口腔组织再生和修复的制作方法

专利名称：：口腔组织再生和修复的制作方法
技术领域：
：本发明涉及组织工程学领域，特别涉及一种培养组织构建体在口腔组织再生和^修复中的应用。
背景技术：
：组织工程学领域将生物工程方法与生命科学原理相结合，用于了解正常的和病态的哺乳动物组织中结构和功能的关系。组织工程学的目标是开发和最终使用生物替代物以修复、保持或改善组织功能。因此，通过组织工程学，有可能在实验室内设计并制造出生物工程化组织。生物工程化组织可以包含通常与自然的哺乳动物或人的组织以及合成的或外源性的基质支架有关的细胞。新的生物工程化组织当被移植到宿主上时必发挥作用，并且永久地结合在宿主体内或者被作为接受者的宿主患者的细胞逐渐地生物重塑。制造一种没有支撑件或支架的组织等效材料在创造新的生物工程化组织中带来了科学挑战。大多数的口腔软组织移植过程使用来自腭的自体组织进行。尽管这可能在一些过程中非常好地进行，但是其缺点是需要制造对患者而言非常疼痛的"供体部位"。这种附加的供体部位还提供了有限的组织，即，一次仅可治疗少数牙齿。这可导致需要进行多次手术或者牙科医生仅仅治疗"损坏最重的牙齿"，尽管可能遗留下若干个未经治疗的也可受益于该移植过程的牙齿。
发明内容本发明涉及通过向受试者的口腔组织移植培养组织构建体来治疗受试者的口腔病况的方法。本发明的培养组织构建体包括培养的细胞和内源性产生的细胞外基质组分，不需要外源性的基质组分或网络支撑部件或支架。本发明因使;。、、'、土、、_、5培养组织构建体的移植物包括产生细胞外基质组分的成纤维细胞，而不添加外源性的基质组分、网络支撑件或支架部件。培养组织构建体包括在成分确定的(defined)培养基系统中和/或不使用非成分确定的(undefined)或非人由来的生物组分诸如牛血清或器官提取物的情况下产生细胞外基质组分的成纤维细胞。另外，培养组织构建体可由不同类型的连续的种子细胞制造，所述种子细胞产生的培养组织构建体^t拟自然组织的细胞组成和组织构造。具体而言，这种培养组织构建体包含施用于培养的成纤维细胞层上的至少一层上皮细胞层。进一步地，组织构建体经由培养的细胞产生和自我装配，而无需支架支撑件或加入外源性的细胞外基质组分。本发明的培养组织构建体移植物还包括胶原蛋白溶液与收缩剂的凝胶混合物。另外，本发明的培养组织构建体移植物包括布置在非细胞胶原蛋白凝胶层上的胶原蛋白凝胶层，胶原蛋白凝胶层包含胶原蛋白和收缩剂。在本发明的又一实施方案中，将上皮细胞加入到包含胶原蛋白凝胶和收缩剂的胶原蛋白凝胶层中。组织构建体的强度特性使得该组织构建体易于操作，因为该组织构建体可从形成其的培养设备中容易地和可剥离地除去，并且在临床或试验应用中可被直接移植，无需任何支撑件或载体。本发明的组织构建体可用于治疗具有口腔组织疾病的患者，所述口腔组织疾病诸如口腔齿龈退缩，牙间乳头缺失，牙槽嵴缺陷，口腔植入失败，牙齿分叉缺陷(dentalfurcationdefect),和用于治疗在颌面部肿瘤切除后需要组织重建的患者。图1表示通过羟脯氨酸试,验测定的，与实施例1中所述的人新生儿包皮细胞由来的皮肤构建体中的细胞数目相比，胶原蛋白浓度的增加。图2是说明使用成纤维细胞，水合胶原蛋白网格(lattice)的收缩数据图3是说明使用成纤维细胞，具有不同胶原蛋白含量的水合胶原蛋白网;^各的收缩数据图4是说明使用成纤维细胞，含有不同数目的成纤维细胞的水合胶原蛋白网格收缩数据图5是说明成纤维细胞对采用不同群体倍增水平的细胞的水合胶原蛋白网格的收缩能力的数据图6是说明10.0)ug/ml的抑制剂细胞松弛素B对成纤维细胞收缩水合胶原蛋白网格的能力的作用的数据图7是说明0.36|iig/ml的抑制剂秋水仙酰胺对成纤维细胞收缩水合胶原蛋白网格的能力的作用的数据图8是说明阿糖胞苷对成纤维细胞收缩水合胶原蛋白网格的能力的作用的数据图9是说明在凝血酶浓度为4.0单位/毫升条件下凝血酶对血小板收缩胶原蛋白网格的作用图IO是说明在凝血酶浓度为4.0单位/毫升条件下胶原蛋白网格收缩作为血小板浓度的函数的图11A-11D是说明胶原蛋白网格的网格收缩作为所用胶原蛋白的类型和浓度的函数的图；和图12是说明抑制剂细胞松弛素B和秋水仙酰胺对血小板收缩水合胶原蛋白网格的作用图13是本发明的一个装置的立体图，一部分被分解；图14是图13中所示装置的分解立体图15是图13中所示装置的沿着3—3的截面；图16是本发明的另一个装置的立体图，一部分被分解；图17是图16中所示装置自上方显示的分解图；和图18是图16中所示装置的沿着6—6的分解截面。发明详述本发明涉及通过移植培养组织构建体来治疗受试者的口腔病况的方法。应当注意到，"培养组织构建体"，"工程化活组织"，"细胞-基质构建体"，"细胞-基质层"，"皮肤等效材料"，"活组织"和"活连接组织"作为本发明的培养组织构建体的实施方案可互换使用。因此，目前的工程化的活组织构建体不完全是细胞装配的，并且必需依靠加入或结合外源性基质组分或依靠用于构造或支撑的合成部件，7或者二者兼有。本文所述的生物工程化组织构建体表现出它们的细胞所由来的组织的许多自然特征，如此产生的组织构建体可用于治疗患者的口腔病况。一种优选方案是包含第一细胞类型和内源性产生的细胞外基质的细胞-基质构建体，其中第一细胞类型能够合成和分泌细胞外基质以产生细胞-基质构建体。另一优选方案是双层构建体，其包含第一细胞类型和内源性产生的细胞外基质以及布置在由第一细胞类型形成的细胞-基质构建体上或内的第二类型细胞的细胞层。更优选方案是细胞-基质构建体，其包含成纤维细胞诸如得自真皮的成纤维细胞以形成培养的真皮构建体。另一更优选方案是细胞-基质构建体，其包含成纤维细胞诸如得自真皮的成纤维细胞以形成培养的真皮构建体，以及在其上培养的角化细胞层以形成表皮层，从而得到培养的双层皮肤构建体。本发明的培养皮肤构建体表现了自然皮肤的许多物理学的、形态学的和生物化学的特征。在更优选方案中，细胞基质构建体是类似于皮肤的真皮层的组织构建体，即人真皮构建体，其在包含人由来细胞的、成分确定的系统中形在最优选方案中，本发明的组织构建体在化学上成分确定的系统中被制造，这个系统包含人由来细胞但是不含化学上非成分确定的或非人生物组分或细月包。在本发明的另一实施方案中，培养组织构建体包含凝胶混合物，该凝胶混合物包含月交原蛋白溶液和收缩剂。在本发明的优选方案中，培养组织构建体包括含非细胞胶原蛋白凝胶的第一层和布置在第一层上的第二层，其中第二层包含第二胶原蛋白凝胶，该第二胶原蛋白凝胶含有胶原蛋白和收缩剂。在本发明的更优选方案中，胶原蛋白与收缩剂的第二层用角化细胞接种。A:培养组织构建体的应用本发明的培养组织构建体可用于治疗口腔病况，诸如口腔齿龈退缩，牙间乳头缺失，牙槽嵴缺陷，口腔植入物失败或颌面部肿瘤退缩。通常认为每颗牙齿周围的附着龈功能区是健康所必需的。在没有这种组织时，经常发生牙龈退缩，导致一部分外板丧失，导致牙齿预后更加恶化。另外，面向没有附着龈功能区的牙齿的粘膜通常被发现是发炎的，尽管受试者具有良好的家庭保健。这种炎症可能引起牙齿周围的骨缺失。自二十世纪六十年代末期以来，这一类型的问题通常通过游离自体移植被校正。除去面向正关注的牙齿的粘膜，并从腭收获角质化组织并将其缝合到移植床上。最初，移植物被等离激元循环所支撑，之后从周围床进行血管再形成。这类移植的成功率近乎100%。然而，大多数受试者强烈地要求设法鉴定可以代替腭组织而使用的供体材料。当然，这会使该过程所必需的手术部位的数目减少一半。这些年来已经使用了许多可替代的供体材料。过去已经使用了冷冻干燥的尸体皮肤并且最近已经使用非细胞皮肤移植物作为供体材料。尽管非常轻微，但是与这类皮肤材料有关的潜在的感染风险(主要是AIDS和肝炎)阻止了它们的应用。除此之外，采用这些供体材料的移植物的最终美学效果通常不那么理^tH、。B:包含至少一种类型的产生细胞外层的细胞和内源性产生的细胞外基质的构造层的培养组织构建体本发明的一个优选方案包括至少一种类型的产生细胞外基质的细胞和内源性产生的细胞外基质组分(说得再简单些被称作"基质")的构造层，其中该基质完全由细胞合成并且通过培养细胞进行装配。该层在本文中被称作"细胞-基质构建体"或"细胞-基质层"，因为细胞分泌基质并在它们所分泌的基质内和整个基质中包含细胞自己。如在200年3月3曰提交的待审美国专利申请09/523,809中所公开的，其全文并入本文作为参考，培养组织构建体不要求外源性基质组分，因此不包含外源性基质组分，也就是，不通过培养细胞产生而是用其它方式引入的基质组分。在更优选方案中，由人真皮成纤维细胞产生的细胞-基质构建体表现出与自然真皮类似的主导浓度的胶原蛋白。通过电子显微镜检查证实，基质实质上是包含胶原蛋白的纤维质(该胶原蛋白表现四分之一交错(quarter-staggered)的67nm带型(bandingpattern))，以及与自然月交原蛋白类似的原纤维和原纤维束的堆积组构(packingorganization)。9延迟还原SDS-PAGE已经在这些构建体中检测到存在I型和III型两种胶原蛋白，它们是在自然人真皮中被发现的主要胶原蛋白类型。使用标准的免疫组织化学(IHC)技术，真皮细胞-基质构建体对于核心蛋白聚糖染色呈阳性，核心蛋白聚糖是已知与胶原原纤维结合并被认为在体内调节原纤维直径的硫酸皮肤素蛋白多糖。核心蛋白聚糖还可通过TEM在构建体中被观察到。产生的组织对于生腱蛋白染色也呈阳性，生腱蛋白是例如在正在修复的间充质或组织中被发现的细胞外基质糖蛋白。与体内正在修复的组织非常相似，培养产生的组织已经表现出当基质形成时其I型胶原蛋白对III型胶原蛋白的比增加。尽管不希望束縛于理论，但是据信细胞在它们之间的开放空间内迅速地用与主要由III型胶原蛋白和纤连蛋白组成的肉芽组织类似的松散基质填充，然后使用主要由I型胶原蛋白组成的致密基质对这一松散基质进行重塑。产生的细胞-基质已经表现出含有糖胺聚糖(GAG),诸如透明质酸(HA);纤连蛋白；除了核心蛋白聚糖之外的蛋白多糖，诸如双糖链蛋白聚糖和多能聚糖；和一系列的硫酸糖胺聚糖，诸如二透明质酸；二-软骨素-O-硫酸酯；二-软骨素-4-硫酸酯；二-软骨素-6-硫酸酯；二-软骨素_4,6-硫酸酯；二-软骨素-4-硫酸酯-UA-2S;和二-软骨素-6-硫酸酯-UA-2S。这些结构特征和生化特征随着构建体在培养基中的发展而展现它们自己并且当构建体接近其最终形态时变得明显不同。在充分形成的培养真皮细胞-基质构建体中这些组分的存在表明了构建体具有的结构特征和生化特征接近正常真皮的这些特征。尽管上述列举的是由真皮成纤维细胞形成的培养细胞-基质构建体的生化特征和结构特征，但是应当认识到由其它类型的成纤维细胞形成的培养细胞-基质构建体将产生所述细胞所由来的组织类型的许多这些特征和其它表型特征。有时候，成纤维细胞可通过化学暴露或接触，物理应力，或通过转基因手段被诱导表达非表型组分。本发明的另一优选方案是具有在其上布置有第二细胞层的细胞-基建体,在更优选方案中，^"二层细胞^上皮由来细胞。在最优选方案中:第二层细胞包含培养的人角化细胞，其与笫一细胞-基质层(由真皮成纤维细胞和内源性基质形成的细胞-基质构建体以形成真皮层)一起，包括活皮肤构建体。当完全形成时，表皮层是多层的、层状的和分化良好的10角化细胞层，其显示出基底层，基底上层，颗粒层和角质层。通过透射电子显微镜(TEM)显示，皮肤构建体在真皮-表皮连接处具有发育良好的基底膜。通过TEM可观察到，基底膜似乎在半桥粒周围最厚，这以由VII型胶原蛋白组成的锚定原纤维(anchoringfibril)为标记。可以观察到锚定原纤维从基底膜离开并在真皮层内截留胶原原纤维。这些锚定原纤维以及其它基底膜组分由角化细胞分泌。还已知的是尽管角化细胞能够自己单独地分泌基底膜组分，但是可识别的基底膜在没有成纤维细胞存在下不会形成。本发明的皮肤构建体的免疫组织化学染色还表明存在层粘连蛋白，其是基底膜蛋白。在本发明的用于形成细胞-基质构建体的优选方法中，将第一细胞类型，即产生细胞外基质的细胞类型接种到底物上，进行培养，并被诱导以在其周围合成和分泌经过组构的细胞外基质，从而形成细胞-基质构建体。在本发明的另一优选方法中，细胞-基质构建体的表面用第二细胞类型的细胞接种并进行培养以形成双层组织构建体。在更优选方法中，具有与自然人皮肤类似特征的全厚度皮肤构建体由如下形成在足以诱导基质合成的条件下培养成纤维细胞诸如人真皮成纤维细胞，形成真皮细胞和基质的细胞-基质，即真皮层，在其上接种人上皮细胞如角化细胞，因此，获得本发明的培养组织构建体的一种方法包括(a)在没有外源性细胞外基质组分或结构支撑件的条件下培养至少一种产生细胞外基质的细胞类型；和(b)刺激步骤(a)的细胞以合成、分泌和组构细胞外基质组分以形成由细胞以及由这些细胞合成的基质组成的组织-构建体；其中步骤(a)和(b)可同时地或连续地进行。为了形成包含细胞-基质构建体和其上的第二细胞层的双层培养组织构建体，该方法另外包括步骤(c)在形成的组织-构建体的表面上培养笫二类型的细胞以产生双层组织构建体。分泌细胞外基质组分并将细胞外基质组分组构形成细胞基质构建体的任何细胞类型。可培养超过一种的产生细胞外基质的细胞类型来形成细胞-基质构建体。不同细胞类型或组织来源的细胞可在一起进行培养以产生与在自然组织中所发现的类似的互补组分和结构。例如，产生细胞外基质的细胞类型可具有与其混合在一起的其它细胞类型以产生一定量的通常不能由第一细胞类型产生的那些细胞外基质。作为替代，产生细胞外基质的细胞类型也可与其它的在组织中形成特化组织构造但是实质上不对细胞-基质构建体(诸如在本发明的某些皮肤构建体中)的基质方面的总体形成有贡献的细胞类型。尽管根据本发明可使用任何的产生细胞外基质的细胞类型，但是本发明优选使用的细胞类型来自间充质。更优选的细胞类型是成纤维细胞，基质细胞，和其它支撑结締组织细胞，最优选在人真皮中发现的人真皮成纤维细胞用于生产人真皮构建体。成纤维细胞通常产生许多的细胞外基质蛋白质，主要是胶原蛋白。然而，成纤维细胞产生几种类型的胶原蛋白，I型胶原蛋白在体内最普遍。人成纤维细胞抹可以来自许多来源，包括但不限于男婴包皮，真皮，腱，肺，脐带，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。人源细胞可包括但不限于成纤维细胞，可包括平滑肌细胞，软骨细胞，和间质来源的其它结締组织细胞。优选地，但不要求在生产组织构建体中使用的产生基质的细胞的来源可来自在采用本发明的培养方法之后其要相似于或模仿的组织类型。例如，在其中生产皮肤-构建体的实施方案中，优选的产生基质的细胞是成纤维细胞，优选真皮来源。在另外的优选实施方案中，通过显微解剖从毛嚢的真皮乳头分离的产角膜-构建口体的实施5方一案中，产生基质的细胞来自角膜i质。细;包供体可在发育和年龄方面不同。细胞可来自胚儿、婴儿、和包括成人的老年个体的供体组织。胚胎祖细胞诸如间充质干细胞可用于本发明中并;f皮诱导分化以发育成所需组织。尽管人细胞优选用在本发明中，但是在本发明方法中使用的细胞不限于人由来的细胞。可使用得自其它哺乳动物的细胞，其它哺乳动物源包括但不限于马属动物，犬科动物，猪科动物，牛类动物，和羊来源动物；或啮齿动物诸如小鼠或大鼠。另外，在本发明中也可使用自然产生的细胞，化学或病毒转染的细胞，或重组细胞或基因工程细胞。对于引入超过一种的细胞类型的实施方案，可使用来自两种或多种来源的正常细胞的嵌合混合物；正常细胞和基因修饰或转染细胞的混合物；或来自两种或多种物种或组织来源的细J包的混合物。12在细胞-基质构建体的生产中可使用重组或基因工程细胞来产生组织构建体，其用作药物递送移植物，用于需要增加天然细胞产物的水平或需要用治疗剂进行治疗的患者。可借助移植物重组细胞产物，生长因子，激素，肽或蛋白质，或者根据需要当由于患者体内存在的状况而受到生物学、化学或热信号调剂时，细胞可被生成并被递送到患者达持续时间。根据培养组织构建体的使用适应症，希望长期或短期的基因产物表达。当培养组织构建体被植入以向患者递送持续延长时段的治疗产物时希望长期表达。相反地，在以下的情况中希望短期表达当培养组织构建体被移植到具有创伤的患者，在该创伤处，培养组织构建体的细胞将促进正常的或接近正常的痊愈或用于减少伤口部位的划痕，一旦创伤愈合，得自培养组织构建体的基因产物在创伤部位处将不再被需要或可能不再被需要。细胞也可进行基因工程化以表达蛋白质或不同类型的细胞外基质组分，这些蛋白质或不同类型的细胞外基质组分是"正常，，的但以高水平表达或者以某种方式被改性，从而制造包括细胞外基质和活细胞的移植物装置，其具有用于改善伤口愈合，促进或引导新血管生成，或使疤痕或瘢痕瘤形成最小化的治疗学优点。这些过程通常是本领域已知的，并且描述于Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)中，该文献作为参考并入本文。以上提到的所有类型的细胞都被包括在本文使用的"产生基质的细胞"的定义中。由成纤维细胞产生的占优势的主要细胞外基质组分是原纤维胶原蛋白，特别是I型胶原蛋白。原纤维胶原蛋白是细胞-基质结构中的关键组分；然而，本发明不限于仅仅由这种蛋白质或蛋白质类型组成的基质。例如，其它的胶原蛋白，来自胶原蛋白家族的原纤维胶原蛋白和非原纤维月交原蛋白二者，诸如ii、m、iv、v、vi、vn、vin、ix、x、xi、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX型月交原蛋白可通过采用适当的细胞类型#:产生。类似地，使用本发明的方法可以产生和沉积的其它基质蛋白质包括但是不限于弹性蛋白；蛋白聚糖诸如核心蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖；或糖蛋白诸如生腱蛋白；玻连蛋白；粘连蛋白；层粘连蛋白，凝血栓蛋白I和糖胺聚糖(GAG)诸如透明质酸(HA)。产生基质的细胞在适用于动物细胞或组织培养的器皿中进行培养，所述器皿诸如培养皿，烧瓶，或转瓶，它们允许形成三维组织样结构。细胞并为待形成的细胞-基质构建体提供锚定机构的生物学相容材料。可使用诸如以下的材料作为细胞生长表面玻璃；不锈钢；聚合物，包括聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚乙二烯(polyvinylidene),聚二甲硅氧烷，含氟聚合物，和氟化乙烯丙烯；和硅底物，包括熔融二氧化硅，多晶硅，或硅晶体。细胞生长表面材料可经过化学处理或改性，带静电荷，或涂覆生物制品诸如聚-L-赖氨酸或肽。肽涂层的例子是RGD肽。尽管本发明的组织构建体可在固体细胞生长表面上生长，但是优选使用带有孔隙的细胞生长表面，孔隙使膜的上表面和下表面二者相通以允许培养基双侧接触正在发育的组织构建体或用于仅仅从下表面接触培养基。双侧接触允许培养基接触正在发育的构建体的上表面和下表面，使得构建体以最大表面面积暴露于培养基中所含的营养物质下。培养基也可仅仅接触正在形成的培养组织构建体的下表面，从而当在培养皮肤构建体发育过程中上表面可曝露在空气中。优选的培养容器是采用载体插入物、用培养基处理的可渗透件诸如在含有培养基的培养容器中悬浮的多孔膜的培养容器。通常，膜被固定到筒形构件或骨架的一端，所述筒形构件或骨架被插入并与底部相接，诸如可用盖子覆盖的培养皿。引入载体插入物和多孔膜的培养容器是本领域已知的并且优选被用于实施本发明，并且在本领域的多个美国专利中被描述，其中一些已经在市场上可买到，所述专利包括例如，5,766,937,5,466,602,5,366,893,5,358,871,5,215,920,5,026,649,4,871,674,4,608,342，其公开4皮并入本文。当使用这类培养容器时，在膜的一个表面上，优选在顶部朝上的表面上产生组织-构建体，并且培养物在上、下表面都与细胞培养基接触。生长表面内的孔隙允许用于提供营养物质的培养基穿过膜通到培养物的下侧，/人而允许细胞从双侧或^叉从底侧^皮供应。优选孔径为足够小从而不能使细胞的生长穿过膜，但又足够大从而允许培养基中所含的营养物质自由(诸如通过毛细管作用)通到细胞-基质构建体的底表面。