激。
然后将植物转移到在正常生长条件下的盆中3周。
然后确定出相对于对照(未转化植物)的存活并连续生长的植物数目。用卡方检验确定出数值的统计学显著性。
实施例18具有降低水平Waxy的植物 18.1 稳定表达siRNA以抑制颗粒结合性淀粉合酶I表达的小麦 修饰pPZP200ubi::dao1-nos_act1D-rfa-RGA2-rfa(as)-35ST(图24)以便将编码源自小麦颗粒结合性淀粉合酶(SEQ ID NO60)的siRNA的核酸克隆到act1D启动子和35S多腺苷化信号之间的重组盒内。所形成的载体称作pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::waxy-35ST。
利用基本上如实施例1所述的方法将pPZP200ubi::dao1-nos_act1D::waxy-35ST载体转化到各种小麦基因型的小麦胚内。然后用基本上如实施例2到4中的任一方法再生出转基因小麦植物。T0植物生长到成熟，并自我受精产生T1植物。然后收集T0和T1植物的种子。
18.2 小麦种子中的GBSSI的表达 确定出小麦种子中的GBSSI mRNA的表达水平。将组织在液氮中冷冻，并磨碎成细粉末，然后用polytron匀浆器将其匀浆化。12000xg离心10分钟去除不可溶的物质，然后用氯仿提取上清液，并用异丙醇沉淀。基本上根据产品的说明书用Trizol试剂(Life Technologies/Gibco-BRL，Cleveland)提取出RNA。
将总RNA样品进行热变性，然后用含有2.2M甲醛的1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳将其分离，并通过毛细管转移将其转移到GeneScreen Plus膜(NEN Research Products，Boston)。在含有50％(v/v)甲醛、0.2％(w/v)聚乙烯吡咯酮、0.2％(w/v)Ficoll、0.2％(w/v)牛血清白蛋白、50mM Tris(pH7.5)、1.0M NaCl、0.1％焦磷酸钠、1％(w/v)SDS、10％(w/v)硫酸葡聚糖、和100μg/mL变性鲑精DNA的缓冲液中42℃预杂交印迹，然后在含32P标记探针的相同缓冲液中再杂交1天。在2x SSC和1％(w/v)SDS、65℃洗涤膜30分钟两次，在0.1x SSC、65℃洗涤膜10分钟一次，或者洗涤直到背景放射性已经降低到了接近0。
18.3 转基因小麦种子中的直链淀粉含量 用如下的量热法和电流滴定法测定出直链淀粉含量 (1)依照Kuroda等的方法实施基于碘显色的量热法(Jpn.J.Breed.39(Suppl，2)142-143，1989)。将35mg淀粉在5ml0.75N NaOH和25％水样乙醇中凝胶化，并用乙酸中和。用比色计测定出淀粉碘复合物在600nm处的吸光度。用两种已知淀粉含量的小麦淀粉作为对照。第一个对照小麦淀粉购自Wako Pure Chemicals Ltd，含有31％直链淀粉(通过自动分析仪利用马铃薯直链淀粉和支链淀粉作为标准物测定出的含量)，第二个对照蜡质小麦淀粉含有约0.6％直链淀粉。
(2)利用脱脂淀粉以及碘电流滴定设备(例如Model 3-05，MitamuraRiken Kogyo，Japan)实施电流滴定法(Fukuba and Kainuma，in Starch ScienceHandbook(Nakamura M.and Suzuki S.编)TokyoAsakura Shoten，pp174-179，1977)。通过假定20mg碘可以结合100mg纯小麦直链淀粉计算出淀粉的含量。利用酚-硫酸法(例如基本上如Dubois et al，Anal.Chem.28350-356，1956所述)以及葡萄糖作为标准物确定出所用溶液的淀粉浓度。
实施例19大麦的土壤杆菌介导转化(大麦) 将来自大麦(例如品种Golden Promise)的籽粒在0.8％(v/v)NaOCl溶液中表面消毒30分钟，并在无菌蒸馏水中洗涤至少4次。
从经表面消毒的籽粒中切下成熟胚，去除种皮，将其直接用于土壤杆菌介导的转化。图11A-E显示了从干大麦籽粒中分离出具有完整上胚层和盾片的胚的过程。
外植体被直接用于土壤杆菌介导的转化。在50mL Falcon管中，用包括pCAMB1A1305.2载体(在CaMV35s启动子的控制下表达GUS报告子基因)的土壤杆菌菌株EHA105接种10到15ml加有100μg/mL利福平和卡那霉素的LB，在27到28℃下温育24到48个小时。对于接种而言，用100μl土壤杆菌培养物接种25mL加有卡那霉素的新鲜LB，并温育24个小时。在室温下，将该完全浓度的接种物在3000rpm离心10分钟，所形成的沉淀重悬于液体接种培养基(MS[1/10])中，使得OD600＝0.25-0.8。该接种培养基是由1/10浓度的液体Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol Plant，15473-497，1962)基本盐(MS[1/10])以及2mg/L2，4-D、200μM乙酰丁香酮和0.02％(w/v)SoytoneTM组成。
轻微搅拌下，将土壤杆菌感染在室温下标准化3个小时。随后，在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、以及200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto琼脂组成的培养基中21℃、暗处共培养3天，其中胚轴优选地朝下。
任选地用没有乙酰丁香酮或SoytoneTM但加有250mg/L头孢噻肟的液体MS[1/10]充分地洗涤外植体。或者，用加有250mg/L头孢噻肟的无菌水洗涤外植体，直到不再看到土壤杆菌残留的征象(即洗涤溶液在洗涤后仍是清亮的)。
利用组织化学GUS检测法(Jefferson Plant Mol.Biol.Rep.5387-4051987)确定出含150mg/L特美汀的诱导培养基上的3天后(或其他时间点)取样的外植体上的一过性gusA的表达。将外植体在含1mM X-Gluc、100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾和0.1％(v/v)Triton X-100的缓冲液中、37℃下温育过夜。在显微镜下计数出蓝色gusA表达灶，通过计数至少有一个gusA表达灶的外植体以及计数出每个胚的表达灶数目可以评价T-DNA转运。为了检测稳定的gusA表达愈伤组织，将来自再生小植物的苗和叶片段都在37℃下培育过夜，如果需要在25℃下再培育1到2天。如图11F所示，在接种3天后的转化胚中可以检测到gusA的表达。
实施例20愈伤组织诱导和转基因大麦植物的再生 为了确定出本发明方法用于转化大麦的普遍可应用性，利用基本上如实施例2到4中的任一方法分别再生如实施例19所述的来自大麦品种GoldenPromise的干籽粒的转化胚。
图12显示了源自对源自干籽粒的成熟胚的土壤杆菌介导转化的大麦植物的再生。
实施例21成熟稻(稻)的土壤杆菌介导转化 将来自稻(例如Jarrah a Japonica型)的籽粒在0.8％(v/v)NaOCl溶液中表面消毒30分钟，并在无菌蒸馏水中洗涤至少4次。