优选的孔径为约低于3微米但是介于约0.1微米到约3微米的范围中间，更优选介于约0.2微米到约1微米的范围中间，最优选使用介于约0.4微米到约0.6微米范围中间的尺寸孔隙。在人真皮成纤维细胞的14情况中，最优选的材料是具有在约0.4微米到约0.6微米之间的孔径的聚碳酸酯。最大孔径不仅根据细胞大小而定，而且根据细胞改变其形状并通过膜的能力而定。重要的是类似组织的构建体附着于表面但是不结合或包封底物，从而诸如用最小的力剥离时可被取下。形成的组织构建体的大小和形状由其所生长的容器表面或膜的大小决定。底物可以是圆形或角形的，或者具有圆角，或者具有不规则形状。底物作为模具也可是平坦的或者具有波状外形，从而生产与创伤相接或;f莫仿自然组织的物理结构的成形构建体。为了应对生长底物的更大的表面面积，按比例地向表面接种更多细胞，并且需要更大体积的培养基以充分地浸泡和滋养细胞。当最终形成组织构建体时，无论其是单层细胞-基质构建体还是双层构建体，在将其移植到患者之前通过剥离从膜底物上被取下。本发明的培养组织构建体不依赖合成的或可生物再吸收的部件诸如网部件用于形成组织构建体。网部件作为机织材料、针织材料或毡制材料被组构。在其中使用网部件的系统中，细胞在网部件上进行培养并且在网的侧边上或缝隙内生长以将网包封和结合在培养组织构建体内。通过结合这种网的方法形成的最终的构建体依赖网的物理支撑和体积。依赖合成的网部件的培养组织构建体的例子在Naughton等的美国专利5,580,781,5,443,950,5,266,480,5,032,508,4,963,489中公开。用于生产细胞-基质层的系统可以是静态的或者可对培养基采用灌注手段。在静态系统中，培养基是静止的和相对不动的，而在灌注系统中培养基是运动的。培养基的灌注影响细胞的存活力并加强基质层的发育。灌注手段包括但是不限于在培养皿中在包含培养膜的底物阻挡件下方(以下)或其附近使用磁力搅拌棒或机动化叶轮以搅拌培养基；在培养皿或培养室内泵送培养基或泵送培养基通过培养皿或培养室；在振摇台或转动台上轻轻地摇动培养皿；或如果在转瓶中产生时则进行转'适用于本发明的口培l基配方^基于待培养的细胞类型和待生产的组织构造进行选择。使用的培养基和促进细胞生长、基质合成和存活力所需的特定培养条件将根据生长的细胞类型的不同而异。在有些情况下，诸如在制造本发明的生物工程化双层皮肤构建体时，培养基的组成随着制造的每个阶段而变化，因为需要不同的补给以用于不同的目的。在优选的方法中，细胞-基质层在成分确定的条件下形成，也就是说，在化学上成分确定的培养基中进行培养。在另外的优选方法中，组织构建体包括细胞-基质层，该细胞-基质层具有在其上布置和培养的第二细胞层，其中两种细胞类型都在成分确定的培养基系统中进行培养。作为替代，组织构建体包括在成分确定的培养基条件下制造的细胞-基质层，和在非成分确定的培养基条件下在所述细胞-基质层上形成的第二层。在相反的情况下，组织构建体包括可在非成分确定的培养基条件下制造的细胞-基质层，和在成分确定的培养基条件下在所述细胞-基质层上形成的第二层。化学上成分确定的培养基的使用是优选的，化学上成分确定的培养基是这样的培养基，其不含非成分确定的动物器官或组织提取物，例如血清，垂体提取物，下丘脑提取物，胎盘提取物，或胚胎提取物或蛋白质，以及由飼养细胞分泌的因子。在最优选的实施方案中，培养基不含加非成分确定的组分不是优选的，但是非成分确定的组分可以根据本文公开的方法在任何培养时间点被使用来成功地制造组织构建体。当采用实施本发明时，得到的组织构建体是成分确定的人组织构建体。在供最功能等效物以补充化学上成分确定的培养基。通常，细胞培养领域的技术人员将能确定与通常已知的动物组分相当的适宜天然人等价物、人重组等价物、或合成等价物来补充本发明的培养基而无需进行不适当的研究或试验。在临床中使用这种构建体的优点是对外来的动物或交叉物种病毒污染和感染的担心净皮降4氐了。在试-睑方案中，化学上成分确定的构建体的优点是当试验时，结果不存在由于非成分确定的组分的存在所导致的混淆。培养基由通常被进一步补充了其它组分的营养基础物组成。在动物细胞培养领域，熟练技术人员可以确定有合理的期望值可以用于成功地生产本发明组织构建体的确定适当的营养基础物。许多市场上可买到的营养物来源可用于实施本发明。这些包括市场上可买到的提供无机盐，能量来源氨基酸，和B族维生素的营养物来源，诸如Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM);极限必需培养基(MEM);Ml";RPMI1M0;16Iscove氏改进的Dulbecco培养基(EDMEM)。极限必需培养基(MEM)和M199要求另外补充磷脂前体和非必需氨基酸。市场上可买到的提供附加氨基酸，核酸，酶辅助因子，磷脂前体和无机盐的富含维生素的混合物包括Ham'sF-12,Ham'sF-10,NCTC109,和NCTC135。虽然具有不同浓度，但是所有的基础培养基都为细胞提供了基础营养物来源，这些基础营养物质是葡萄糖、氨基酸、维生素和无机离子与其它基础培养基组分在一起的形式。本发明的最优选的基础培养基分别包括以下的营养基础物不含钙的或低钙的Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM),或者，二者的比为3:1到1:3的DMEM和Ham'sF-12。该基础培养基补充有诸如氨基酸，生长因子和激素的组分。用于本发明细胞培养的成分确定的培养基在Parenteau的美国专利5,712,163中和在国际PCT公开WO95/31473中描述，所述公开作为参考并入本文。其它培养基是本领域已知的，诸如在Ham和McKeehan的MethodsinEnzymology,58:44-93(1979)中公开的培养基，或者，对于其它适当的化学上成分确定的培养基，在Bottenstein等的MethodsinEnzymology,58:94-109(1979)中7>开。在优选实施方案中，基础培养基补充有动物细胞培养物领域熟练技术人员已知的以下组分胰岛素，铁传递蛋白，三碘曱腺原氨酸(T3),和乙醇胺和o-磷酰基-乙醇胺之一或二者，其中用于补充的浓度和置换可由熟练的技术人员确定。胰岛素是一种多肽激素，其促进葡萄糖和氨基酸的摄取以通过多种途径提供长期益处。胰岛素或胰岛素样生长因子(IGF)的补充对于长期培养是必要的，因为最终会发生细胞摄取葡萄糖和氨基酸的能力耗尽和细胞表型的可能降解。胰岛素可来自动物例如牛类动物，人源，或通过重组手段得到的人重组胰岛素形式。因此，人胰岛素将有资格作为并非来自非人生物学来源的、化学上成分确定的组分。胰岛素补充可用于连续培养并且在较宽的浓度范围内被提供给培养基。优选的浓度范围为约0.1|ug/ml到约500jug/ml,更优选在约5|ig/ml到约400|ug/ml,和最优选在约375pg/ml。对于被选择用于培养的细胞类型，用于补充的胰岛素样生长因子诸如IGF-1或IGF-2的适当浓度可由本领域技术人员容易地确定。铁传递蛋白是用于调节铁运输的递质，铁是在血清中发现的必需微量元素。因为游离形式的铁对细胞具有毒性，在血清中，铁以在优选约0.05|ug/ml到约50|ag/ml，更优选在约5jug/ml的浓度范围内与铁传递蛋白结合的形式提供给细胞。三碘曱腺原氨酸(T3)是基本成分，并且是活性形式的甲状腺激素，其被包含在培养基中以维持细胞代谢速率。三碘甲腺原氨酸以约0pM到约400pM的浓度范围，更优选约2pM到约200pM的浓度范围，最优选在约20pM下^f皮补充到培养基中。乙醇胺和o-磷酰基-乙醇胺之一或二者作为磷脂被加入，其作用是在肌醇路径和脂肪酸代谢中作为重要前体。在无血清培养基中补充通常在血清中被发现的脂质是必要的。乙醇胺和o-磷酰基-乙醇胺在约10—6到约10—2M的浓度范围，更优选在约lxl(T4M的浓度下被提供给培养基。在整个培养期间，基础培养基另外补充有其它组分诸如氢化可的松，硒和L-谷氨酰胺以诱导合成或分化，或改善细力包生长。强分化特征诸如内披蛋白和角化细胞转谷酰胺酶含量(Rubin等，J.CellPhysiol.,138:208-214(1986))。因此，氢化可的松是在其中这些特征是有益的情况下时所需的添加剂，诸如在形成角化细胞片状移植物或皮肤构建体时。氢化可的松可以约O.Olpg/ml到约4.0pg/ml,最优选约0.4jng/ml到16jug/ml的浓度范围被提供。硒被加入到无血清培养基中以再供给通常由血清提供的微量元素硒。硒可以在约10-9到约1(T7M的浓度范围；最优选在约5.3xl0-8M的浓度下被提供。L-谷氨酰胺这一氨基酸存在于一些营养基础物中，并且可在其中含量为零或含量不够的情况中被添加。L-谷氨酰胺也可以稳定形式被提供，诸如以商标GlutaMAX-l(GibcoBRL,GrandIsland,NY)^皮出售的形式。GlutaMAX-lTM是稳定的二肽形式的L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺，并且可与L-谷氨酰胺互换使用，并且作为L-谷氨酰胺的替代物以等摩尔浓度被提供。该二肽为L-谷氨酰胺在储存和培养期间随时间发生的降解提供了稳定性，降解可导致培养基中L-谷氨酰胺的有效浓度变得不确定。通常，基础培养基补充有优选在约1mM到约6mM之间的，更优选在约2mM到约5mM之间的，和最优选4mM浓度的L-谷氨酰胺或GlutaMAX-lTM。生长因子诸如表皮生长因子(EGF)也可被加入到培养基中以通过细胞递增和接种帮助形成培养物。可使用自然形式的或重组形式的EGF。当制造不含非人的生物学组分的皮肤等效材料时，人源形式(自然或重组)的EGF优选用在培养基中。EGF是任选的组分并且可在约1到15ng/mL的浓度下，更优选在约5到10ng/mL的浓度下被提供。上面描述的培养基通常如下制备。然而，应当了解的是，本发明的组分可采用不与其物理性质相矛盾的常规方法制备和装配。本领域公知可使用适当的类似物或功能等同作用物代替某些组分，用于利用率或经济的目的，并实现相似的结果。天然存在的生长因子可被具有相似性质并且在实施本发明时获得相似结果的重组的或合成的生长因子所替代。本发明的培养基是无菌的。无菌组分在购买时是无菌的，或者在制备后通过常规方法诸如过滤处理而变成无菌的。适当的灭菌过程在以上的全部实施例中都祐使用。DMEM和F-12首先^皮合并，然后加入各个組分以得到培养基。所有组分的储备溶液可以在-20。C储存，例外是营养物来源可以在4t:储存。所有的上述储备溶液被制备为500X的最终浓度。胰岛素，铁传递蛋白和三碘曱腺原氨酸(全部得自Sigma)的储备溶液如下制备最初将三碘曱腺原氨酸溶于绝对乙醇与1N盐酸(HC1)为2:1的溶液中。将胰岛素溶于稀HC1(大约O.IN)并将铁传递蛋白溶于水中。然后将三种溶液混合并在水中稀释到500X浓度。将乙醇胺和o-磷酰基-乙醇胺溶于水中到500X浓度并进行过滤灭菌。将黄体酮溶于绝对乙醇中并用水稀释。将氢化可的松溶于绝对乙醇中并在磷酸盐緩冲盐水(PBS)中稀释。将励溶于水中到500X浓度并进行过滤灭菌。EGF购买时是无菌的并一皮溶于PBS中。腺。票呤难溶解，但是可通过本领域技术人员已知的许多方法净皮溶解。血清白蛋白可浮皮加入到某些组分中以使它们在溶液中是稳定的并且目前得自人或动物来源。例如，可加入人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)用于长期储存从而保持黄体酮和EGF储备溶液的活性。培养基可以在制备后立即使用，或者储存在4。C下。如果被储存，则直到使用前才加入EGF。为了通过产生基质的细胞的培养物形成细胞-基质层，将培养基补充另外的促进由细胞所进行的基质合成和沉积的试剂。这些补充试剂具有细胞相容性，被确定具有高纯度并且未被污染。用于产生细胞-基质层的培养基被称作"基质生成培养基"。19为了制备基质生成培养基，将基础培养基补充有抗坏血酸衍生物诸如抗坏血酸钠，抗坏血酸，或其化学上更稳定的衍生物之一，诸如L-抗坏血酸磷酸4美盐n-水合物。加入抗坏血酸以促进脯氨酸的羟基化和酸溶原胶原蛋白的分泌，酸溶原胶原蛋白是沉积的胶原蛋白分子的可溶性前体。抗坏血酸还是用于其它酶的翻译后加工的重要辅因子以及作为I型和in型胶原蛋白合成的上调物。尽管不希望束缚于理论，但是向培养基中补充牵涉蛋白质合成的氨基酸通过不要求细胞自己生成氨基酸而保存了细胞能量。脯氨酸和甘氨酸优选被加入，因为它们以及脯氨酸的羟基化形式羟脯氨酸是构成胶原蛋白结构的基础氨基酸。尽管不要求，但是基质生成培养基选择性地被补充有中性聚合物。本发明的细胞-基质构建体可不使用中性聚合物而被制造，但又不希望束的胶原蛋白加:《和沉积;二致。'丄个T尤选的中性。聚合物是聚乙二醇(PEG),其已显示促进由培养细胞产生的可溶性前体酸溶原胶原蛋白向基质沉积胶原蛋白的体外加工过程。在本发明的培养基中，优选组织培养级别的PEG的分子量为约1000到约4000MW,更优选约3400到约3700MW。用于本发明方法的优选的PEG浓度可为约5%w/v或更低，优选约0.01%w/v到约0.5%w/v,更优选约0.025%w/v到约0.2%w/v，最优选约0.05%w/v。也可使用其它的培养级别的中性聚合物诸如右旋糖酐，优选右旋糖酐T-40,或聚乙烯吡咯烷酮(PVP),优选在30,000-40,000MW内，使用浓度为约5%w/v或更低，优选约0.01%w/v到约0.5%w/v,更优选约0.025%w/v到约0.2%w/v,最优选约0.05%w/v。其它的增强胶原蛋白加工和沉积的细胞培养级别的和细胞相容的试剂可由哺乳动物细胞培养领域的熟练技术人员来确定。当产生细胞的细胞铺满时，并且当培养基补充有帮助基质合成、分泌或组构的组分时，据信细胞受到刺激以形成由细胞和通过这些细胞合成的基质所组成的组织构建体。因此，优选的基质生成培养基制剂包括Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，没有L-谷氨酰胺)和HamsF-12培养基的3:1的基础混合物，补充有4mML-谷氨酰胺或等效材料，5ng/ml表皮生长因子，0.4|ug/ml氬化可的松，lxlO"M乙醇胺，1x10—4]^0-磷酰20基-乙醇胺，5)ug/ml胰岛素，5pg/ml铁传递蛋白，20pM三碘甲腺原氨酸，6.78ng/ml础，50ng/mlL-抗坏血酸，0.2)ug/mlL-脯氨酸，和0.1iug/ml甘氨酸。向基质生成培养基中，可向培养物中加入其它药理学试剂以改变分泌的细胞外基质的性质、量或类型。这些试剂可包括多肽生长因子，转录因子或无机盐来上调胶原蛋白转录。多肽生长因子的例子包括转化生长因子-(31(TGF-(31)和组织纤溶酶原激活物(TPA),二者都已知上调胶原蛋白合成。Raghow等，JournalofClinicalInvestigation,79:1285-1288(1987);Pardes等，JournalofInvestigativeDermatology,100:549(1993)。刺激胶原蛋白生成的无机盐的例子是铈。Shivakumar等，JournalofMolecularandCellularCardiology24:775-780(1992)。在培养箱中维持培养物以确保细胞培养的足够环境条件受控温度，湿度，和气体混合物。优选条件为温度约34。C到约38°C,更优选37士rC，约5-10±1。/oC02气氛，和相对湿度(Rh)约80-90%。在优选实施方案中，细胞-基质构建体是由真皮成纤维细胞和其所分泌的基质形成的真皮构建体。优选地，使用人真皮成纤维细胞，其取得形式为得自真皮的初级细胞，或更优选得自从建立细胞原液或细胞库(其已经针对病毒和细菌污染用于筛选并测试了纯度)的连续传代培养。细胞在生长培养基中在足够的条件下进行培养以使它们增殖到适当数量用于将细胞接种到在其上形成细胞-基质构建体的培养底物上。作为替代，得自冷冻细胞原液的细胞可直接被接种到培养底物上。一旦已经获得足够的细胞数目，收获细胞并将其接种到适当的培养表面上并在适当的生长条件下进行培养以形成细胞的铺满片。在优选实施方案中，将细胞接种到多孔膜上，所述多孔膜被浸没以允许从培养物的下侧通过孔隙进行培养基接触并且直接从上侧进行培养基接触。优选地，将细胞悬浮在基础培养基或生长培养基中，并接种到细胞培养表面上，接种浓度为约1><105个细胞/(^12到约6.6xl()S个细胞/cm2,更优选约3xl(^个细胞/cm2到约6.6xl()S个细胞/cm2，和最优选约6.6x105个细胞/cm、每平方厘米细胞培养表面的细胞数)。将培养物在生长培养基中进行培养以建立培养物并且一皮培养达到约80%到100%的铺满率，此时通过将培养基换成基质生成培养基以对培养物进行化学诱导，目的是上调细胞外基质的合成和分泌。在可供选择的方法中，将细胞直接接种在基质生成培养基内，从而无需将基础培养基换成基质生成培养基，但是该方法是一种要求接种密度更高的方法。在培养期间，成纤维细胞组构被分泌的基质分子以形成三维的组织样结构，但是不表现出显著的导致正在形成的细胞-基质构建体收缩并从培养底物上自身剥离的收缩力。使用新鲜的基质生成培养基每2-3天进行培养基交换，并且分泌的基质的厚度和实体随着时间而增加。制造细胞-基质构建体所需的时间根据初始接种密度，细胞类型，细胞系的年龄，和细胞系合成和分泌基质的能力的不同而异。当完全形成时，本发明的构建体具有由于通过细胞所产生和组构的纤维状基质而导致的松散厚度；它们不是正常铺满或者过度铺满细胞培养物，其中细胞可松散地彼此附着。纤维状性质赋予构建体以类似内聚性组织的性质，其与普通培养基不同，因为它们抵抗物理破坏，诸如在临床环境中采用常规操纵时的撕扯或破裂。在制造培养真皮构建体期间，细胞将在细胞培养表面上在它们自身周围形成组构基质，优选跨越膜表面的厚度为至少约30微米或更大，更优选约60到约120微米；然而，已经获得了超过120微米的厚度并且该厚度适用于其中需要这种更大厚度的试验或临床应用中。在更优选的方法中，将上皮细胞层施用于细胞-基质构建体的一个表面上，优选顶部的朝上表面上。可将上皮细胞接种到细胞-基质构建体上并在其上进行培养以形成多层组织构建体。在最优选的方法中，皮肤由来的角化细胞在细胞构建体上生长以形成皮肤构建体。在其它优选实施方案中，角膜上皮细胞(也称作角膜角化细胞)可以被接种到细胞-基质构建体上以形成角膜构建体。可将得自口腔粘膜的上皮细胞在细胞-基质构建体上生长以形成口腔粘膜构建体。可将得自食管的上皮细胞在细胞-基质构建体上接种以形成食管组织的构建体。可将得自泌尿生殖道的尿道上皮细胞在细胞-基质构建体上接种以形成尿道上皮的构建体。其它上'^真皮底i提供表皮细胞的方法，及其培养方法，、:括诱导分化和角质化以形成分化的角化细胞层是本领域已知的，并且在Parenteau等的美国专利5,712,163和Kemp等的美国专利5,536,656中描述，所述公开以全文并入本文作为参考。通常，为了进行细胞-基质构建体的表皮形成，将角化细胞接种到细胞-基质构建体上并在其上培养直到该层达到约1-3个细胞层厚度。然后角化细胞被诱导分化以形成多层表皮，然后诱22在形成分化的表皮层的方法中，传代培养角化细胞取自细胞原液并且它们的细胞数目被扩增。当已经获得必要的细胞数目时，将其从培养底物中取出，进行悬浮，计数，稀释并然后接种到细胞-基质构建体的上表面上，接种浓度为约4.5xl(^个细胞/cm2到约5.0xl()S个细胞/cm2,更优选约1.0xl(^个细胞/cn^到约1.0xl()S个细胞/cm2,最优选约4.5x104个细胞/cm2。然后将构建体在37士rC,10%032下培养约60到约90分钟以允许角化细胞附着。在培养后，将构建体浸没在表皮形成培养基中。在足够长的培养时间后，角化细胞增殖并蔓延形成跨越细胞-基质构建体的铺满的单层。一旦铺满，将细胞培养基制剂换成分化培养基以诱导细胞分化。当形成多层上皮时，然后使用角质化培养基并且使得培养在气-液界面进行。为了角化细胞的分化和角质化，将细胞暴露在干燥或低湿度的气-液界面下。干燥或低湿度的界面可以表现试图模仿皮肤的低水分水平的特征。随时间的进行，角化细胞将表达大部分的或全部的角蛋白和其它的当暴露在这些条件下时在自然皮肤中被发现的特征。如上所述，用于制造细胞-基质构建体的系统可用在角膜构建体的形成中。角膜上皮细胞可以来自许多哺乳动物来源。优选的上皮细胞是兔或人的角膜上皮细胞(角膜角化细胞)，但是可使用任何哺乳动物的角膜角化细胞。其它上皮角化细胞诸如来自眼睛的巩膜(外侧白色不透明部分)或表皮的角化细胞可以作为替代物，但是优选角膜角化细胞。在形成角膜构建体的方法中，将培养基从培养插入物(包含细胞-基质构建体)及其周围取出。正常的兔角膜上皮细胞通过传代培养进行扩增，胰蛋白酶化以将其从培养底物中取出，并被悬浮在培养基中，并以约7.2xl(f到约1.4xl()S个细胞/cn^的密度接种到膜的上表面上。然后将构建体在无培养基下在37士rC,10%(302条件下培养约4小时，以允许上皮细胞附着。在培养后，将构建体浸没在角膜维持培养基(CMM)中(Johnson等，1992),上皮细胞被培养直到细胞-基质构建体被上皮细胞覆盖。上皮覆盖的完成可以通过许多方法确定，例如，通过用尼罗蓝溶液(1:10,000,在磷酸盐緩冲盐水中)对培养物进行染色。一旦细胞-基质构建体被覆盖，在大约七天后，将构建体无菌地转移到新的具有足够的角膜维持培养基(CMM)的培养托盘中以实现液面仅仅达到构建体的表面以维持潮湿的界面而不浸没上皮层。构建体在37土rC,10%032和大于60%湿度的条23件下使用CMM进行培养，并且根据需要通常每周进行3次培养基交换。对于分化，而不是上皮细胞层的角质化，根据需要，在制造角膜构建体期间，将上皮细胞表面暴露在潮湿的气-液界面下。提供潮湿的气-液界面的方法在Parenteau的美国专利5,374,515中描述。本文使用的术语"潮湿的界面"是指经过调节从而使得构建体的表面是潮湿的，具有较大湿度，但不是干燥的或被浸没的培养环境。在培养环境中精确的水分量和湿度不是决定性的，但是其应当足够潮湿以避免形成角质化细胞。潮湿的界面可以表现试图模仿人眼的相似含水量的特性。在可供选择的优选实施方案中，可在第一形成的细胞-基质构建体上进行第二产基质细胞的接种，从而获得更厚的细胞-基质构建体或双层细胞-基质构建体。第二接种可使用相同的细胞类型或细胞抹进行或使用不同的细胞类型或细胞抹进行，根据所需结果的不同而异。第二接种采用生成第一层采用的过程和基质生成培养基相同条件下进行。在使用不同的细胞类型进行第二接种中的一个结果是形成的基质具有不同的基质组分特性或基质堆积密度，从而当该构建体被移植到患者时可影响伤口愈合。第一细胞接种产生的基质类似于真皮网状层，是I型胶原蛋白和构成型细胞外基质组分的更致密堆积层。第二细胞接种将产生与真皮乳头层类似的基质，其以较松散的胶原纤维和细胞外基质为特征。采用第二细胞类型的另一个结果是产生治疗物质，其也将影响伤口愈合，诸如改善移植物同化或移植物整合或者使瘢痕形成最小化或防止瘢痕形成。在另外的优选实施方案中，可在形成细胞-基质构建体期间将两种或多种细胞类型的混合细胞群一起培养，条件是所用至少一种细胞类型能够合成细胞外基质。第二细胞类型可以是实施其它组织功能所需的细胞类型或发展成组织构建体的特定结构特征的细胞类型。例如，在制造皮胞4养，从而k许开;成上;附器或其ia分。i皮附器诸:汗腺;皮脂腺结构或组分或毛嚢结构或组分可在与产生基质的细胞一起培养时形成。上皮细胞可得自位于深部真皮内的腺体和毛发的附器结构，诸如通过显微解剖获得，并且包括外分泌细胞，肌上皮细胞，腺性分泌细胞，毛嚢干细胞。在皮肤中通常被发现的构成皮肤的其它细胞类型诸如黑素细胞，郎格罕氏细胞和默克尔细胞(Merkelcells)也可被加入。类似地，可与血管内皮细胞一起培养以产生用于新脉管系统形成的基本组分。脂肪细胞也可与产生基质的细胞一起培养，从而形成用于重建外科的构建体。作为这种第二细胞类型的可供选择的递送方式，细胞可作为斑点或作为任何数目的斑点的阵列^皮定位接种到正在形成的或完全形成的细胞-组织基质上或内，用于这些结构的定位发展。为了将细胞接种到细胞-基质构建体内，可在上表面和下表面之间在细胞-基质内注射细胞用于细胞生长，形成特化结构并实施它们的特异性功能。为了产生三层结构的组织构建体，第一细胞接种包括将产生基质的细胞类型或不产生基质的细胞类型接种到培养底物上持续足够产生细胞-基质构建体或细胞层的时间。一旦笫一细胞-基质构建体或细胞层形成，第二细胞接种包括将产生基质的细胞类型接种到第一细胞-基质构建体或细胞层的上表面上持续足够在第一构建体上形成第二细胞-基质构建体的时间。在第二细胞-基质构建体上，进行第三细胞类型的第三接种和在足够产生第三层的条件下培养。例如，为了制造三层角膜构建体，第一细胞类型的细胞可由内皮来源细胞诸如角膜内皮细胞组成；第二细胞类型可以包括结締组织来源的细胞诸如角膜的角膜细胞；和第三细胞类型可以包括上皮来源的细胞诸如角膜上皮细胞。作为皮肤的三层构建体的另一个例子，第一接种的细胞可以是血管由来的以提供用于血管形成的组分，第二接种的细胞可以包括真皮成纤维细胞以形成细胞-基质构建体作为真皮构建体，和第三接种的细胞可以是表皮角化细胞以形成表皮层。当使用玻璃化冷冻法或深低温保藏法时本发明的组织构建体可以在深冷温度下储存。组织构建体的玻璃化冷冻法在美国专利5,518,878中描述，深低温保藏法在美国专利5,689,961和5,891,617以及国际PCT公开WO96/24018中描述，所述公开作为参考并入本文。C:包括胶原蛋白溶液与收缩剂的凝胶混合物的培养组织构建体在本发明的另外的实施方案中，培养组织构建体包括凝胶混合物，该凝胶混合物包含胶原蛋白溶液和收缩剂。该培养组织构建体通过体外形成水合胶原蛋白网格制造，诸如在Bell的美国专利4,485,096中公开，该公开全文并入本文作为参考。该网格采用结合到其中的收缩剂被收缩形成培养组织构建体。收缩剂的例子是成纤维细胞和血小板。可通过在该活的连接组织底物上铺4反角化细力包细胞并为它们的生长作准备而从该活的连接组织底物制造皮肤等效材料。这一皮肤等效材料特别地不同于前述的人造皮肤，因为其基础组构与皮肤的基础组构相同，但是其活的构成细胞甚至可通过可能的移植物接受者捐献。腺体/器官等效材料或小脉管等效材料可从本文所述的收缩的水合胶原蛋白网格形成。因此，能够看出，根据本发明制造的培养组织构建体提供了产生许多类型和功能的活组织、腺体和器官等效材料的可能性。这些等效材料甚至可被制造和作为存货保存，直到有了使用它们的需要。这种培养组织构建体的主要优点之一是它们可用在与培养组织构建体制造所用细胞的供体不同的宿主中，而不经历可能预期到的严重排斥问题。这是因为，当用于制造该活组织的细胞根据本发明进行扩增时，通过接受者的免疫系统发生了对负责排斥的细胞的选择性对抗。另外，当根据新近研究报告在某些条件下在组织培养物中保存时，某些细胞丧失了其刺激排斥的能力。水合胶原蛋白网格可以采用得自大鼠尾腱的胶原蛋白和小牛皮胶原蛋白制备。已经使用了包含人胎儿皮肤的其它胶原蛋白来源，并且其它来源应当是适当的。胶原蛋白溶液在弱酸性条件下被制备和保持。通过加入成纤维细胞与营养培养基和足够提高pH以使胶原原纤维从溶液中沉淀的碱形成网格。水合胶原蛋白网格的制备在以下的参考文献中详细描述，其教导作为参考并入本文Elsdale,T.和Bard,J.,"CollagenSubstrataForStudiesOnCellBehavior,"J.CellBiol.54,626-637(1972);Ehrmann,R.L.和Gey,G.O.，"TheGrowthofCellsonATransparentGelofReconstitutedRat-TailCollagen,"J.Natl.CancerInst,16,1375-1403(1956);Emermann,J.T.和Pitelka,D.R.,"HormonalEffectsonIntracellularandSecretedCaseininCulturesofMouseMammaryEpithelialCellsonFloatingCollagenMembranes,"InVitro,13,316-328(1977);Michalopoulous,G.和Pitot,H.C,"PrimaryCultureofParenchymalLiverCellsonCollagenMembranes,"Exp.CellRes.94,70-78(1975);Gey，G.O.Svotelis,M.,Foard,M.和Bang,F.B.,"Long-TermGrowthofChickenFibroblastsOnACollagenSubstrate,"Exp.CellRes.,84,63-71(1974);以及Hillis,W.D.和Band,F.B.,"TheCultivationofHumanEmbryonicLiverCells,"Exp.CellRes.,26,9-36(1962)。26纤维细胞和豚鼠真皮成纤维细胞。也可使用得自其它来源的成纤维细胞，并且据信，事实上，得自任何脊推动物的成纤维细胞可适用于收缩水合胶原蛋白网格。用于同时形成网格和在其中进行细胞铺板的便利技术包括使用含有成纤维细胞的营养培养基中和在培养皿中被保持的酸性胶原蛋白溶液。当中和时，胶原原纤维从溶液中沉淀形成其中成纤维细胞均匀分散的网格。细胞和胶原蛋白网格然后在允许细胞附着于胶原蛋白网格的条件下被保持，然后使其收缩形成其原始大小的一部分，从而提供活组织。将成纤维细胞结合进水合胶原蛋白网格导致当截留水被挤出时网格收缩。如果在其上形成网格的表面不是湿润的，例如，疏水板，则得到的组织具有规则的几何结构。在组织培养板上，一些细胞从网才各移动到板表面，并且网格的收缩并不总是规则的。当使用不湿润的表面诸如细菌学培养皿时，当其半径被细胞所减小时网格几乎保留成完美的圆盘形。发现成纤维细胞均一分散在整个胶原蛋白网格内并且不仅仅存在于网格的表面上。那么这模拟了人和其它哺乳动物的真皮层。在缺乏细胞时，网格的半径不经历变化。例如，通过在营养培养基中生长lxl(^个人包皮成纤维细胞持续5天而制备的条件培养基当缺乏细胞时不引起收缩。含有细胞的收缩的胶原蛋白网格类似于皮肤或真皮；即使部分地收缩，它们也具有适当的翁稠度并且可容易地进行操纵。当首先用细胞制备时，网格几乎是透明的但是当被水排出时网格逐渐变得不透明并且直径减小。在网格面积缩小20-30倍后，它们具有稳固的橡胶状黏稠度，呈带白色的浅粉红色，并且可被稍微拉伸而无撕破或变形。网格的初始直径由所用材料的数量和网格在上面形成的板来决定。因此，最大收缩是任意的测量值，但是与细胞数目和蛋白质浓度有关。尽管大部分的收缩的水合胶原蛋白网格形成为片状，但是可形成其它形状。例如，可通过在环形模具中收缩网格形成管形，或者可在适当的模具中制成皮肤手套。在活组织中获得的人皮肤角化细胞已经沉积在收缩的水合胶原蛋白网格上。已经对体外培养的角化细胞进行了相同的沉积。角化细胞的27铺板可以在基质形成时进行，在网格收缩期间的任何时候进行，或者在已经完成收缩后的任何时候进行。在铺板分离的角化细胞的悬浮液后3天内，细胞在网格表面上形成铺满层，并且角质化过程开始导致形成防止组织液损失的角化层。除了成纤维细胞之外还有其它的细胞收缩剂。在这些收缩剂中，有平滑肌细胞，横紋肌细胞和心肌细胞。通过收缩剂诸如成纤维细胞或血小板的网格收缩将胶原蛋白网格变成组织等效材料，该组织等效材料与没有使用收缩剂被铸造而成的胶原蛋白网格相比，当两者都保持在100%的相对湿度条件下时，前者具有较高的拉伸强度。在无收缩剂条件下铸造的胶原蛋白网格具有类似于新鲜明胶的黏稠度并且在操作时瓦解。通过血小板或成纤维细胞收缩的网格可进行操纵、拉伸和缝合而无损坏。通过测定可悬浮在收缩网格上的最大重量持续给定天数来试验拉伸强度。在一个实施例中，在5.3厘米直径的皿中形成5毫升体积的网格并通过成纤维细胞收缩为2厘米直径，支持3.5克重量持续7分钟。另外一份在5.3厘米直径的皿中形成5毫升体积的网格并且通过血小板从0.23厘米的高度收缩到0.09厘米的高度而未发生直径变化，其支撑11克重量持续IO分钟。值得注意的是，拉伸强度和其它性质是许多参数(包括使用的胶原蛋白和收缩剂和使用的其它添加剂的类型和量)的函数。本文描述的研究使用例如I型胶原蛋白。然而，已知III型胶原蛋白赋予皮肤和血管以额外的拉伸强度，因此可预料在本文所述的胶原蛋白网格中使用III型胶原蛋白会增加其拉伸强度。类似地，已经发现糖胺聚糖诸如透明质酸软骨素4-硫酸酯和硫酸皮肤素的加入改善了拉伸强度和水潴留性质。如果希望，也可加入抗生素诸如青霉素，链霉素和两性霉素B，防止微生物感染。尽管本文描述的大部分工作涉及通过在收缩的胶原蛋白网格上生长角化细胞而形成皮肤等效材料，但是其它细胞类型也可在网格上或内生长。其它细胞的例子是平滑肌和^f黄紋肌细胞，软骨，骨细胞，胰腺细胞，肝细胞等等。已经开发了一些方法和装置来帮助将收缩的胶原蛋白网格铸造形成具有可控尺寸和/或多种形状的片材。使用成纤维细胞作为收缩剂时，未收缩的胶原蛋白网格通常是所有的尺寸都经历收缩。然而，当边界保持被固定的片材仅仅在厚度上收缩。适用于收缩边界的装置可从具有任何形状的不锈钢网的片材制备。从不锈钢网的中心切割出要铸造的所需形状，之后，将过量的片材剪掉，在所需形状周围留下约二分之一英寸的网边缘。这形成了不锈钢网的框架，其被置于涂有防粘材料诸如Teflon⑧聚四氟乙烯的锅内，之后，引入用于形成网格的组分。当组分被倾入并形成网格时，其填充了其被锚定的钢网的空隙。当网格的细胞组分通过与胶原原纤维一起牵拉而压紧网格时，网格体积缩小，但是因为周长保持固定，因此缩小的尺寸是厚度。在该过程中，网格丧失流体。钢框架的特别优点是组织等效材料的最终尺寸正好是框架的内部尺寸大小，并且特别地，网格由于通过拘束框架所施加的细胞取向而获得附加强度。另外，因为网格尺寸在宽度或长度方面没有改变，如果其在矩形框架内铸造，即使在其被从框架中切掉之后，有可能在铸造真皮等效材料之后的第一天就施加皮肤等效材料的表皮组分到真皮等效材料上，因此从患者提供的活体解剖制备皮肤等效材料移植物所需的时间中节省了至少4天的时间。网格的组分可被倾入到附层锅内以覆盖约束网。当网格凝固时，其锚定在钢网上，从而当收缩时长度和宽度保持不变。只有厚度缩小。最终的厚度尺寸是以下的函数(l)网格的初始体积，(2)细胞浓度和(3)胶原蛋白含量。蛋白多糖诸如透明质酸和硫酸软骨素的存在导致收缩增加和网格厚度缩小。保持网格或真皮等效材料(其上接种有表皮细胞)的矩形网可原封不动地被施用于需要皮肤的伤口。尽管在适当位置上，其可立即或在以后的某一时间从钢网的内部周长中被切掉，因为其存在可帮助维持移植物的完整。另外的帮助锚定表皮到皮肤等效材料制剂的真皮等效材料上的技术和方法如下。真皮等效材料首先被铸造，将塑料片例如Teflon㊣聚四氟乙烯(其中已经穿过有针尖并以规则图形保持)覆盖在新鲜铸造物上。在l-4天后，当铸造物被接种表皮细胞时，将塑料片和针尖除去。这导致形成凹点，表皮细胞流入凹点内从而提供表皮与真皮等效材料之间的更大的表面接触。可以通过酶拆分技术分离的毛嚢细胞和腺细胞可使用表皮细胞的悬浮液接种以占据这种凹点。本文所述的活组织的主要优点是当接受者与在制造组织等效材料中所用细胞的供体不同时不存在排斥问题。例如，使用与移植物接受者的细胞不同的细胞制造的皮肤等效材料移植物目前已被用于动物寄主。如上所述被制造但是使用从Sprague-Dawley品系大鼠的雌性大鼠中获得的细胞装配的皮肤等效材料移植物已经被移植到雄性Fischer大鼠宿主中并使其保留在位持续多个周期。可以概括为任何类型的被制造而没有在自然组织中普遍存在的特化免疫细胞的等效材料移植物不会被排斥，因为负责移植排斥的抗原决定簇不在被引入到等效材料组织内的细胞的表面上表达。它们的不存在使得宿主的免疫细胞不可能判别外来细胞。这提供了置换或附加接受者所需的类型的细胞，组织或器官的机会，因为其自身是缺损的或不存在的。D:包含在胶原蛋白凝胶上成层的胶原蛋白凝胶的培养组织构建体本实施方案的培养组织构建体尽管在制备方法和用途两方面与包含水合胶原蛋白网格的培养组织构建体相似，但是其进一步包含胶原蛋白层。已经发现在与可渗透件接触的非细胞的水合胶原蛋白凝胶上铸造的胶原蛋白网格不经历实质上的半径收缩或横向收缩，尽管厚度尺寸收缩，因此无需在例如不锈钢框架上锚定胶原蛋白网格来控制半径收缩或横向收缩。例如，如上所述的24毫米直径的胶原蛋白网格但是没有锚定手段，将径向收缩到5毫米或更低的直径。相比之下，在与可渗透件接触的非细胞的水合胶原蛋白凝胶上铸造的24毫米直径的胶原蛋白网格通常径向收缩到约15毫米的直径。不需要用来控制横向/半径收缩的锚定手段在成本降低和组织等效材料制造的容易性方面提供了优点。可以理解，如果需要，这种锚定手段可被用于连接水合胶原蛋白凝胶(其与可渗透件接触)。获得本发明的组织等效材料的一个方法包括(a)形成包含胶原蛋白和至少一种收缩剂的混合物，和(b)将步骤(a)中获得的混合物施加到与可渗透件接触的非细胞的水合胶原蛋白凝胶上，并在允许形成组织等效材料的条件下保持该混合物和凝胶。30在本发明的一些实施方案中，如上所述，一个或多个吸收件，包括但不限于纤维垫，棉花垫，和凝胶，琼脂糖，用于连接上述的胶原蛋白凝胶。这种吸收件已被发现提供了始终如一的和均匀的物理支撑并且促进在组织等效材料和细胞培养基之间的均匀接触。通常，吸收件与胶原蛋白凝胶的与水合胶原蛋白网格相对的表面邻接。当吸收件自身是凝胶例如琼脂糖时，凝胶可与营养培养基一起为组织等效材料提供营养物质。在皮肤组织等效材料发育的不同阶段期间，在有和无水合胶原蛋白凝胶和/或吸收件的条件下被保持的组织等效材料中监测了以下的实验终点1.葡萄糖利用；2.表皮层化和角质化的程度和性质；3.培养基的pH。从用吸收件被保持的组织等效材料中获得的培养基的pH观察值一贯地高于在没有这些吸收件条件下被保持的组织等效材料的pH,并且接近生理学pH。另外，在用吸收剂元件保持的组织等效材料中观察到葡萄糖利用通常较低。已经意外地发现在使用吸收件制造的皮肤组织等效材料中，与未用这种吸收件制造的对照皮肤等效材料相比，成熟角质化在前者中被促进。尽管这些吸收件影响表皮分化的机制尚不清楚，但是假定这种吸收件可以担当扩散屏障例如渗透屏障，并且可过滤培养基和/或保留分泌的细胞产物极其接近组织等效材料。本发明的活皮肤等效材料如上所述被制造，不同之处在于，根据本实施方案，水合胶原蛋白网格被铸造在非细胞的水合胶原蛋白凝胶上。根据本发明制造皮肤组织等效材料的一个方法包括(a)形成包含胶原蛋白和至少一种收缩剂的混合物；(b)将在步骤(a)中获得的混合物施加到与可渗透件接触的非细胞的水合胶原蛋白上，并在允许形成组织等效材料的条件下保持该混合物和凝胶；和(c)将在步骤(b)中获得的组织等效材料用角化细胞接种。作为背景，用于铸造本发明的组织等效材料的一个方便的方法包括将pH为约3到4的胶原蛋白酸性溶液与营养培养基迅速地混合在31一起，如果必要，将得到的溶液的pH调节到约pH6.6到pH7.8,加入成纤维细胞，将得到的混合物("铸造混合物")转移到适当的^t具或铸造装置中(其中布置有非细胞的水合胶原蛋白凝胶)，然后在优选的约35。C-38。C的温度下培养。最方便的是同时进行pH调节和将铸造混合物的各成分混合的步骤。然而，这些步骤可以任何所需顺序进行，条件是这些步骤完成从而铸造混合物可被转移到用于适当凝固的模具中。由于将溶液温热和增加pH,胶原原纤维从铸造混合物中沉淀形成水合胶原蛋白凝胶，其通过收缩剂被收缩并置于水合胶原蛋白凝胶上。尽管由本实施方案提供的制造活组织的方法通常适用于制造组织等效材料，但是这些方法可与供皮肤移植应用和引入皮肤等效材料的试验系统之用的皮肤等效材料的制造结合进行说明。参见附图，图13-15说明了采用本发明的皮肤组织等效材料用于确定皮肤和一种或多种试剂之间的相互作用的装置的一个实施方案，其中多个容器10,22在其中布置有本发明的组织等效材料，并且多个容器10,22被提供在基座或支架上。图13-15中所示的装置也装配有覆盖手段2。在一些实施方案中，为每个容器10和20提供了覆盖件(未示出)。