从经表面消毒的籽粒中切下成熟胚，去除种皮，将其直接用于土壤杆菌介导的转化。图13A-F显示了从稻小麦籽粒中分离出具有完整上胚层和盾片的胚的过程。
外植体被直接用于土壤杆菌介导的转化。在50mL Falcon管中，用包括pCAMB1A1305.2载体(在CaMV35s启动子的控制下表达GUS报告子基因)的土壤杆菌菌株EHA105接种10到15ml加有100μg/mL利福平和卡那霉素的LB，在27到28℃下温育LB24到48个小时。对于接种而言，用100μl土壤杆菌培养物接种25mL加有卡那霉素的新鲜LB，并温育24个小时。在室温下，将该完全浓度的接种物在3000rpm离心10分钟，所形成的沉淀重悬于液体接种培养基(MS[1/10])中，使得OD600＝0.25-0.8。该接种培养基是由1/10浓度的液体Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol Plant，15473-497，1962)基本盐(MS[1/10])以及2mg/L2，4-D、200μM乙酰丁香酮和0.02％(w/v)SoytoneTM组成。
轻微搅拌下，将土壤杆菌感染在室温下标准化3个小时。随后，在由1x Murashige和Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant，15473-497，1962)大量营养剂、1x微量营养剂和有机维生素、以及200mg/L酪蛋白水解物、100mg/L肌醇、3％(w/v)蔗糖、2mg/L2，4-D以及200μM乙酰丁香酮和0.8％-2.0％(w/v)Bacto琼脂组成的培养基中21℃、暗处共培养3天，其中胚轴优选地朝下。
任选地用没有乙酰丁香酮或SoytoneTM但加有250mg/L头孢噻肟的液体MS[1/10]充分地洗涤外植体。或者，用加有250mg/L头孢噻肟的无菌水洗涤外植体，直到不再看到土壤杆菌残留的征象(即洗涤溶液在洗涤后仍是清亮的)。
利用组织化学GUS检测法(Jefferson Plant Mol.Biol.Rep.5387-4051987)确定出含150mg/L特美汀的诱导培养基上的3天后(或其他时间点)取样的外植体上的一过性gusA的表达。将外植体在含1mM X-Gluc、100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾和0.1％(v/v)Triton X-100的缓冲液中、37℃下培育过夜。在显微镜下计数出蓝色gusA表达灶，通过计数至少有一个gusA表达灶的外植体以及计数出每个胚的表达灶数目可以评价T-DNA转运。为了检测稳定的gusA表达愈伤组织，将来自再生小植物的苗和叶片段都在37℃下培育过夜，如果需要再在25℃下培育1到2天。如图13F所示，在接种3天后的转化胚中可以检测到gusA的表达。
实施例22玉米(玉蜀黍)的土壤杆菌介导转化 用共合体二元载体LM227(pSB1_Ubi1::DsdA-ocs_ScBV::DsRed2-nos)转化土壤杆菌EHA105，并在应用之前将其在液体感染培养基中预诱导约3个小时，接种前的OD600约为1.0。
将玉米粒浸泡在Domestos(次氯酸钠49.9g/l(氯含量为4.75％m/v)、氢氧化钠12.0g/l、碱性盐0.5g/l)中，并在摇晃器(150rpm)上温育30到45分钟。用无菌水洗涤粒4次，并在第4次浸泡之后将其放置到Petri皿上，容许其软化>3个小时。
通过用镊子夹住单个玉米粒并将胚的两侧切出两个半月形，分离出成熟胚(见图14A-D)。将切下的胚对切，并放入到感染培养基(1/10MS盐、3％(w/v)蔗糖、200μM乙酰丁香酮、0.04％(w/v)SoytoneTM、2mg/L2，4-D、pH5.7)上，直到分离出所有的外植体。去除感染培养基，并用约5mL土壤杆菌悬浮液(用60x15mm板)取代感染培养基。在27mmHg下真空过滤切下的胚5分钟。将感染板在50rpm摇晃器上温育2个小时。在接种之后，去除土壤杆菌悬浮液，并将外植体转移到共培养培养基(1/10MS盐、3％(w/v)麦芽糖、200μM乙酰丁香酮、2mg/L2，4-D、8g/L琼脂糖固化，pH5.7)上，切面朝向培养基。将外植体在21℃共培养3天，然后转移到回收培养基(MS盐、肌醇0.1g/l、盐酸硫胺素20mg/L、酪蛋白水解物1mg/L、脯氨酸0.69g/l、MES1.95g/L、麦芽糖30g/L、8g/L琼脂糖固化、pH5.7)中7天。在7天后，将胚产生性培养物在加有5mM D-丝氨酸的回收培养基中进行亚培养。
利用装有DsRed2滤光器的Leica立体显微镜确定出回收培养基上3天或4天(或其他指定的时间)取样的外植体上的一过性DsRed2表达。如图14E和F所示，玉米组织表达了DsRed2。
序列表
<110>分子作物育种代理有限公司
<120>产生转基因禾本科细胞和植物的方法
<130>131242
<150>US 60/757,994
<151>2006-01-11
<150>AU 2006900826
<151>2006-02-20
<160>85
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>418
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>T-DNA Left Border sequence
<400>1
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<213>artificial sequence
<220>
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<220>
<223>Culiflower mosaic virus 35s promoter
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<220>
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<220>
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<213>Streptomyces hygroscopicus
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<220>
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<212>DNA
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<220>
<223>Hygromycin phosphotransferase
<220>
<221>CDS
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<220>
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<220>
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<220>
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<213>Salmonella typhimurium
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<212>PRT
<213>Streptomyces viridochromogenes
<400>19
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<212>DNA
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<223>Glycine max Cp4esps
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212>DNA
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<213>Escherichia coli
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<212>DNA
<213>Aspergillus fumigatus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(765)
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<212>PRT
<213>Aspergillus fumigatus
<400>27
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<211>1160
<212>DNA
<213>Rhodotorula gracilis
<220>
<221>CDS
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<212>PRT
<213>Rhodotorula gracilis
<400>29
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<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1947)
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<212>PRT
<213>Mus musculus
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<212>DNA
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<223>Luciferase
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
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<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>Synthetic Construct
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<212>DNA
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<220>
<223>Mutant discosoma red fluorescent protein
<220>
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<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>Synthetic Construct
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<212>DNA
<213>Aequorea coerulescens
<220>
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<213>Aequorea coerulescens
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<212>DNA
<213>Triticum aestivum
<220>
<221>CDS
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<212>PRT
<213>Triticum aestivum
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<212>DNA
<213>Aspergillus niger
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1404)
<400>42
<210>43
<211>467
<212>PRT
<213>Aspergillus niger
<400>43
<210>44
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<212>DNA
<213>Hepatitis B virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1203)
<400>44
<210>45
<211>400
<212>PRT
<213>Hepatitis B virus
<400>45
<210>46
<211>336
<212>DNA
<213>Bacillus amyloliquefaciens
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>46
<210>47
<211>111
<212>PRT
<213>Bacillus amyloliquefaciens
<400>47
<210>48
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<212>DNA
<213>wheat streak mosaic virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(810)
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<212>PRT
<213>wheat streak mosaic virus
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<212>DNA