覆盖件选择任何生物相容的材料，其在容器上保持密封。可接受的覆盖材料包括箔和阻挡膜，其可借助于粘附或热而密封装置。可热密封的聚酯薄膜特别用于本发明的实践中。用于组织等效材料的容器包含外容器10和内容器20。内容器20装备有边50以提供将内容器20在外容器10内定位的手段，从而限定了外区域14和内区域22。内容器20装备有皮肤组织等效材料26,28,其布置在水合胶原蛋白凝胶25上，水合胶原蛋白凝胶25又与可渗透件24相邻。可渗透件密封附着于内容器20以形成内容器20的下表面。皮肤组织等效材料包含两层26,28,层28包含表皮层，层26包含真皮层。在一些实施方案中，密封件30提供了在内容器20的内壁与皮肤等效材料26,28之间的密封，并且在组织等效材料26,28的外缘位于水合胶原蛋白凝胶25以内的情况下覆盖水合胶原蛋白凝胶25的周长。在附图所示的实施方案中，容器IO装备有开口21,其提供了向外区域14的出cr。图15所示的装置进一步装备有吸收件32。在其它实施方案中，外室14可在其中布置有凝胶(未示出)。图16-18说明了通过利用本发明的组织等效材料确定组织和一种或多种试剂之间的相互作用的装置的另一个实施方案。与在其它所述实施方案中的部件相似的部件用相同数字表示。在本实施方案中，外侧井10是正方形的并且在底部装备有提高部分60,在该提高部分60上可布置内容器20。外侧井10形成从装置顶部的兜，而不是从装置底部朝上凸出。外侧井10装备有用于组织等效材料的营养培养基。这种培养基是本领域已知的。优选的无血清营养培养基在待审美国专利申请361,041中公开。培养基的体积必须被选择为填充外容器14到适当水平，从而形成较大压力，该压力将迫使培养基通过可渗透件24、水合胶原蛋白凝胶25、组织等效材料26,28，进入内容器20。在本发明的一些实施方案中，外容器10装备有吸收件32,其布置在外容器10内从而与可渗透件24的外表面接触。吸收件32必需与活组织等效材料相容。用于吸收件的优选材料包括棉花，聚酯和人造丝。特别优选的材料是脱脂棉。通常，优选吸收件不含添加剂诸如清洗剂。在本发明的其它实施方案中，外侧井IO装备有凝胶(未示出)，诸如琼脂糖，其用于截留培养基。因为琼脂糖凝胶可以被加入到最多为刚好低于开口21的水平，組织等效材料可获得更大量的营养培养基，对组织等效材料26,28的营养物供应不能迅速地耗尽。使用这种凝胶在本发明装置的储存和运输期间，就培养基渗漏和由此发生的组织等效材料的潜在污染最小化方面提供了益处。外容器10和内容器20可由任何所需材料制成，所述材料不与试验中的组分包括组织等效材料反应，或对其有不希望的影响。例如，用于活组织等效材料的铸造混合物在收缩期间必须不附着于内容器的壁上，从而不干扰组织等效材料的形成。已经发现对内容器20灭菌的方法可影响组织等效材料的粘附。例如，当聚苯乙烯通过电子束进行灭菌时而不是通过环氧乙烷进行灭菌时，正在形成的组织将附着于聚苯乙烯，聚苯乙烯是一种用于内容器的优选材料。相比之下，K-RESIN⑧丁二烯-聚苯乙烯，是聚苯乙烯和丁二烯的共聚物，并且是用于内容器的特别优选的材料，可通过电子束进行灭菌而不引起正在形成的组织等效材冲+发生粘附。(K-RESIN丁二烯-聚苯乙烯聚合物，是PhillipsPetroleum的商标)。在一些实施方案中，希望容器被制造为使得组织等效材料可通过容器是可视的，例如，通过容器壁或通过容器内的窗口。用于容器10的优选材料包括聚苯乙烯和PETG。内容器20可以具有将容纳所需组织等效材料的大小和形状的任何形状和体积。容器的尺寸还将根据所需组织等效材料的尺寸和形状以及所需的试验体积的不同而异。例如，外径约25毫米和体积约5毫升的容器可用于本发明的实践中。在图13-15所示的实施方案中，多个容器被提供在基座或支架内。可渗透件24必需具有足够的强度来支撑非细胞的水合胶原蛋白凝胶25和组织等效材料26,28。多孔膜可用于本发明的实践中。这种膜的孔径被选择为向非细胞的水合胶原蛋白凝胶25提供连接。优选的膜是亲水的，具有约1到10毫米的厚度，和约1到约IO微米的孔隙直径。用于可渗透件24的优选材料包括聚碳酸酯。特别优选的可渗透件是聚碳酸酯膜，优选不含润湿剂，可购自Nuclepore,具有约3到10微米的孔径。密封件30可以由任何对试验条件和使用的组织等效材料是惰性的材料制成，以及在内容器20和组织等效材料之间提供良好密封。优选的材料包括聚乙烯，TEFLON⑧PTFE聚四氟乙烯，E丄DuPontdeNemoursandCompany的商标，聚碳酸酯和尼龙。该密封件可特别用于其中希望保持外容器的内容物与施加于表皮25的任何溶液或物质分开的情况，例如当测量物质通过组织等效材料的扩散或渗透时。本发明的组织等效材料和非细胞的水合胶原蛋白凝胶二者可使用得自皮肤和腱(包括大鼠尾腱，小牛皮，和小牛伸肌腱)的胶原蛋白制备。其它的胶原蛋白来源也是适当的。得自小牛普通伸肌腱的特别优选的胶原蛋白组合物和获得这种胶原蛋白组合物的方法在02/09/1994提交的待审美国专利申请07/407,465中公开，其全文并入本文作为参考。在本发明的一个方法中，非细胞的水合胶原蛋白凝胶25从包含约0.5到2.0毫克/毫升、优选约0.9到1.1毫克/毫升的胶原蛋白和营养培养基的胶原蛋白组合物制备。该胶原蛋白组合物被加入到内容器20中并在允许胶原蛋白组合物凝固并形成适当的尺寸(通常约1到5毫米厚度，优选厚度范围为约2到约3毫米)的非细胞的水合胶原蛋白凝胶的条件下被保持。非细胞的水合胶原蛋白凝胶25优选具有足够的厚度从而使34得当细胞从组织等效材料移动进入非细胞的水合胶原蛋白凝胶中时一部分仍保持是非细胞的，并且足够薄从而使得组织等效材料不从在外容器10中提供的营养物来源中被不希望地除去。然后使用专利所述过程并且如下文所述在非细胞的水合胶原蛋白凝胶上铸造真皮等效材料。包含胶原蛋白和成纤维细胞的铸造混合物被加入到内容器20中的非细胞的水合胶原蛋白凝胶25上并在启动组织等效材料形成的条件下被保持。因为组织等效材料在非细胞的水合胶原蛋白凝胶25上形成，其径向收缩。然而，非细胞的水合胶原蛋白凝胶25防止组织等效材料的过度半径收缩而无需机械的约束手段诸如织构化金属和塑料或VELCRO⑧钩-环紧固件(VelcroCorporation的商标)。通常，组织等效材料26的侧边向水合胶原蛋白凝胶25的外周边倾斜，形成如图15和6所示的台地52。组织等效材料26目前用上皮细胞接种以形成表皮层28。表皮细胞以约0.3《106到3(^106个细胞/毫升的浓度接种在培养基中。接种的表皮细胞的体积将根据台地的尺寸的不同而异。可控制胶原蛋白的浓度，细胞的数目和铸造混合物的体积以优化活组织等效材料的直径和厚度。铸造混合物在营养培养基中包含浓度约1.25-5xl(^个细胞/毫升的细胞和约0.5到2.0毫克/毫升的胶原蛋白。优选的细胞浓度为约2.5xl(^个细胞/毫升。已经发现用于组织等效材料的铸造混合物的体积与用于非细胞的水合胶原蛋白凝胶的铸造混合物的体积的比可对细胞生活力和分化有影响。组织等效材料铸造混合物与胶原蛋白凝胶铸造混合物的有用的体积比(v/v)为约3:1到1:3。其中在胶原蛋白网格中细胞浓度为约2.5xl(^个细胞/毫升的优选比是3:l。本发明进一步参考以下实施例被理解，所述实施例实质上仅仅是示例性的，不意在用于限制本发明的范围。在以下实施例中使用的材料得自实施例中所指明的来源或者根据所指明的公开制备。整个实施例使用了灭菌过程。组织等效材料在培养箱中在10。/oC02下被保持并且整个过程使用无菌过程。提供以下实施例用于更好地说明本发明的实践，并且这些实施例不以任何方式#:解释为对本发明的范围构成限制。本领域技术人员可意识到可对本文所述方法进行改变而不脱离本发明的精神和范围。35实施例实施例1:通过人新生儿包皮成纤维细胞形成胶原基质将人新生儿包皮成纤维细胞(得自Organogenesis,Inc.Canton,MA)以5xl()5个细胞/162cm2组织培养处理烧瓶(CostarCorp.,Cambridge,MA,cat#3150)在生长培养基中接种并生长。生长培养基的组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD),补充有10%新生小牛血清(NBCS)(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。细胞在培养箱中在37士1。C和10±1%C02气氛下被保持。每2-3天将培养基更换为新制备的培养基。在培养8天后，细胞逐渐铺满，也就是说，细胞已经沿着组织培养烧瓶的底部形成单堆积层，将培养基从培养瓶中吸出。为了漂洗单层，向每个培养瓶的底部加入经无菌过滤的磷酸盐緩沖盐水，然后从烧瓶中吸出。通过向每个烧瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并温和地摇动以确保该单层面积的完整，将细胞释放。将培养物送返回培养箱，当细胞一经释放，向每个烧瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合从而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。将细胞悬浮液从烧瓶中取出并且平均分配在无菌的圆锥形离心管。通过在大约800-1000xg下离心5分钟收集纟田月包。使用新鲜的培养基将细胞再悬浮达到3.0x106个细胞/毫升的浓度，并以3.0xl0S个细胞/插入物(6.6xl()S个细胞/cm勺的密度接种到在六孔托盘中的0.4微米孔径、24毫米直径的组织培养处理插入物(TRANSWELL,CorningCostar)上。细胞在培养箱中在37士1。C和10±1%C02气氛下被保持并且每2-3天供应新鲜的基质生成培养基持续21天。基质生成培养基组成如下DMEM和HamsF-12培养基的3:1的基础混合物(QualityBiologiesGaithersburg,MD),4mMGlutaMAX-lTM(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和达以下浓度的添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hyclone:Logan,Utah),0.4|ug/ml氢化可的木〉(SigmaSt.Louis,MO),lxl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS级)，lxl(T4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma:St.Louis,),5pg/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三橫曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO)，和6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗坏血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.#013-12061),0.2pg/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)3400-3700MW(细胞培养级别)(Sigma,St.Louis,MO)。在第7、14和21天取得样品用于组织分析，并固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡中。福尔马林固定样品被包埋在石蜡中，并且5微米切片根据本领域已知过程用苏木精-曙红(H&E)染色。使用H&E染色载玻片，采用装载有10毫米/100微米十字线的10X目镜对十个随机挑选的显微镜视野测量厚度。人真皮成纤维细胞的两个不同细胞抹的结果在表1中概括，其表示当其发育成细胞-基质构建体时的厚度。厚度(微米)第0天第7天第14天笫21天B119平均数(n=3)030.33±2.6163.33±4.4084.00±4.67B156平均数(n=4)042.00±5.1463.85±4.5076.25±8.84还提交了在第7、14和21天的样品用于胶原蛋白浓度分析。通过使用本领域已知的用于羟脯氨酸含量的比色定量(Woessner,1961)测定胶原蛋白含量。还确定了在这些相同时间点下的细胞数目。表2概括了胶原蛋白浓度，表3概括了使用上面所述的过程从两个不同的细胞抹(B156和B119)制造的细胞-基质构建体的细胞数据。37表2:胶原蛋白(|ng/cm2)第0天第7天第14天第21天B119平均值(n=3)093.69±22.73241.66±21.08396.30±29.38B156平均值(n=3)0107.14±17.16301.93±23.91457.51士25.00表3:细胞数(细胞数/cm2)第0天第7天第14天第21天B119平均值(n=3)6.6xl0511.8士4.4xl0511.4士1.7xl0513.9±1.2x105B156平均值(n=3)6.6xl0513.1士0.5xl0514.0士2.1xl0517.1士1.7x105得自第7、14和21天的人细胞由来的真皮基质样品通过延迟还原SDS-PAGE,以测定揭示在样品中的I型和III型胶原蛋白a带的胶原蛋白组成。使用免疫组织化学法测定了真皮基质的生物化学特性。在石蜡固定切片上使用ZymedHistostain链霉抗生物素-生物素系统(ZymedLaboratoriesInc.,SouthSanFrancisco,CA)鉴定粘连蛋白。通过^刀级^t生腱蛋白抗体着色(Dako,Carpintheria,CA)然后是作为二级抗体的抗小鼠辣根过氧化酶标记抗体(Calbiochem)测定生腱蛋白的存在。通过施用二氨基苯炔(SigmaSt.Louis,MO)并用核坚牢红进行对比染色使样品可视。使用前述方法(Farndale,1986)定量检测第21天样品的糖胺聚糖(GAG)。该检测表明在接种后第21天取得的人细胞由来真皮基质的样品中每平方厘米存在0.44克的GAG。实施例2:全厚度皮肤构建体使用根据实施例1所述方法形成的真皮构建体，将正常人新生儿包皮表皮角化细胞(得自Organogenesis,Inc.Canton,MA)铺板在细胞-基质38层。从培养插入物及其周围无菌地除去培养基。正常人表皮角化细胞从冷冻传代培养细胞原液扩大到第4代达到铺满。然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使细胞从培养皿被释放，汇集，离心形成细胞小球，将其再悬浮在表皮形成培养基中，计数并以4.5xl0"个细胞/cn^的密度接种到膜的上表面上。然后将构建体在37士rC,10%CO2下培养90分钟以允许角化细胞附着。在培养后，将构建体浸没在表皮形成培养基中。表皮形成培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有0.4|ug/ml氪化可的松(SigmaStLouis,MO)，lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY)，lxl(T4MO-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),6.78ng/ml励(Aldrich),24.4)ug/ml腺噪呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),0.3%螯合的新生小牛血清(Hyclone,Logan,Utah),0.628ng/ml黄体酮(AmershamArlingtonHeights,IL),50|ug/mlL-抗坏血酸钠盐(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),10ng/ml表皮生长因子(LifeTechnologiesInc.,MD),和50pg/ml石克酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。构建体在表皮形成培养基中在37±1°C,10%C〇2条件下培养2天。2天后，将构建体浸没在组成如下的培养基中Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD)牙口HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1混合物，补充有0.4|ug/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),lxl(T4乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4o-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO)，5|ug/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO)，5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),24.4|ug/ml腺噤呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML國谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),0.3%螯合新生小牛血清(BioWhittaker,Walkersville,MD),0.628ng/ml黄体酮(Amersham,ArlingtonHeights,IL),50jag/ml抗坏血酸钠，265|ug/ml氯化钓(Mallinckrodt,Chesterfield,MO)，和50|ug/ml硫酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。再次将构建体在37±1°C,10%C02条件下培养2天。2天后，将含有构建体的载体无菌地转移到新的培养托盘中，该托盘具有足够量的角质化培养基(9mL),从而实现液面刚好达到载体膜的表面，从而保持干燥界面，从而允许上皮层的层化。构建体在37±1°C,10%C02和低湿度条件下在培养基中培养7天，每2-3天更换培养基。该培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的1:1混合物，补充有0.4|ug/ml氬化可的+〉(Sigma,St.Loms,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO),5pg/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Loms,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLoms,MO)，6.78ng/ml石西(Aldrich),24.4|ug/mlA泉噪p令(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),2%新生小牛血清(BioWhittaker,Walkersville,MD),50|ug/ml抗坏血酸钠，和50|ug/ml硫酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。7天后，对构建体再供料10天，每2-3天用维持培养基更换培养基。