<213>triticum aestivum
<220>
<221>CDS
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<211>225
<212>PRT
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<400>51
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<212>DNA
<213>Triticum aestivum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1167)
<400>52
<210>53
<211>389
<212>PRT
<213>Triticum aestivum
<400>53
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<211>1356
<212>DNA
<213>Fusarium graminearum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1353)
<400>54
<210>55
<211>451
<212>PRT
<213>Fusarium graminearum
<400>55
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<211>1025
<212>DNA
<213>Hordeum vulgare
<220>
<221>CDS
<222>(120)..(761)
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<211>213
<212>PRT
<213>Hordeum vulgare
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<212>DNA
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<220>
<221>CDS
<222>(1)..(651)
<400>58
<210>59
<211>216
<212>PRT
<213>Arabidopsis thaliana
<400>59
<210>60
<211>1818
<212>DNA
<213>triticum aestivum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1818)
<400>60
<210>61
<211>605
<212>PRT
<213>triticum aestivum
<400>61
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>oligonucleotide for PCR amplification of Knotted 1 4D allele of
wheat
<400>62
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>oligonucleotide for PCR amplification of Knotted 1 4D allele of
wheat
<400>63
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplification of D-amino acid oxidase from R.
gracilis
<400>64
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplification of D-amino acid oxidase from R.
gracilis
<400>65
<210>66
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for PCR amplification of mutant discosoma red
fluorescent protein designated attB1
<400>66
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for PCR amplification of mutant discosoma red
fluorescent protein designated attB2
<400>67
<210>68
<211>37
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying 2175bp of5’untranslated promoter
sequence，actlD(actlD)from rice designated attB4
<400>68
<210>69
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying 2175bp of 5’untranslated promoter
sequence，actlD(act1D)from rice designated attB1
<400>69
<210>70
<211>39
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying CaMV35s polyadenylation signal
designated attB2
<400>70
<210>71
<211>40
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplifying CaMV35s polyadenylation signal
designated attB3
<400>71
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
<400>72
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
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<210>74
<211>27
<212>DNA
<213>artificia1 sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting hph gene by
Southern hybridization
<400>74
<210>75
<211>26
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting hph gene by
Southern hybridization
<400>75
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
<400>76