该维持培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的1:1混合物，补充有0.4|ug/ml氬化可的木〉(SigmaSt.Louis,MO),lxl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo國磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5)ug/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|ig/ml铁传递蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml励(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),24.4|ug/ml腺口票呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),1%新生小牛血清(BioWhittaker,Walkersville,MD),和50(ig/ml硫酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。提交最终样品用于如实施例1所述的苏木精和曙红染色，以在光学显微术下确定大体外观。得到的构建体由具有如实施例1所述特征的基质包围的成纤维细胞组成的较低(真皮)层构成，并且完全被多层的、层状的和充分分化的角化细胞层覆盖，该角化细胞层显示有与原地皮肤类似的基底层，基底上层，颗粒层和角质层。通过透射电子显微镜(TEM)显示，皮肤构建体在真皮-表皮接合处具有发育良好的基底膜。通过TEM可观察到，基底膜在半桥粒周围周围最厚，这通过由VII型胶原蛋白组成的锚定原纤维标记。正如所料，可容易地观察到这些锚定原纤维离开基底膜并截留胶原原纤维。层粘连蛋白(基底膜糖蛋白)的存在使用前述的-生物素免疫酶技术(Guesdon，1979)被显现。实施例3:通过人新生儿包皮成纤维细胞在化学上成分确定的培养基中体外形成胶原基质使用实施例1所述过程将人新生儿包皮成纤维细胞扩增。然后将细胞再悬浮达到3xl06个细胞/毫升的浓度，并以3.0x106个细胞/总重量(6.6xl()S个细胞/cm"的密度接种到在六孔托盘中的0.4微米孔径、24毫米直径的组织培养处理膜插入物上。然后这些细胞根据实施例1被保持，只是在整个培养基中省略掉新生小牛血清。更具体地说，培养基包含DMEM和HamsF画12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和如下添力口剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),0.4|ug/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYcat.#02400ACS级)，1x10—4Mo画磷酰基國乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5(ig/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml4失传递蛋白(Sigma,St.Loms,MO),20pM三石舆甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml励(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗坏血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.),0.2|ug/mlL-脯氨酸(Sigma,StLouis,MO),0.1|iig/ml甘氨酸(SigmaSt.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO)。使用前述过程在第7、14和21天检查样品的胶原蛋白浓度和细胞数目。结果总结在表4(细胞数目)和5(胶原蛋白)中。样品也根据实施例1所述用红染色以进行光学显微镜分析。组织学评价证明了在成分确定的培养基中生长的构建体类似于在2%新生小牛血清存在条件下生长的构建体。使用实施例l所述过程，样品也对粘连蛋白染色呈阳性。表4:胶原蛋白(iug/cm2)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>除了内源性产生原纤维胶原蛋白之外，核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于细胞-基质构建体中。实施例4:使用化学上成分确定的培养基形成的全厚度皮肤构建体在与实施例3所述方法类似的化学上成分确定的条件下从人真皮成纤维细胞形成25天的真皮构建体，将正常人新生儿包皮表皮角化细胞接种到细胞-基质构建体的上表面上，形成皮肤构建体的表皮层。从培养插入物及其周围无菌地除去培养基。正常人表皮角化细胞从冷冻传代培养细胞原液扩大到第4代达到铺满。然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使细胞从培养皿^皮释放，汇集，离心形成细胞小球，将其再悬浮在表皮形成培养基中，计数并以4.5xl(^个细胞/cm2的密度接种到膜的上表面上。然后将构建体在37±1°C,10%CO2的条件下培养90分钟以允许角化细胞附着。在培养后，将构建体浸没在表皮形成培养基中。表皮形成培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊才各尔培养基(DMEM)(不含葡萄糖和钙，BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有0.4|ug/ml氢化可的松(SigmaSt.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl(T4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|iig/ml铁传递蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml励(Aldrich),24.4|ug/ml!^嘌呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI)，4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),50|ug/mlL-抗坏血酸钠盐(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),16|uM亚油酸(Sigma,St.Louis,MO),1|tiM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO)和50]ug/ml辟^S臾庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。将构建体在表皮形成培养基中在37±1°C,10±1%C02条件下培养2天。2天后，如上所述用新鲜的培养基更换培养基，并将其送返回在37±1°C，10±1%C02条件下的培养箱中放置2天。2天后，将含有构建体的载体无菌地转移到具有足够培养基的新的培养托盘中，实现液面刚好达到载体膜的表面以保持构建体在气-液界面处发育。正在形成的表皮层的上表面的空气接触允许上皮层的层化。构建体在37士rC,10%CO2和低湿度条件下在培养基中培养7天，每2-3天更换培养基。该培养基含有Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(不含葡萄糖和4丐，BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的1:1混合物，补充有0.4|Lig/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),5xl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),5xl0-4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),24.4|ug/ml腺口票呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),2.65jag/ml氯化钾(Mallinckrodt,Chesterfield,MO),16|uM亚油酸(Sigma,St.Louis,MO),1|uM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO)，1.25mM丝氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.64mM氯化胆石咸(Sigma,St.Louis,MO)和50|ug/ml硫酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。对培养物每2-3天供料，43持续14天。在构建体被升高到气-液界面后的第10、12和14天将样品一式三份如实施例1所述进行加工用于苏木精和曙红染色，以根据光学显微术确定大体外观。得到的构建体由具有如实施例3所述特征的基质包围的成纤维细胞组成，并且被层化和分化的角化细胞层覆盖。实施例5:通过人跟腱成纤维细胞体外形成胶原基质使用与实施例1所述相同的方法，用人跟腱成纤维细胞(HATF)代替人新生儿包皮成纤维细胞，形成细胞-基质构建体。在生成培养基中21天后，也提交样品用于H&E染色，并使用实施例1所述过程测定厚度。得到的构建体经过观察，是厚度为75.00±27.58微米(n=2)的细胞基质样构建体。内源性产生的原纤维胶原蛋白，核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于该构建体中。实施例6:通过转染的人新生儿包皮成纤维细胞体外形成胶原基质使用以下过程产生转染的人真皮成纤维细胞。将一瓶jCRIP-43血小板由来生长因子(PDGF)病毒发生器(Morgan,J等)解冻，将细胞以2xl06个细胞/162cm2烧瓶(CorningCostar,Cambridge,MA)接种。向这些烧瓶提供生长培养基，在培养箱中在37士rC和10±1%C02气氛中被保持。生长培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD),补充有10%新生小牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML陽谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。在同一天，将1小瓶人新生儿包皮成纤维细胞(HDFB156)也解冻并以1.5xl06个细胞/162cm2烧瓶(CorningCostar,Cambridge,MA)铺板。三天后，向jCRIPPDGF-43病毒发生器提供新鲜的生长培养基。用上述生长培养基+8|iig/ml聚凝胺(Sigma，StLouis,MO)供应HDFB156。第二天，将HDFB156细胞进行如下转染。将得自jCRIPPDGF-43病毒发生器的用过的培养基收集并过滤通过0.45微孔过滤器。将8pg/ml聚凝胺加入到该经过过滤的用过的培养基中。然后将用过的培养基置于HDF上。在后两天，对HDF供应新鲜的生长培养基。第二天，HDF从p5传代培养达到p6,并以2.5xl06个细胞/162cm2烧瓶(CorningCostar,Cambridge,MA)的密度接种。将细44胞传代培养如下吸出除去用过的培养基，然后烧瓶用磷酸盐緩冲盐水漂洗以除去任何剩余的新生小牛血清。通过向每个烧瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸并温和地摇动以确保单层的面积完整，将细胞释放。将培养物送返回培养箱，当细胞一经释放，向每个烧瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合从而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。将细胞/胰蛋白酶/SBTI悬浮液从烧瓶中放出并且平均分配在无菌的圆锥形离心管。通过在大约800-1000xg下离心5分钟收集细胞。将细胞再悬浮在生长培养基中用于以上述密度接种。二天后细胞被供应新鲜的生长培养基。第二天，如上所述收获细胞，并在含有100/o新生小牛血清(NBCS)和10%二甲基亚砜(DMSO)(Sigma,St.Louis,MO)的生长培养基中稀释到1.5xl(^个细胞/毫升的密度。然后将细胞在约-80。C下冷动，每冷冻小瓶为1毫升。用于该实施例的胶原基质的生成采用与实施例1和3所述相同的过程，但是使用如上所述经过转化以产生高水平的血小板由来生长因子(PDGF)的人新生儿包皮成纤维细胞替换人新生儿包皮成纤维细胞。在接种后第18天如上所述提交样品用于H&E染色。还使用了抗生物素蛋白-生物素方法对样品染色以检查如实施例10所示的纤连蛋白的存在。在接种后第18天取得样品并如实施例1所述进行H&E染色，并且表现出与实施例1所述的相似的细胞-基质大体外观，测量的厚度为123.6微米(N=1)。通过ELISA在细胞-基质构建体中测量的在整个培养(18天)期间转染细胞的PDGF输出为100ng/mL,而对照的PDGF输出是不能被检测到的。实施例7:真皮构建体作为移植物材料的应用根据实施例1的方法，使用得自婴儿包皮的人真皮成纤维细胞制造细胞-基质构建体，并将其移植到在无胸腺棵鼠上产生的完全切除伤口上。根据Parenteau等(1996)所述方法对小鼠进行移植，所述公开被并入本文。在第14、28和56天检查移植物与伤口床的附着迹象，伤口收缩证据，移植物消失区域，和血管形成的存在(有色)。移植区域通过摄影检查同时在小鼠上保持原封不动。在每个时间点处死许多小鼠，并且切除移植区域及其周围区域，连同鼠皮周围边缘至少到肉膜。移植物和鼠皮之间的接合处保存在每个样品中。然后将移出的组织样品在磷酸盐緩冲的10%福尔马林中固定，并在甲醇中固定。用福尔马林固定的样品根据实施例1所述过程被加工用于H&E染色。移植物能够与鼠皮成一体，具有最小的可注意到的收缩。在移植14天内，小鼠表皮已经完全移到移植物上。使用H&E染色样品，在第14天在移植物内血管是显而易见的，并且贯穿整个实-险过程。通过大体观测和通过H&E染色样品，贯穿整个实验期间，可确定移植物存留并保留健康的外观，含有活细胞，没有大体的基质异常等。实施例8:全厚度皮肤构建体作为皮肤移植物的应用在真皮层中使用得自新生儿包皮的人真皮成纤维细胞和在表皮层中使用得自不同的新生儿包皮的人角化细胞，如实施例2所述制备双层皮肤构建体。皮肤构建体能用手从膜上剥离，不用载体制成即可被操作，并且置于移植部位上。根据Parenteau等(1996)所述的方法将该双层皮肤构建体移植到在无胸腺棵鼠上制造的全切除伤口上，该公开被并入本文。取样时间点为移植后的第7、14、28、56和184天。移植区域被摄影同时保持在小鼠上原封不动。在每个时间点处死许多小鼠，并且切除移植区域及其周围区域，连同鼠皮周围边缘至少到肉膜。在移植物和鼠皮之间的接合处保存在每个样品中。然后将取得的组织样品在磷酸盐緩冲的10%福尔马林中固定，并在曱醇中固定。用福尔马林固定的样品根据实施例1所述过程-波加工用于H&E染色。通过大体，见测以及通过组织学外观，移才直物在7天内与宿主组织成一体。通过H&E染色，在移植7天内可观察到血管逐渐从宿主组织生长进入移植物。移植物在整个实验期间仍然保持健康和被存留，具有最小的可被注意的收缩。采用抗人内披蛋白着色，人表皮细胞的持久存在显示于整个移植期间。实施例9:通过人角膜的角膜细胞体外形成基质在制造角膜的基质构建体中使用人角膜的角膜细胞(得自Organogenesis,Inc.Canton,MA)。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸将人角膜细胞的铺满培养物从它们的培养底物中释放。当被释放后，使用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸，将细胞悬浮液离心处理，弃去上清液，然后将细胞再悬浮在基础培养基中达3\106个细胞/毫升的浓度。将细胞以3.0xl0S个细胞/总重量(6.6xl()S个细胞/cm勺的密度接种到在六孔托盘中的0.4微米孔径、24毫米直径的组织培养处理插入物上。这些培养在接种培养基中保持过夜。接种培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)和HamsF-12培养基(QualityBiologiesGaithersburg,MDcat.)的3:1的基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(EGF)(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),0.4|ug/ml氢化可的松(SigmaStLouis,MO),lx10-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxlO-4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO),5pg/ml4失传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml竭(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI)。之后，向培养物供应新鲜的生成培养基。生成培养基组成如下DMEM和HamsF-12培养基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL.,GrandIsland,NY)和添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hyclone,Logan,Utah),0.4|iig/ml氢化可的松(Sigma,StLouis,MO),lxicr4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS级)，lxl(T4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5pg/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗坏血酸(WAKOpurechemicalcompany),0.2|ug/mlL曙脯氨酸(Sigma,StLouis,MO),0.1|iig/ml甘氨酸(Sigma,StLouis,MO)和0.050/0聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO,细胞培养级别)。将细胞在培养箱中在37士1。C和10%士1%C02气氛下被保持，并每2-3天被供应新鲜的生成培养基持续20天(总共培养21天)。在培养21天后，角膜细胞已经沉积成厚度为约40微米的基质层，通过实施例1所述方法测得。内源性产生的原纤维胶原蛋白、核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于细胞-基质构建体中。实施例10:通过在生成培养基中接种的人新生儿包皮成纤维细胞体外形成胶原基质人新生儿包皮成纤维细胞(得自Organogenesis,Inc.Canton,MA)在六孔托盘(TRANSWELL⑧，CostarCorp.Cambridge,MA)中以1"05个细胞/0.4微米孔径、24毫米直径组织培养处理载体在生长培养基中被接种和培养。