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting GusA gene by
Southern hybridization
<400>77
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting bar gene by
Southern hybridization
<400>78
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting bar gene by
Southern hybridization
<400>79
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<211>20
<212>DNA
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<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting DsRed2 gene by
Southern hybridization
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<210>81
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting DsRed2 gene by
Southern hybridization
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<212>DNA
<213>artificial sequence
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<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dsd A gene by
Southern hybridization
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<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dsd A gene by
Southern hybridization
<400>83
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dao 1 gene by
Southern hybridization
<400>84
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Oligonucleotide for amplyfying probe for detecting dao 1 gene by
Southern hybridization
<400>8权利要求
1.一种产生转基因禾本科植物细胞的方法，所述方法包括
(i)从成熟禾本科籽粒获得胚细胞；和
(ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入到胚细胞内的转移核酸，所述接触在足以使得所述细菌将所述转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下进行一段时间，
由此产生转基因禾本科植物细胞。
2.权利要求1的方法，包括从成熟籽粒获得胚细胞以及用包括核酸构建体的细菌接触胚细胞，而无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成。
3.权利要求1的方法，包括在不足以使得从所述胚细胞形成愈伤组织的条件下用所述细菌接触胚细胞一段时间。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其中在从成熟籽粒获得所述胚细胞的3天内，用所述细菌接触胚细胞。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中足以使得细菌将核酸构建体引入到胚细胞的细胞内的条件包括通过实施如下方法而用所述细菌接种胚细胞，所述方法包括在足以使得所述细菌结合或附着于所述胚细胞的条件下用细菌接触胚细胞一段时间。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其中足以使得细菌将核酸构建体引入到胚细胞的细胞内的条件包括通过实施如下方法而共培养胚细胞和细菌，所述方法包括在足以使得所述细菌将核酸构建体引入到胚细胞的细胞内的条件下维持胚细胞和细菌一段时间。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中足以使得细菌将核酸构建体引入到胚细胞的细胞内的条件包括在存在细菌氮源的情况下维持胚细胞和细菌。
8.权利要求7的方法，其中细菌氮源是植物或动物蛋白提取物的酶消化物或者是对植物或动物提取物进行部分水解产生的水溶性部分。
9.权利要求8的方法，其中细菌氮源来自大豆。
10.权利要求1到9中任一项的方法，还包括在用细菌接触所述组织之前从胚细胞去除种皮和/或糊粉。
11.权利要求1的方法，其中禾本科植物细胞是小麦细胞或大麦细胞或稻细胞或玉米细胞。
12.权利要求11的方法，其中禾本科植物细胞是小麦细胞，且成熟小麦籽粒具有以下一个或多个特征
(i)存在检测不到分裂的胚乳细胞；和/或
(ii)已经停止核内复制的胚乳细胞；和/或
(iii)具有低含水量胚乳的胚乳细胞。
13.权利要求12的方法，其中成熟小麦籽粒的龄期为开花期后至少30天。
14.权利要求11的方法，其中禾本科植物细胞是大麦细胞，且成熟小麦籽粒具有以下一个或多个特征
(i)存在检测不到分裂的胚乳细胞；和/或
(ii)具有低含水量胚乳的胚乳细胞；和/或
(iii)粒含水量不超过约40％。
15.权利要求14的方法，其中成熟大麦籽粒的龄期为开花期后至少30天。
16.权利要求11的方法，其中禾本科植物细胞是稻细胞，且成熟小麦籽粒具有以下一个或多个特征
(i)圆锥花序或籽粒的颜色为黄色；和/或
(ii)具有低含水量胚乳的胚乳细胞。
17.权利要求16的方法，其中成熟稻籽粒的龄期为开花期后至少25天。
18.权利要求11的方法，其中禾本科植物细胞是玉米细胞，且成熟小麦籽粒具有以下一个或多个特征
(i)存在检测不到分裂的胚乳细胞；和/或
(ii)在玉米籽粒或种子或粒内形成黑色细胞层；和/或
(iii)粒含水量不超过约35％。
19.权利要求18的方法，其中成熟玉米籽粒的龄期为开花期后至少35天。
20.权利要求1的方法，其中细菌是土壤杆菌(Agrobacterium)。
21.用于产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞的方法，所述方法包括
(i)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；
(ii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；和