生长培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD)，补充有10%新生小牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)。细胞在培养箱中在37士1。C和10士l。/。CO2气氛中被保持。每2-3天将更换培养基。在培养9天后，从培养皿吸出培养基，并用生成培养基替换。细胞在培养箱中在37±1°C和10±1%C02气氛中被保持并每2-3天供应新鲜的生成培养基持续21天。生成培养基组成如下DMEM和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hyclone,Logan,Utah),0.4pg/ml氩化可的木〉(SigmaSt.Louis,MO),"lCT4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS级)，lxl(T4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5|ug/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI)，50ng/mlL-抗坏血酸(WAKOPureChemicalCompany),0.2|ug/mlL-月甫氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1jug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,MO,细胞培养级别)。在第21天取得样品并固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡中。福尔马林固定样品被包埋在石蜡中，并且5微米切片根据本领域已知过程用苏木精-曙红(H&E)染色。使用H&E染色载玻片，采用装载有10毫米/100微米十字线(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)的10X目镜(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)对十个随冲几选择的显樣i镜一见野进4亍测量。使用该方法生产的构建体在结构和生物化学组成方面与根据实施例1生产的那些相似，并具有82.00士7.64微米的厚度。实施例11:通过猪真皮成纤维细胞体外形成胶原基质48将猪真皮成纤维细胞(得自Organogenesis,Inc.Canton,MA)以5><105个细胞/162cm2组织培养处理烧瓶(CostarCorp.,Cambridge,MA,cat#3150)在生长培养基中接种并生长，过程如下。生长培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD),补充有10%胎牛血清(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville，MD)。细胞在培养箱中在37士1。C和10%士1%C02气氛中被保持。每2-3天将更换培养基。当铺满时，也就是细胞已经在组织培养烧瓶的底部形成堆积层时，从培养皿吸出培养基。为了漂洗单层，向每个单层加入经无菌过滤的磷酸盐緩沖盐水，然后从培养皿中吸出。通过向每个烧瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并温和地摇动以确保单层的面积完整，将细胞从烧瓶释放。然后将培养物送返回培养箱。当细胞一经释放，向每个烧瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与细胞悬浮液混合从而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。将细胞悬浮液从烧瓶中取出并且平均分配在无菌的圓锥形离心管。通过在大约800-1000xg下离心5分钟收集细胞。然后将细胞再悬浮和稀释达到3xl()S个细胞/毫升的浓度，并以3xl(^个细胞/总重量(6.6xl()S个细胞/cm"的密度接种到在六孔托盘中的0.4微米孔径、24毫米直径的组织培养处理TRANSWELLS上。细胞在接种培养基中保持过夜。接种培养基组成如下DMEM和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnologyLakePlacid,NY),0.4|ug/ml氬化可的松(SigmaStLouis,MO),lx10-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma，NYACS级)，lxl(T4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5|tig/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5(ig/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗坏血酸(WAKOPureChemicalCompany),0.2|ug/mlL誦脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和0.1(ag/ml甘氨酸(Sigma,StLouis,MO)。细胞在培养箱中在37±1°C和10±1%C02气氛中祐:保持并每2-3天供应新鲜的生成培养基持续7天。生成培养基组成如下DMEM和HamsF-12培养基(Quality49Biologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),2%新生小牛血清(Hydone,Logan,Utah),0.4pg/ml氪化可的松(SigmaStLouis,MO),WO-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYACS级)，lx104Mo國磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,),5|iig/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5pg/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCo.,Milwaukee,WI),50ng/mlL画抗坏血酸(WAKOPureChemicalCompany),0.2|ug/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma,StLouis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,StLouis,MO)细胞培养级别。7天后用不含新生小牛血清的生成培养基更换培养基。每2-3天将该新鲜的培养基提供给细胞持续20多天，总共培养28天。在第21天取得样品并固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡中。福尔马林固定的样品被包埋在石蜡中，并且5微米切片根据本领域已知过程用苏木精-曙红(H&E)染色。使用H&E染色载玻片，采用装载有10毫米/100微米十字线(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)的10X目镜(OlympusAmericaInc.,Melville,NY)对十个随机选择的显孩"竟碎见野进行测量。样品表现出的构建体由细胞和基质组成，测量的厚度为71.20±9.57微米。除了内源性产生的原纤维胶原蛋白之外，核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于细胞-基质构建体中。实施例12:包含真皮乳头细胞的双层皮肤构建体的体外形成根据实施例1方法，使用人新生儿包皮成纤维细胞作为第一产生基质的细胞类型制造细胞-基质。将细胞-基质用作为笫二细胞群体的真皮乳头细胞进行点样局部接种，第二细胞群体用作为第三细胞群体的角化细胞进行接种，以在细胞-基质和真皮乳头细胞上形成连续的表皮层。首先，使用得自新生儿包皮的人真皮成纤维细胞(HDF)形成细胞-基质构建体，通过将HDF以5xl05个细胞/162cn^组织培养处理烧瓶^(CostarCorp.,Cambridge,MA)在生长培养基中接种并按比例增加，所述生长培养基组成如下Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(高葡萄糖制剂，不含L-谷氨酰胺，BioWhittaker,Walkersville,MD)，补充有10%新生小牛血清(NBCS)(HyCloneLaboratories,Inc.,Logan,Utah)和4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker，Walkersville,MD)。当铺满时，使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使HDF从板释放，并使用新鲜的培养基再悬浮达到3.0xl()S个细胞/毫升的浓度，并以3.0xl0S个细胞/插入物(6.6xl()S个细胞/cm"的密度接种到在六孔托盘内的0.4微米孔径、24毫米直径组织培养处理插入物(TRANSWELL,CorningCostar)上。将HDF培养物在培养箱中在37士rC和10±1%。02气氛中保持并根据实施例1所述方法每2-3天供应新鲜的生成培养基持续23天。已经形成细胞-基质构建体后，将其用作为第二细胞群体的真皮乳头细胞的进行点样接种。真皮乳头细胞是被毛嚢的毛球所包围的离散的特化成纤维细胞群体，从而在毛发生长中起到支撑作用。真皮乳头可以使用先前Messenger,A.G.所述方法(TheCultureofDermalPapillaCellsfromHumanHairFollicles.Br.J.Dermatol.110:685-9(1984))通过纤维解剖毛嚢被分离并进行体外培养，该方法并入本文。当真皮乳头细胞的培养物达到铺满时它们形成聚集体，其可以重新被铺板在培养瓶中以重新形成新的聚集体。从4周大的猪的皮肤活体组织中分离真皮乳头。将得自真皮乳头(PDP)的细胞连续地在包含20。/。NBCS的DMEM中传代培养到第8代。在培养3周后，PDP细胞重新组成真皮乳头样结构或聚集体，它们各自的直径为约90到210孩￡米。然后通过对着培养基有力地移液将聚集体从培养板中取出，然后以200个聚集体/cm2的密度接种到人胶原基质上。将聚集体在DMEM20%NBCS中浸没培养另外15天，每2-3天用新鲜的培养基更换用过的培养基。将其上含有真皮乳头细胞的细胞-基质培养物用角化细胞接种并培养，以在细胞-基质和真皮乳头上形成连续的表皮层。制造了两个不同的构建体用人角化细胞制造的第一构建体，和用猪角化细胞制造的第二构建体。使用移植长出从人新生儿包皮(HEP)或猪角化细胞(PEP)分离正常的表皮角化细胞，以建立原代培养物。然后将这些细胞培养和扩增，对于猪细胞抹传代培养直到第3代，或对于人细胞林传代培养直到第4代。培养约5到6天后，然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使细胞从培养皿释放，汇集，离心以形成细胞小球，再悬浮在表皮形成培养基中，计数，对于HEP细胞以4.5xl(^个细胞/cm2的密度接种到膜的上表面上，对于PEP细胞以1.6xl()S个细胞/cm2的密度接种到膜的上表面上。表皮51形成培养物如先前实施例2中所述培养12天。提供最终样品经过加工用于苏木精和曙红染色，用于光学显微术。得到的皮肤构建体表现出类似于皮肤的基础形态学组织由被内源性产生的基质(包括内源性产生的原纤维胶原蛋白，核心蛋白聚糖，和糖胺聚糖)包围的成纤维细胞组成的真皮层，局部的真皮乳头细胞区域，和横跨细胞-基质构建体和真皮乳头的层状的角化细胞层。在被人或者猪角化细胞覆盖的两个组织构建体中，真皮乳头保持了堆积结构，该堆积结构诱导覆盖上皮的小起伏。分化的上皮细胞通常接近真皮乳头细胞存在。实施例13:通过夹心ELISA进行透明质酸测量分别根据实施例1和3的方法在含血清的培养基和化学上成分确定的培养基中由真皮成纤维细胞形成的细胞-基质构建体中测量透明质酸(HA)。在引入多孔膜(TRANSWELL⑧，CorningCostar)的环形75毫米直径载体上形成细胞-基质构建体。通过向含有细胞-基质构建体的试管中加入10毫升的乙酸铵緩冲液和0.5mg/mL的蛋白酶K制备得自细胞-基质构建体的提取物。将混合物在6(TC培养过夜。在消解完成后，将混合物旋转分离并将上清液提取物转移到用于透明质酸测定的分离试管中。将96-孔板用50iuL在0.1MNaHC03溶液中的20|ug/mLHA结合蛋白涂覆，并在4。C保存过夜。然后用含0.05%吐温20的0.85%NaCl将板洗涤三次。然后向每个孔加入250|uL阻断溶液(石舞酸钠纟爰冲液，10mmol,pH=7.4，包含3。/。BSA和0.9%NaCl,PBS+3%BSA),将板在室温下培养2小时。然后用包含0.05%吐温20的0.85%NaCl将板洗涤三次。然后向板中加入50fi1的标准HA溶液，并且在两个实^验条件下提取，包括在这些条件下的多种稀释度。板在室温(约20。C)培养2小时。然后将板用包含0.05%吐温20的0.85%NaCl洗涤三次，并向每个孔加入50|uL的生物素化HA(1:2000稀释度)，然后在室温培养2小时。然后将板用包含0.05%吐温20的0.85%NaCl洗涤三次，然后向每个孔加入50|uL的HRP陽抗生物素蛋白D(1:3000稀释度)。然后将板在室温下培养45分钟。然后将板用含有0.05%吐温20的0.85%NaCl洗涤三次，并向每个孔中加入100|uL的邻苯二胺底物溶液。将板在37。C培养10分钟，通过添加50|iiL的1MHC1使反应停止。最后，使用读板器，在492nm读取吸光度并记录。将吸光度测量值平均化并转化为数量测量值。在含有血清的培养基中形成的环形细胞-基质构建体(75毫米直径)经过测定，各自含有约200pg的透明质酸，尽管那些在化学上成分确定的培养基中形成的构建体各自含有约1.5毫克的透明质酸。实施例14:生成的细胞-基质构建体的物理试验和机械性质通过膜膨胀试验定量测量了实施例1的组织构建体(细胞-基质构建体)，实施例2的组织构建体(其上具有角化细胞层的细胞-基质构建体)和实施例3的组织构建体(在成分确定的培养基中形成的细胞-基质构建体)的机械性质。这些试验类似于临床中所述的试验(例如，Dermaflex,CyberdermInc.,Media,PA，和Cutameter,CourageKhazaka,Cologne,Germany)但是牵涉较高的压力，包括能使膜破裂的压力。将样品细胞-基质构建体平放到聚碳酸酯块上，该聚碳酸酯块位于直径为10毫米的装满正常张力的盐水的圆筒形井的中心。将具有与圆筒形井的直径对应的圆孔的金属板放置到样片上并被夹紧到聚碳酸酯块上。然后通过用注射器泵将另外的盐水注入到孔内使样品膨胀。使用压力传感器测量最终压力。增大压力直到装置破坏，根据实施例1所迷过程制造的细胞-基质构建体的胀裂强度平均为439.02毫米汞柱；根据实施例2所述过程制造的具有角化细胞层的细胞-基质构建体样品的胀裂强度平均为998.52毫米汞柱；和根据实施例3所述方法在成分确定的培养基中形成的细胞-基质构建体样品的胀裂强度平均为1542.26毫米汞柱。为了测定真皮基质的热熔点，根据实施例1所述过程制造并在第21天取得样品(细胞-基质构建体)。使用MettlerToledo(Highston,NJ)差示扫描量热计(DSC产品存DSC12E)进行分析，测定样品的变性温度。对于此目的，通过从45°C到80°C以每分钟1°C的速率加热样品测定熔融温度。样品的平均变性温度是60.8±1.2°C(n=3)。测量了使用实施例1制造的表皮形成基质(细胞-基质构建体)和使用实施例3的过程制造的表皮形成基质(在成分确定的培养基中形成的细胞-基质构建体)的缝合保留强度和拉拔强度，以测定构建体在某些临床位置内的缝合性。使用用于血管移植假体的美国国家标准出版物(Instruments,1986)中所述方法，使用Mini-Bionex858测试系统(MTSsystemsCorporation,Minneapolis,Minn.)效'J量笫21天取得的人真皮基质的缝合保留强度。对于实施例1的样片(细胞-基质构建体)，测得的拉伸强度为365N/m;根据实施例2制备的样品(具有角化细胞层的细胞-基质构建体)，拉伸强度为2720N/m。根据实施例1制备的样品的缝合保留强度为0.14N;根据实施例2制备的样品的缝合保留强度为0.22N。已经根据实施例1、2和3所述制造了直径为24毫米和75毫米的构建体。通过所有三种方法的培养技术制造的构建体是内聚性的组织样结构，其使用最小的力即可从膜上被容易地剥离，因此是"可剥离的"，并且能够经历使用所需的物理操作和操纵而不发生损坏。实施例15:在化学上成分确定的培养基中通过人新生儿包皮成纤维细胞体外形成胶原基质使用实施例1所述过程将人新生儿包皮成纤维细胞进行扩增。然后将细胞悬浮达到3xl()S个细胞/毫升的浓度,并以3.0xl()S个细胞/总重量(6.6xl()S个细胞/cm"的密度接种到在六孔托盘内的0.4微米孔径、24毫米直径的组织培养治疗膜插入物上。在本实施例中的细胞自始自终都在化学上成分确定的培养基中培养。培养基组成如下DMEM和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添加剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),lx10—4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYcat.#02400ACS级)，1x10—4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL國抗坏血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.),0.2pg/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma:St.Louis，MO)。在各不相同的条件下向上述的基础培养基中加入其它组分1.5|ug/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO),0.4|ug/ml氢化可的松(Sigma,StLouis,MO),0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis,54MO)。2.5|Lig/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),0.4|ug/ml氢化可的松(Sigma,St.Louis,MO)。3.375jag/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO),6|ug/ml氢化可的松(Sigma,St.Louis,MO)。样片用福尔马林固定并加工用于苏木精和曙红染色，用于光学显微镜分析。可视组织学评价证明了缺乏PEG的条件2表现出与含有PEG的条件l相似的基质。测量构建体的胶原蛋白含量的生化分析表明在条件1和条件2下具有几乎相同量的胶原蛋白对于含有PEG的条件1为168.7±7.98|ug/cm2,对于不含PEG的条件2为170.88±9.07)iig/cm2。