(iii)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，
由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞。
22.用于产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞的方法，所述方法包括
(i)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；
(ii)从胚细胞去除种皮和/或糊粉；
(iii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；和
(iv)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，
由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞。
23.用于产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞的方法，所述方法包括
(i)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；
(ii)从胚细胞去除种皮和/或糊粉；
(iii)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述胚细胞的条件下接触胚细胞一段时间，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在存在蛋白胨的情况下实施所述接触，且其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；和
(iv)在足以使得所述土壤杆菌将转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，其中在存在蛋白胨的情况下实施所述维持，
由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞。
24.通过权利要求1到23中任一项的方法产生的转基因细胞。
25.用于在禾本科植物细胞内表达核酸的方法，所述方法包括
(i)产生包括与在小麦细胞中可操纵的启动子可操纵连接的转基因的转基因禾本科植物细胞，所述转基因小麦细胞是通过实施权利要求1到23中任一项的方法产生的；和
(ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因细胞一段时间。
26.用于调控禾本科植物细胞中的基因表达的方法，所述方法包括
(i)产生包括能够调控核酸表达的转基因的转基因禾本科植物细胞，所述转基因细胞是通过实施权利要求1到23中任一项的方法产生的；和
(ii)在足以使核酸表达被调控的条件下维持所述转基因细胞一段时间。
27.用于产生转基因禾本科植物或小植物或植物部分的方法，所述方法包括
(i)通过实施权利要求1到23中任一项的方法产生转基因禾本科植物细胞；
(ii)从(i)所产生的转基因禾本科植物细胞再生出转基因禾本科植物或小植物或植物部分，
由此产生转基因植物或小植物或植物部分。
28.权利要求27的方法，其中再生禾本科植物包括在足以产生愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞的条件下，用诱导愈伤组织形成和/或诱导转基因细胞的去分化和/或诱导从转基因细胞产生未分化细胞的化合物接触转基因禾本科植物细胞一段时间。
29.权利要求28的方法，其中诱导愈伤组织形成和/或诱导转基因细胞的去分化和/或诱导从转基因细胞产生未分化细胞的化合物选自由2，4-二氯苯氧乙酸、3，6-二氯-o-茴香酸、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸、塞苯隆及其组合所组成的组。
30.权利要求27到29中任一项的方法，还包括在足以产生苗的条件下用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞一段时间。
31.权利要求27到30中任一项的方法，还包括在足以启动生根并产生小植物的条件下用诱导生根的化合物接触愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞一段时间。
32.权利要求30或31的方法，其中诱导苗形成的化合物或诱导生根的化合物选自由吲哚-3-乙酸、苄腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、塞苯隆、激动素、2iP及其组合所组成的组。
33.权利要求30或31的方法，还包括在小植物能生长到成熟的条件下维持小植物一段时间。
34.用于产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的方法，所述方法包括
i)通过实施如下方法产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞，所述方法包括以下步骤
(a)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；和
(b)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌将所述转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下接触所述胚细胞，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞；和
(ii)通过实施如下方法从(i)中产生的转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞再生出小麦植物或大麦植物或稻植物或玉米植物，所述方法包括以下步骤
(a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞一段时间；
(b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间；
(c)在足以启动生根的条件下，用诱导生根的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和
(d)在足以产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的条件下，生长小植物一段时间。
35.用于产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的方法，所述方法包括
(i)通过实施如下方法产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞，所述方法包括以下步骤
(a)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；和
(b)从胚细胞去除种皮和/或糊粉；
(c)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述细胞的条件下接触所述胚细胞，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；
(d)在足以使得所述土壤杆菌将所述转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞；和
(ii)通过实施如下方法从(i)中产生的转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞再生出小麦植物或大麦植物或稻植物或玉米植物，所述方法包括以下步骤
(a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞一段时间；
(b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间；
c)在足以启动生根的条件下，用诱导生根的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和
(d)在足以产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的条件下，生长小植物一段时间。
36.用于产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的方法，所述方法包括
(i)通过实施如下方法产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞，所述方法包括以下步骤
(a)从成熟小麦籽粒或成熟大麦籽粒或成熟稻籽粒或成熟玉米粒获得胚细胞；和
(b)从胚细胞去除种皮和/或糊粉；
(c)用包括核酸构建体的土壤杆菌在足以使得所述土壤杆菌结合或附着于所述细胞的条件下接触所述胚细胞，所述核酸构建体包括待引入到胚细胞内的转移核酸，其中在存在蛋白胨的情况下实施所述接触，且其中在无需首先从所述胚细胞诱导愈伤组织形成的情况下实施所述接触；和
(d)在足以使得所述土壤杆菌将所述转移核酸引入到一个或多个细胞内的条件下维持胚细胞和结合的土壤杆菌一段时间，其中在存在蛋白胨的情况下实施所述维持，由此产生转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞；和
(ii)通过实施如下方法从(i)中产生的转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞再生出小麦植物或大麦植物或稻植物或玉米植物，所述方法包括以下步骤
(a)在足以产生愈伤组织的条件下，用诱导愈伤组织形成的化合物接触转基因小麦细胞或转基因大麦细胞或转基因稻细胞或转基因玉米细胞一段时间；
(b)在足以产生苗的条件下，用诱导苗形成的化合物接触愈伤组织一段时间；
(c)在足以启动生根的条件下，用诱导生根的化合物接触愈伤组织一段时间，由此产生小植物；和
(d)在足以产生转基因小麦植物或转基因大麦植物或转基因稻植物或转基因玉米植物的条件下，生长小植物一段时间。
37.权利要求27到36中任一项的方法，还包括提供转基因小麦植物。
38.权利要求27到37中任一项的方法产生的转基因禾本科植物。
39.用于产生转基因禾本科植物的转基因子代的方法，所述方法包括
(i)通过实施权利要求27到37中任一项的方法产生转基因禾本科植物；和
(ii)育种(i)中产生的转基因禾本科植物，由此产生所述植物的子代。
40.权利要求39的方法，还包括获得转基因禾本科植物的转基因子代。
41.权利要求39或40的方法，还包括选择或鉴定转基因禾本科植物的转基因子代。
42.通过实施权利要求39到41中任一项的方法产生的转基因禾本科植物的转基因子代。
43.包括来自通过实施权利要求27到37中任一项的方法产生的转基因禾本科植物或通过实施权利要求39到41中任一项的方法产生的子代的植物材料的产品，所述产品被标记以便标识出产品的性质。
44.用于育种转基因禾本科植物的方法，所述方法包括
(i)通过实施权利要求27到37或39到41中任一项的方法而产生转基因禾本科植物或转基因禾本科植物的子代或转基因禾本科植物的种子或转基因禾本科植物的繁殖材料；和
(ii)提供育种用的所述植物、子代、种子或繁殖材料。
45.用于育种转基因禾本科植物的方法，所述方法包括
(i)获得通过实施权利要求27到37或39到41中任一项的方法而产生的转基因禾本科植物或转基因禾本科植物的子代；和
(ii)育种所述转基因禾本科植物或子代。
46.用于在禾本科植物细胞中表达核酸的方法，所述方法包括
(i)通过实施权利要求27到37或39到41中任一项的方法产生转基因禾本科植物或其子代，其中核酸构建体包括与在禾本科植物细胞内可操纵的启动子可操纵连接的转基因；和
(ii)在足以使所述转基因表达的条件下维持所述转基因植物一段时间。
47.权利要求46的方法，其中转基因编码与提高植物产量相关的蛋白。
48.权利要求47的方法，其中转基因编码一种蛋白，所述蛋白赋予或增强表达所述转基因的小麦植物对小麦病原体的抗性。
49.权利要求48的方法，其中转基因是小麦奇甜蛋白样蛋白或小麦线条花叶病毒外壳蛋白。
50.权利要求47的方法，其中转基因赋予表达所述转基因的小麦植物耐旱性和/或耐干性和/或耐盐性和/或耐寒性。
51.权利要求50的方法，其中转基因是拟南芥DREB1A基因。
52.权利要求46的方法，其中转基因编码一种蛋白，所述蛋白提高来自表达所述转基因的小麦植物的小麦产品的营养品质。
53.权利要求52的方法，其中转基因是高分子量麦谷蛋白亚基1Ax1基因。
54.用于调控禾本科植物中的基因表达的方法，所述方法包括
(i)通过实施权利要求27到37或39到41中任一项的方法产生转基因禾本科植物或其子代，其中核酸构建体包括能够调控与在禾本科植物细胞内可操纵的启动子可操纵连接的基因的表达的转基因；和
(ii)在足以调控所述核酸表达的条件下维持所述转基因植物一段时间。
55.权利要求54的方法，其中转基因编码短干扰RNA或微RNA。
56.权利要求54或55的方法，其中转基因提高来自表达所述转基因的小麦植物的小麦产品的营养品质。
57.权利要求56的方法，其中转基因编码阻止、抑制或减少小麦颗粒结合性淀粉合酶I基因的表达的抑制性RNA。
全文摘要
本发明提供产生转基因禾本科植物细胞的方法，包括(i)从成熟禾本科籽粒获得胚细胞；和(ii)用能够转化植物细胞的细菌接触所述胚细胞，所述细菌包括待引入胚细胞内的转移核酸，所述接触的时间和条件足以使得所述细菌将所述转移核酸引入一个或多个细胞内；由此产生转基因禾本科植物细胞。本发明也提供经所述方法产生的转基因禾本科植物细胞和/或转基因禾本科植物。本发明也提供用于在转基因禾本科植物细胞或转基因禾本科植物中表达核酸的方法。
文档编号A01H4/00GK101421402SQ200780008777
公开日2009年4月29日 申请日期2007年1月11日 优先权日2006年1月11日
发明者C·M·拉梅奇, G·斯潘根贝格, D·维什努达森 申请人:分子作物育种代理有限公司