含有高水平的胰岛素和氬化可的松的条件3表现出基质(包括胶原蛋白)的更高表达，在比其它两种条件更早的时间点发生。除了内源性产生的原纤维胶原蛋白之外，核心蛋白聚糖和糖胺聚糖也存在于所有条件下的细胞-基质构建体中。通过本实施例的条件2的方法形成的培养真皮构建体如图2所示。图2表示在化学上成分确定的培养基内从培养的人真皮成纤维细胞形成的第21天的细胞-基质构建体的被固定并用石蜡包埋的苏木精-曙红染色切片的显微照片。多孔膜作为构建体下方的薄的半透明带出现，并且能够看出细胞在该膜的表面上生长，并且未4皮基质包封从而与膜成一体。图3表示通过本实施例的条件2的方法形成的第21天的培养真皮构建体的两个放大倍数下的透射电子显微镜(TEM)图象。图3A是表示在成纤维细胞之间内源性胶原纤维的校准的7600X放大倍数。图3B是表明原纤维排列和组装的完全形成的内源性胶原纤维的19000X放大倍数。在本实施例的所有条件下，形成的培养真皮构建体包括真皮成纤维细胞和内源性产生的基质。所有都在细胞之间排列的堆积基体组成中具有完全形成的胶原原纤维。它们的纤维性品质、厚度和内聚一体性赋予构建体以显著的强度，从而允许其可按照原样从培养膜被剥离取下和进行处理，被转移到要用构建体治疗的患者中，诸如在移植或植入时。实施例16:全厚度皮肤构建体使用根据上述实施例15中所述的条件2(无PEG)的方法在化学上成分确定的条件下从人真皮成纤维细胞形成的第21天的真皮构建体，在形成皮肤构建体的表皮层。从培养插入物及其周围无菌地除去培养基。正常人表皮角化细胞从冷冻传代培养细胞原液经过扩大到第4代达到铺满。然后使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸使细胞从培养皿中释放，汇集，离心以形成细胞小球，将其再悬浮在表皮形成培养基中，计数，并以4.5xl(^个细胞/cm2的密度接种到膜的上表明上。然后将构建体在37士rC,10%C02条件下培养90分钟以允许角化细胞附着。培养后，将构建体浸没在表皮形成培养基中。表皮形成培养基组成为Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(不含葡萄糖和4丐，BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologiesGaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有0.4|ug/ml氢化可的松(SigmaSt.Louis,MO),lxl(T4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),lxl0國4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5|iig/ml铁传递蛋白(Sigma,St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml竭(Aldrich),24.4)ug/ml腺嘌p令(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),50|ug/mlL-抗坏血酸钠盐(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),16亚油酸(Sigma,St.Louis,MO),1|uM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO)和50jug/ml硫酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。构建体在表皮形成培养基中在37±1°C,10±1%C02条件下培养2天。2天后，使用具有如上所述组成的新鲜的培养基更换培养基，并且送返回设定在37土1。C,10±1%。02的培养箱中持续2天。2天后，将含有构建体的载体无菌地转移到具有足够培养基以实现液面刚好达到载体膜的表面的新的培养托盘中以保持在气-液界面发育。在正在形成的表皮层上表面的空气接触允许上皮层的分层。构建体在37士rC,10%CO2和低湿度条件下在培养基中培养持续7天，每2-3天更换培养基。该培养基含有Dulbecco氏改进的伊格尔培养基(DMEM)(不含葡萄糖和钙，BioWhittaker,Walkersville,MD)和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的1:1的混合物，补充有0.4jig/ml氬化可的松(Sigma,St.Louis,MO),5xl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NY),5><10-4Mo-磷酰基陽乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰岛素(Sigma,StLouis,MO),5|ug/ml铁传递蛋白(Sigma,StLouis,MO),20pM三碘甲腺原氨酸(Sigma,StLouis,MO),6.78ng/ml硒(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),24.4jug/ml腺噪呤(SigmaAldrichFineChemicalsCompany),4mML画谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD),2.65|ug/ml氯化钙(Mallinckrodt,Chesterfield,MO),16亚油酉交(Sigma,St.Louis,MO),1|uM乙酸生育酚(Sigma,St.Louis,MO),1.25mM丝氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.64mM氯化胆碱(Sigma,St.Louis,MO)和50|ug/ml硫酸庆大霉素(Amersham,ArlingtonHeights,IL)。培养物每2-3天被供应，持续14天。在构建体被提高到气-液界面后提交在第10、12和14天的一式三份的样品用于如实施例1所述的苏木精和曙红染色，以通过光学显微术确定大体外观。得到的构建体是双层皮肤构建体，其由^皮基质包围的真皮成纤维细胞形成的下层真皮层和其上覆盖的分层和分化的角化细胞的上层表皮层组成。本实施例的双层皮肤构建体如图4所示。图4是在不含外源性基质组分的条件下在化学上成分确定的培养基中形成的培养皮肤构建体的被固定并用石蜡包埋的苏木精-曙红染色切片的显微照片，成纤维细力形成的细胞-基质构建体，其具有在化I上1分确定的培养基中从培养人角化细胞形成的多层的分化表皮。实施例17:通过人面颊成纤维细胞形成胶原基质本实验的目的是从人颊组织分离的面颊成纤维细胞制造细胞-基质构建体。颊细胞在T-150烧瓶内在含10%NBCS的DMEM培养基中培养。7天后，为了进一步扩增细胞数目，收获颊细胞并以4.0xl()S个细胞在含10%NBCS的DMEM培养基中传代培养到9个T-150烧瓶中并进行培养直到在收获细胞时达到铺满。为了收获细胞，从培养瓶吸出培养基。为了漂洗单层，向每个培养瓶的底部加入经过无菌过滤的磷酸盐緩冲盐水，然后从烧瓶中吸出该磷酸盐緩冲盐水。通过向每个烧瓶中加入5mL的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸谷氨酰胺(BioWhittaker,Walkersville,MD)并温和地摇动以确保该单层57面积的完整使细胞释放。将培养物送返回培养箱。当细胞一经释放，向每个烧瓶加入5ml的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制剂)并与悬浮液混合从而使胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的作用停止。将细胞悬浮液从烧瓶中取出并且平均分配在无菌的圆锥形离心管。通过在大约800-1000xg下离心5分钟收集细月包。使用新鲜的培养基将细胞再悬浮达到3.0x106个细胞/毫升的浓度，并以3.0xl(^个细胞/插入物(6.6xl0S个细胞/cm"的密度接种到在六孔托盘中的0.4微米孔径、24毫米直径的组织培养处理插入物(TRANSWELL,CorningCostar)上。细胞在培养箱中在37土1。C和10±1%C02气氛下被保持并且供应培养基，所述培养基含有DMEM和HamsF-12培养基(QualityBiologies,Gaithersburg,MD)的3:1的基础混合物，补充有4mMGlutaMAX(GibcoBRL,GrandIsland,NY)和添力。剂5ng/ml人重组表皮生长因子(UpstateBiotechnology,LakePlacid,NY),0.4|ug/ml氬化可的松(Sigma，St.Louis,MO),Ixl0-4M乙醇胺(Fluka,Ronkonkoma,NYcat.#02400ACS级)，lx10-4Mo-磷酰基-乙醇胺(Sigma,St.Louis,MO),5|ug/ml胰岛素(Sigma,St.Louis,MO),5fag/ml铁传递蛋白(Sigma，St.Louis,MO),20pM三碘曱腺原氨酸(Sigma,St.Louis,MO),和6.78ng/ml石西(SigmaAldrichFineChemicalsCompany,Milwaukee,WI),50ng/mlL-抗坏血酸(WAKOChemicalsUSA,Inc.),0.2|ug/mlL-脯氨酸(Sigma,St.Louis,MO),0.1|ug/ml甘氨酸(Sigma,St.Louis,MO)和0.05%聚乙二醇(PEG)(Sigma,St.Louis，MO)。接种后第l天，用无血清的生成培养基更换培养基，每2-3天更换培养基，持续21天。在21天后，将样品固定在福尔马林中用于组织学检查。三个样品用于蛋白质和胶原蛋白生成分析。对于24毫米直径的构建体，在培养21天后每个构建体中的胶原蛋白生成平均为519|ug。对于24毫米直径的构建体，在培养21天后每个构建体的总蛋白生成平均为210pg。在形态学上，颊成纤维细胞-基质构建体，作为口腔结締组织的培养组织构建体，表现为物理上祐i质包围的颊成纤维细胞，该构建体具有物理体积和完整性。实施例18:通过使接种有成纤维细胞的胶原蛋白网格收缩来制造组织等效材料58粗品胶原蛋白溶液如下制备。将得自450克大鼠的冷冻大鼠尾在70%EtOH中解冻持续20分钟。在层流净化罩中在70%EtOH中切除腱束。将每个腱从腱鞘中拉出，切碎并置于稀乙酸(1:1,000)中，每个尾巴使用250毫升稀乙酸。该溶液在4。C放置48小时。此时，切碎的腱已经膨胀以占据整个体积。该粘稠溶液在BeckmanL超离心机中在SW25转子下以23krpm下离心1小时。抽出上清液并在4。C储存，作为粗品胶原蛋白溶液(蛋白质"C")。精制胶原蛋白溶液如下制备。将粗品胶原蛋白溶液与0.1M的NaOH以6:1的比混合以中和乙酸，此时胶原蛋白沉淀。该溶液在临床离心机中以1500rpm离心5分钟。弃去上清液，并将等体积的新制备的乙酸(1:1,000)引入以使胶原蛋白再溶解。该溶液在4"C储存，作为精制胶原蛋白溶液(蛋白质"R")。蛋白质浓度通过Lowry等的方法测定。参见，Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,N.J.和Randall,R.J.,J.Biol.Chem.,193,265-275(1951),和Waddel,W.丄，J.LabandClin.Med.48,311-314(1956)。在60毫米Falcon细菌皿中制备蛋白质网才各，成纤维细胞对该细菌皿的粘附差。每个皿含有1.0ml5XMcCoy氏5a培养基，1.0ml胎牛血清，0.25ml0.1MNaOH,1.5ml胶原蛋白溶液，和1.0ml悬浮在IXMcCoy氏培养基的成纤维细胞。该亚首先用上述体积的McCoy氏培养基、血清和NaOH装满，然后放置一边直到形成了成纤维细胞混悬液。在同时加入月交原蛋白溶液和成纤维细胞时速度是重要的，以为凝月交立刻开始凝固。将皿置于37。C,5%。02气氛和100%湿度的培养箱中。结合成纤维细胞的凝月交在10分钟后完全凝固。使用的成纤维细胞是人包皮成纤维细胞，1519株，得自N.J的Camden的用于医学研究结构的人基因细胞保藏中心。这些细胞在含有20%血清、青霉素和链霉素的McCoy氏5a改进培养基中生长和保持。培养物不含枝原体。制备了M.I.T.细胞培养物核心并冷冻了每十个的群体倍增水平(PDL)的细胞。为了测量网格直径，将皿置于以黑暗作背景的透明公尺的顶端。通过用白光对着皿的边缘照射获得凝胶边缘的最佳可见度。收缩的凝胶是充分形成的碟形物；它们在不同点的直径有极微小的差别。取长轴和短轴的平均值作为直径。实施例19:测量通过成纤维细胞导致的水合胶原蛋白网格的收缩测定了根据实施例18的过程并含有570)ug/ml的蛋白质"C"由7.5><106个人包皮成纤维细胞的第19PDL(19thPDL)的1519抹制造的水合胶原蛋白网格的收缩。在第1、4和8天更换该皿内的培养基。将获得的数据绘制成图3,图2表示在七天内网格区域缩小112倍。在1天内，区域收缩7^f咅。实施例20:具有不同蛋白质浓度的水合胶原蛋白网格的收缩在水合胶原蛋白网格中蛋白质浓度对网格收缩的作用如下测定。根据实施例18的过程制备了三个水合胶原蛋白网格，不同之处在于各自含有不同浓度的蛋白质"R"。使用人包皮成纤维细胞株1519(第19PDL),并且在第4天更换培养基。将得到的数据绘制成图4,在图4中能够看出网格收缩率与凝胶蛋白质浓度成反比。网格区域随着时间的推移而缩小。实施例21:细胞数目对水合胶原蛋白网格收缩的作用细胞数目对水合胶原蛋白网格收缩的作用如下测定。根据实施例18的过程制备了许多含有720pg/ml的蛋白质"R"的水合胶原蛋白网格。使用了人包皮成纤维细胞抹1519,并且在第3、7和10天更换每个培养物中的培养基。使用没有加入细胞的对照。另外，进行了四个系列的实验，其中加入不同数目的细胞。将得到的数据绘制成图5，在图5中每个点表示三个或四个网格收缩的平均值。偏差未显示，因为它们都非常小((<.+-丄0mm)。可以看出，细胞数目确实对基质收缩率有影响，但是这种收缩差异作为时间的函数变得不那么显著。对于高于一些最小值的浓度而言，网格直径接近共同的较小值。在最小值以下，基质收缩率和细胞数目之间的关系明显是非线性的。具有8.1xl(^个细胞的基质在24小时内不发生收缩。在整个试验期间，这些细胞稀少的基质比细胞较稠密的网格滞后很多。60实施例22:具有不同PDL的细胞的水合胶原蛋白网格的收缩能力如下测定了具有不同的群体倍增水平(PDL)的细胞(经历不同的细胞分裂次数的细胞)的水合胶原蛋白网格的收缩能力。制备了培养物，其从根据实施例18的过程并且含有720lug/ml蛋白质"R"制备的由水合胶原蛋白网格形成。在第3、7和10天更换培养基。对照培养物不含细胞。另外，进行了一系列使用具有不同PDL的细胞的试验。将收集的数据绘制成图5,在图5中每个点表示三个或四个基质收缩的平均值。偏差〈.十-.1.0mm。能够看出，第35PDL(35thPDL)的细胞与第19PDL的细胞相似，但是第50PDL(50thPDL)的细胞不能以相称的速率使网格收缩。实施例23:细胞松弛素B对细胞收缩水合胶原蛋白网格的能力的作用如下测定抑制剂细胞松弛素B对细胞收缩水合胶原蛋白网格的能力的作用。根据实施例18制备水合胶原蛋白网格，其含有含量为570pg/ml的蛋白质"C"。在培养物中的成纤维细胞(人包皮，1519抹，第19PDL)细胞浓度是5.0x105。向每个培养物中加入10.0|ug/ml的细胞松弛素B,并且在第4和8天更换培养基。将得到的数据绘制成图6,并且可以看出，这一浓度的细胞松弛素B完全阻断基质收缩，即使在使用比较高的细胞浓度条件下也是如此。实施例24:秋水仙酰胺对胶原蛋白网4M史缩的作用抑制剂秋水仙酰胺对蛋白质基质收缩的作用如下测定。根据实施例18的过程并含有570貼/ml的蛋白质"C"制备了含有水合胶原蛋白网格的培养物。向每个培养物中加入0.36|ug/ml的秋水仙酰胺，除了对照不含秋水仙酰胺之外。向试-睑培养物和对照培养物中都加入相同数目的细胞，将得到的数据绘制成图7。可以看出，第45PDL(45thPDL)细胞优于第19PDL细胞的性能，而第45PDL的未经处理的细胞落后于第19PDL未经处理的细胞。显然秋水仙酰胺可用于调节基质的收缩率和收缩程度。实施例25:阿糖月包苦对由不同PDL的细胞引起的61胶原蛋白基质收缩的作用。如下检测1.0ng/ml的阿糖胞苷对不同PDL水平的细胞的蛋白质基质收缩作用。制备了含有浓度为570pg/ml的蛋白质"C"的水合胶原蛋白网格的培养物。将第19PDL和第47PDL(47thPDL)的人包皮成纤维细胞林1519加入到不含阿糖胞苷的对照培养物和包含阿糖胞苷的试验对照培养物中。将得到的数据绘制成图8,在图8中能够看出第47PDL细胞优于较低PDL的细胞，即使它们总数较少。在这些实验中，阿糖胞苷用来阻断DNA合成并从而保持网格中的细胞数目恒定。实施例26:采用人包皮成纤维细胞和角化细胞形成皮肤等效材料根据实施例18的过程并含有500pg/ml的蛋白质"C"制备水合胶原蛋白网格。用EDTA和胰蛋白酶的溶液将在活体中获得的人包皮成纤维细胞从培养板上取下。将单细胞悬浮液离心形成细胞小球，之后将细胞再悬浮在培养基中，然后在已经引入成纤维细胞后将其沉积到水合胶原蛋白基质的上表面上持续7天。3天内，角化细胞已经附着于网格底物上，并且角质化过程开始导致形成不透性的胶质层。通过电子显微镜检查进行组织学观察。实施例27:采用豚鼠皮肤成纤维细胞和角化细胞的皮肤等效材料的体内研究从豚鼠取得皮肤活组织并且手术从表皮上分离出真皮。将真皮酶促分解成构成型细胞，将其铺板在组织培养皿上并使其经历增殖。将得自各实验动物的细胞在单独的培养皿中生长，使得它们的同一性得以保持。根据实施例18的过程但是不使用得自豚鼠的成纤维细胞形成收缩的水合胶原蛋白网格制造组织。一些网格在收缩后根据实施例26用得自第二活体解剖的表皮细胞或者角化细胞铺板，从而使得在每个移植物中的角化细胞以及成纤维细胞来自将变为移植物接受者的动物。将这些皮肤等效材料移植到实验动物(豚鼠)的背部，并且发现这种移植物在1周内在所有水平下都完全一体化。之后，它们出现新血管形成；在真皮水平，移植物的胶原原纤维与围绕宿主组织的胶原原纤维混杂。在组织切片中，移植物的区别之处在于，通过偏光显微镜观察，与其周围皮肤相比，移植物具有高的成纤维细胞密度并且双折射程度降盖，许多细胞深入。该层与邻接的宿主皮肤层相连。还很清楚的是皮肤伤口收缩通过皮肤等效材料的存在被移植，与当进行自体移植时的一样。实施例28:采用大鼠皮肤成纤维细胞、真皮和表皮细胞的皮肤等效材料的体内研究皮肤等效材料的形成将得自潜在的移植接受者的小型活体解剖物切割成1.0mm2的碎片。从碎片中得到成纤维细胞并且在Lux组织培养皿上繁殖，在4-7天后，除去碎片并弃去或被转移到新板中。在一个或多个板上的细胞被允许繁殖直到它们几乎铺满，此时，通过用胰蛋白酶处理取得细胞，洗涤，并在组织培养瓶中繁殖。每平方厘米皮肤等效材料需要约5xl(^个细胞，并且通过使用胰蛋白酶使其从底物中释放而获得适当数目的细胞，之后，将它们悬浮并与胶原蛋白溶液、大鼠血清和组织培养基结合。通过在0.02M乙酸中提取大鼠尾腱并离心纯化获得胶原蛋白。当在酸性pH和1.5mg/ml蛋白质浓度下保持时，胶原蛋白是粘性的微乳白色溶液。其只由I型胶原蛋白组成，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不到污染蛋白质。此时，月交原蛋白与细胞及其他成分组合，用NaOH调节pH到7.2,这引起胶原蛋白从溶液中以原纤维形式析出。当发生这种现象时，形成了其中截留有液体的凝胶或网格。网格中的细胞在不同程度上均匀分布在其中。通过细胞的胶原原纤维的活性压实过程，网格变成牢固性一致的组织。结果是丧失截留液体，并且原始网格的体积缩小多倍。得到了构成皮肤等效材料(DE)的组织。附加的表皮通过胰蛋白酶从活体解剖碎片中解离出表皮细胞，将其作为悬浮液形式分配到皮肤等效材料上。2-4天内，表皮细胞形成覆盖皮肤底层的连续片状物。在此期间，铺满的细胞片状物开始分化。细胞桥粒连接、张力丝和透明角质粒是明显的，并且进行的角质化过程导致形成不透水的底部角质层。如果允许可在DE上体外进行整个过程。然而，在本研究中，认为一旦表皮细胞形成铺满片状物(其充当皮肤等效材料(SE))时活的双层组织即可用于移植。将皮肤等效材料移植到许多大鼠上，得到以下结果。首先，在移植后3-5天，移植物开始发生血管形成并且迅速地进行，没有发生坏死或者缺血。其次，极少例外地，被抑制的移植物将收缩。当制造移植物时，与移植物邻接的正常皮肤的周边^L刺紋(tatoo)以标记移植物的界限，其是能够随着时间检测移植物大小的过程。伤口收缩被抑制的例外情况应归于皮肤等效材料被表皮最初覆盖不充分，使得移植物由于动物的原因而发生移位，或者应归于形成了不适当的网格，其随使用的collen制剂的质量而变。在绷带被取下(9-14天)时检查31个这种移植物的研究中，7个完全抑制伤口收缩，15个阻断收缩达75%以上，23个阻断达50%以上。在关于52个移植物的另一个研究中，在移植物的至少75-80%中阻断伤口收缩。尽管许多移植物显示了随着时间其尺寸缩小，但是大部分经过第60天时仍是稳定的并且没有排斥发生。具有良好表皮覆盖的大尺寸(约8xl2cm)的移植物有效阻断伤口收缩(75%以上)并且当置换烧伤皮肤时可良好地纟皮取得。移植物长久保持，最长在位时间超过2年。除了血管形成充分之外，皮肤等效材料的基质在移植后的头几个月经历显著的重塑。其结构变化通过检查组织切片的双折射程度进行研究，从组织切片的双折射明显可见，基质在移植后一周表现出双折射，该现象在相比时期内的肉芽组织中观察不到。尽管双折射的强度随时间而增加，但是其^^各局通常不是正常真皮的方平组织构造特点之一。然而，到达10周时，在移才直物与正常组织相遇的渐变区域内，方平组织才各局开始形成。在体内，表皮过度生长，并且，甚至在移植后十周，显著厚于邻近的正常组织。可见舌状物或者栓状物(pegs)或者表皮穿透皮肤等效材料。外表上，经过几个月时间，表皮稍微呈鳞状，并且移植物具有略带红色的浅粉色。经过大约三个月，移植物变得光滑并且呈粉红色，在颜色方面类似于大白鼠的正常皮肤的颜色，但是没有毛发。多鳞程度持续甚至达七个月，这可归因于皮脂腺的缺乏。64实施例29:胶原蛋白网格通过血小板而收缩制造组织等效材料过时血小板浓缩物得自Mass.的Boston的红十字血液中心。大鼠和猪的尾腱胶原蛋白根据实施例18所述被提取；猪皮胶原蛋白由波士顿的Shriners'BumsInstitute的PaulEhrlich博士提供；telogen，一种牛胶原蛋白，得自加利福尼亚州的PaloAlto的CollagenCorporation胶原蛋白浓度测定使用Waddel的方法的改进法进行。参见，Waddel,W.J.,J.LabandClin.Med.48,311-14(1956)。使用下式|ig/ml=0.D.215-O.D.225/64.6。将得自RedCross的血小板浓缩物浓缩到60x,并通过以500rpm在使用253转子的IECPR-2离心机中在4°C离心50分钟被进一步浓缩以除去红细胞。然后使用相同的转子将上清液以1500rpm离心另外的50分钟以浓缩血小板。取出上清液并用于将获得的血小板小球再悬浮。绝对血小板浓度根据供体血液中血小板浓度的不同而在实验之间有差别，品或合并的样本。lx的血小板浓度等于在1.0毫升血液中的血小板浓度。通过按次序合并以下物质而铸造血小板网格2.3mlDMEM1.76x培养基(FlowLaboratories),1.5ml大鼠尾腱胶原蛋白，0.25ml0.1NNaOH(中和胶原蛋白所需的NaOH的浓度根据所使用的胶原蛋白制剂的酸性多少不同)，和0.45mlFBS(FlowLabomtories)。将该混合物倾入到60毫米的Falcon0007培养亚中，该培养皿已经在其表面上滴加了几滴0.5ml的5x血小板浓缩物。作为替代，将所有成分在单独的容器中混合并倾入到空的培养皿中。得到的网格在37。C,90%空气/10%(:02气氛和100%湿度下培养。网格厚度通过增加或减少铸造的总网格体积来控制。在作为铸造过程的函数的网格收缩速率方面没有观察到差异。首先将被网格释放的液体汲取到1毫升移液管中，之后汲取到更大的移液管中，然后记录汲取液体的体积，之后将汲取的液体送返回皿中测定收缩率。每小时重复进行这些测量，直到网格最大限度地收缩。在这些具有lx或更低的血小板浓度的网格中，首先使用精细解剖刀使网格边缘先离开亚，从而释放在网格下方被截留的液体用于测量。因为网格当被撕破时将释放另外的液体，小心地防止网格被破坏，从而获得仅仅通过血小板收缩而被释放的液体的测量值。还进行了旨在测定添加凝血酶(SigmaChemicals)的效果的实验，通过在加入混合的DMEM胶原蛋65白、NaOH和FBS之前在培养亚上以不连续的小滴点样凝血酶和血小板浓缩物进行。图9是获得的数据的图表，其说明了凝血酶对血小板导致的胶原蛋白网格收缩的作用，凝血酶浓度是4.0单位/毫升。图10是说明网格收缩-血小板浓度的曲线，凝血酶的存在浓度是4.0单位/ml。能够看出，反应非常迅速。在lx的血小板浓度下，在铸造网格后的三小时释放总液体的80-90%。经过六个小时，反应基本上完成并且获得平衡；也就是说，在100%的湿度条件下不再观察到液体释放。此时，最初液体体积的20-80%已从网格被排出，精确的量根据血小板和胶原蛋白浓度以及其它的铸造培养基变量的不同而异。血小板网格收缩过程导致形成的组织等效材料同在没有血小板条件下铸造的胶原蛋白网格的组织等效材料相比具有比较高的拉伸强度。当将凝血酶引入到具有足够数目的血小板的铸造混合物中时，组织等效材料更迅速地形成，如图2所示。含有凝血酶的组织等效材料具有的性质多少不同于在没有凝血酶条件下铸造的组织等效材料的性质，其拉伸强度稍微低并且其流体含量较低。通过在铸造后将克重系在组织等效材料上并烦'J量断裂时间来测量拉伸强度。血小板网格的收缩率与血小板浓度有关。血小板浓度的增加加速了网;^各收缩率，并导致网才各成比例地具有更少的液体，这可参见图10。实施例30:蛋白质的浓度和类型对血小板引起的收缩的影响蛋白质的浓度和来源对血小板引起的网格收缩的作用通过采用得自不同来源的胶原蛋白以不同浓度测定，但是在别的方面遵循实施例29的过程。得到的数据绘制成图11A-11D。能够看出，铸造培养基的胶原蛋白含量的增加会降低收缩率和液体排出量。这些结果通常与当使用成纤维细胞作为收缩剂时获得的那些相对应。采用的得自四个不同来源的胶原蛋白的作用相似，只是telogen表现出比来自其它三个来源的胶原蛋白显著更低的抗收缩性。实施例31:抑制剂细胞松弛素B和秋水仙酰胺对血小板引起的胶原蛋白网格收缩的影响抑制剂细胞松弛素B和秋水仙酰胺对血小板收缩水合胶原蛋白网格的能力的影响根据实施例29的一般过程进行，除了以下不同将细胞松弛素B(SigmaChemicals)和秋水仙酰胺(CIBAPharmaceuticalCompany)直接加入到浓的DMEM培养基中，得到的最终浓度分别为在5毫升网格中为10|ug/ml和0.5|iig/ml。将得到的数据绘制成图12。能够看出，在细胞松弛素B存在条件下用血小板铸造的网格不能收缩。另一方面，秋水仙酰胺对网格收缩无明显影响；这是可被预料的，因为已知秋水仙酰胺对人血小板使纤维蛋白凝块收缩的能力没有影响。另一方面，细胞松弛素B使血小板的盘形状稳定并防止形成变形足。实施例32:兔移植物通过血小板收缩从水合胶原蛋白网格形成的并适于移植到兔耳上的组织等效材料如下制备。通过耳刺扎从潜在的移植接受者取得的10毫升的兔血中收集血小板，并如实施例29所述通过差速离心进行浓缩。也根据实施例29的过程铸造兔血小板凝胶。收缩后，根据实施例28的过程，用得自相同兔的活体的表皮细胞对网格接种。通过剪去被麻醉兔的移植部位的毛发用于准备移植。画出移植床的轮廓，将刺紋标记置于刚刚位于轮廓周边的外侧。该部位用70%的乙醇洗涤，并且除去下方所有的组织直到覆盖软骨的筋膜。从皿中取得组织等效材料并置于移植床上，移植物的边缘稍微重叠移植床的边缘。移植物用公认安全的薄纱覆盖，所述薄纱通过用凡士林浸渍Telfa垫制得。将浸泡在Earle氏盐溶液中的Telfa垫置于公认安全的薄纱上方。在耳朵包扎。为了预防兔使绷带发生移动，、将两只耳用三英寸;性塑料绑在二起。移植七天后除去绷带。为兔配备Elizabethan领以防止擦伤持续另外两天。从兔耳切除作为一整片的移植区和正常皮肤边缘，并浸没在位于0.03M磷酸盐緩冲液中的10%福尔马林中。将皮肤固定过夜，用蒸馏水漂洗，用乙醇脱水，在醋酸戊酯中清洗，然后用曱苯清洗，并包埋到Pamplastt中。使用轮转切片机切割出七微米的切片，并将这些切片用苏木精和曙红染色。在所有的实验中移植物被接受并且抑制了伤口收缩。大体上，移植物比周围皮肤更苍白，表面略微呈鳞状并且没有毛发。甚至在6周后，在中心还残留有小痂。对布置在位达六周的移植物部分地进行了组织学检查，以确定移植物被周围组织的成纤维细胞渗透的程度。移植物中成纤维细胞的密度显著大于邻近组织中成纤维细胞的密度。通过在光学显微镜下观察到双折射水平降低而使移植物与周围组织区别开来。移植物中的血管形成似乎高于邻近组织中的血管形成。通过缺少继发衍生物即毛嚢和皮脂腺而使移植物与周围组织进一步区别开来。移植物的表皮覆盖物显著过度生长。实施例33:在大鼠中皮肤等效材料的排斥的体内试验皮肤等效材料的形成从雌性Fischer-344大鼠(CharlesRiverBreedingLabs)的背面除去小块皮肤。将这些活组织用外来组织平^f,切成2-3mn^的片，并在Lux组织培养亚的表面上干燥。将得自该活组织的成纤维细胞在Dulbecco氏改进的伊格尔极限必需培养基(DMEM)中在10%C02气氛中在37°C培养，所述培养基补充有10%的胎牛血清，青霉素，链霉素和两性霉素B(FlowLaboratories)。胶原蛋白网^^各根据实施例28的过程制备。简要地讲，在100毫米塑料皿中将2-8xl()S个成纤维细胞与补充有10%的胎牛血清、抗生素的浓DMEM和6mg的鼠尾胶原蛋白在以1:1000稀释的乙酸-水中混合。一周之内，成纤维细胞已经使胶原蛋白网格收缩，并且将从新鲜的活组织分离的表皮细胞悬浮液在网格的表面上成层。将10,M的霍乱菌毒素，20|ug/ml的表皮生长因子和0.4|ug/ml的氢化可的松加入到培养基中以促进表皮细胞的生长，并将皿移到5。/。C02的空气中。一周之内，表皮细胞在胶原蛋白网格的表面上形成铺满的片，该皮肤等效材料准备好可用于移植。为了试验异源移植，从得自雌性SpragueDawley大鼠的细胞制备网才各并移植到雄性Fisher大鼠。68移植过程将重约350-400g的雄性Fischer大鼠用苯巴比妥钠麻醉。通过从每只动物的后背除去全厚度皮肤而准备出与网格大小约一样大的移植床。将网^f各置于伤口中并用浸渍有凡士林的Telfa垫和浸泡在Earle氏盐溶液中的Telfa垫覆盖。通过使用几个弹性塑料层包扎躯体而覆盖这些绷带。在最初进行移植后，以9天到13个月的不等时间间隔，将动物再次麻醉，并且切割整个移植物。将一半移植物固定在用磷酸盐緩沖的福尔马林中，在乙醇中脱水，并包埋到石蜡中。将另一半移植物的中心部分修剪去下方的脂肪组织，切成2-3mm3的片并置于组织培养物中以允许存在的成纤维细胞长出。染色体组型的准备将从移植物长出的成纤维细胞群传代培养以获得3-6个T-150烧瓶的迅速分裂细胞。将成纤维细胞用2|ug/ml的秋水仙碱处理四小时，摆脱烧瓶，在低渗培养基(1份DMEM对3份蒸馏水)中溶胀，在载玻片上空气干燥，并用乙酸地衣红染色。在每个时间点拍摄20-30个完整的染色体伸展(chromosomalspread),并准备染色体组型用来测定在总成纤维细胞群中母细月包的比例。雄性Fisher宿主接受并保持含有Sprague-Dawley母细胞的移植物，这根据在之后1-2个月中在移植物中母细胞的存在来确定。实施例34:皮肤组织等效材料试验系统的准备A.使用如图17所示装置进行如下所述的操作。除去盖子用于操作，否则盖子被保持在位以维持无菌。关于该仪器的相关信息如下所列外容器10:直径38毫米容量35毫升内容器20:直径24毫米容量4毫升可渗透件24:聚碳酸酯膜得自Nuclepore，孔径大小3jum，厚度5jumB.在可渗透件24上如下形成非细胞的水合胶原蛋白凝胶:(1)预混合料10XMEM16.2mlL-谷氨酰胺(200mM)1.6ml庆大霉素(50mg/ml)0.2ml胎牛血清18.0ml碳酸氬钠(71.2mg/ml)5.0ml在50毫升管(未通气)中将储备溶液以上述顺序在37。C混合，并在4。C储存约30分钟。(2)将27.8g的在0.05%v/v乙酸中的1mg/ml胶原蛋白溶液(从小牛普通足趾伸肌腱中提取的)称重到50毫升管中并在4。C储存30分钟。(3)加入8.2毫升的上面描述的预混合料和4毫升的完全DMEM(含有10%FBS,4mML-谷氨酰胺，50|ug/ml庆大霉素)，并将1毫升小份移液到内容器20中并使其在遮盖下胶凝。C.如下所述使用人真皮成纤维细胞铸造组织等效材料并用人表皮(上皮)细胞接种。过程和试剂的一般说明也可在所述专利和1989年6月5日提交的共同待审申请07/361,041中发现。(1)铸造混合物将8.2毫升的上面描述的预混合料加入到如上面步骤A(2)所述的7027.8g的在0.05%v/v乙酸中的1mg/ml胶原蛋白溶液中，并混合4毫升的人真皮成纤维细胞(2.5xl()S个细胞每毫升)。将3毫升小份移液到容器20中并置于在上面步骤B(2)中形成的非细胞的水合物胶原蛋白凝胶上并允许胶凝。将4.5毫升的DMEM完全加入到外容器20中，然后在36°C/10%CO2中培养，典型地培养4-8天。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在有些情况下，将1.8mM的氯化钙加入到培养基中，这表示为培养基+钙，例如mSBM+钙。D.在铸造组织等效材料后6天开始表皮形成。(1)表皮形成将上面步骤C的培养基从内容器20和外容器10中除去。将50)ul的人表皮细胞的悬浮液(3.33><106个细胞/毫升)置于在上述步骤C中形成的组织等效材料上。然后将容器在36。C和10%CO2中培养24小时。然后向外容器中加入12.0毫升的mSBM并向井中加入4毫升的mSBM，然后将容器送返回相同的培养箱中。(2)分化在表皮形成后的第2天，除去培养基并用mSBM+钙置换培养基。(3)空气接触在表皮形成后5天，进行以下过程/人外容器和内容器中除去培养基。将内容器20取出并将两体积的浸渍有cSBM+钙的棉花垫置于外容器10的底部并加入9.0毫升的cSBM+钙。然后内容器20被重置，并将装置在35.5。C和10%C02中培养。(4)保持每4天除去培养基并用新鲜的mainSBM+钙置换培养基。实施例35:引入琼脂糖的检测系统的制备将2%的琼脂糖水溶液经过高压蒸汽灭菌，冷却到40。C,并与等体积的浓缩的mainSBM混合。除去脱脂棉垫并将13毫升的混合物倾入到外区域14中，允许设定在36。C(10%C02)，并将容器送返回培养箱中，用于在运输前储存。可理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于说明性的目的，并且对其进行的多种修改和改变可有所属
技术领域：
的专业人员推导并且属于本申请的精神和范围以及权利要求的保护范围。实施例36:培养组织构建体用于治疗口腔齿龈退缩的效力。主要目的是确定是否培养组织构建体可以提供与游离自体移植物相比的附着龈功能区。在该研究期间，登记了多达25个受试者。受试者的年龄至少为18-70岁。前三个受试者用于测定手术和材料操作技术，因此不被包含在统计分析中。直到这三个患者完全跟踪4周后对后来的患者进行登记。登记的受试者具有至少两个不相邻的具有不充分的附着龈区域的牙齿，需要组织移植。两个^皮选牙齿必需已经位于对侧的四分之一圆内。在移植期间未注明或无需牙根覆盖。受试者用本发明的培养组织构建体处理或用72游离自体移植物处理。临床上评价移植物以确定附着龈的改变，并且在至少3个受试者中，取得小份活组织用于组织学评价和两种移植物的比较。辅助效力变量是基线在角质化组织宽度方向上、退缩深度、炎症痕迹、移植组织与周围组织的颜色或紋理匹配、对口腔肌肉拉伸的抗性、临床附着水平，探针深度和受试者的不适度方面的改变。研究采用了随机的在受试者之间的对照处理。评价通过培养组织构建体产生的附着龈的量和性质，并且在术后一周和在1、3和6个月发生游离的自体移植。在第6个月发生主要的终点。所有的术后评估通过对实施的手术过程不知情的研究协调员进行。颜色、紋理、炎症和抗肌肉拉伸性通过标定研究协调员独立地打分。尽管已经通过说明和用于清楚和理解目的的实施例详细地描述了本发明，但是本领域技术人员显然可在权利要求的保护范围内进行改变和{奮饰。权利要求1.治疗受试者的口腔病况的方法，所述方法包括向受试者的口腔组织移植培养组织构建体，其中所述培养组织构建体包括细胞外基质层并且所述细胞外基质包括培养成纤维细胞而不存在外源性基质组分或支架支撑件。2.权利要求l的方法，其中口腔病况选自口腔齿龈退缩，牙间乳头缺失，牙槽嵴缺陷，口腔植入失败，牙齿分叉缺陷，和颌面部肿瘤切除。3.权利要求l的方法，其中细胞外基质包括(i)显示有原纤维和原纤维束的堆积组构并表现有四分之一交错的67nm带型的原纤维胶原蛋白；(ii)核心蛋白聚糖；和(iii)糖胺聚糖。4.权利要求l的方法，其中培养成纤维细胞得自选自以下的组织新生雄性包皮，真皮，腱，肺，尿道，脐带，角膜基质，口腔粘膜，和肠。5.权利要求l的方法，其中培养成纤维细胞是真皮成纤维细胞。6.权利要求l的方法，其中培养成纤维细胞来自人组织。7.治疗受试者的口腔病况的方法，所述方法包括向受试者的口腔组织移植培养组织构建体，其中所述培养组织构建体包括第一细胞外基质层和位于所述笫一层上的第二细胞层，所述细胞外基质包括培养成纤维细胞而不存在外源性基质组分和支架支撑件，并且所述第二细胞层包括上皮细胞。8.权利要求7的方法，其中口腔病况选自口腔齿龈退缩，牙间乳头缺失，牙槽嵴缺陷，口腔植入失败，牙齿分叉缺陷，和颌面部肿瘤切除。9.权利要求7的方法，其中细胞外基质包括(i)显示有原纤维和原纤维束的堆积组构并表现有四分之一交错的67nm带型的原纤维胶原蛋白；(ii)核心蛋白聚糖；和(iii)糖胺聚糖。10.权利要求7的方法，其中上皮细胞选自角化细胞，角膜上皮细胞，来自口腔粘膜的上皮细胞，食道上皮细胞，和尿道上皮细胞。11.权利要求7的方法，其中包含在所述第一层内的所述培养成纤维细胞得自选自以下的组织新生雄性包皮，真皮，腱，肺，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。12.权利要求7的方法，其中包含在所述第一层内的所述培养成纤维细胞是真皮成纤维细胞。13.权利要求12的方法，其中细胞外基质进一步包含粘连蛋白和生腱蛋白。14.权利要求7的方法，其中培养成纤维细胞和上皮细胞来自人组织。15.权利要求7的方法，其中培养组织构建体包括位于第一层上用于形成表皮细胞层的第二角化细胞层。16.权利要求15的方法，其中表皮细胞层是多层的、层状的、分化的并且表现出基底层、基底上层、颗粒层和角质层；并且其中双层培养皮肤构建体具有在第一层和第二层的连接处存在的基底膜。17.治疗受试者的口腔病况的方法，所述方法包括向受试者的口腔组织移植培养组织构建体，其中所述培养组织构建体包括胶原蛋白溶液和收缩剂的凝胶混合物。18.权利要求17的方法，其中口腔病况选自口腔齿龈退缩，牙间乳头缺失，牙槽嵴缺陷，口腔植入失败，牙齿分叉缺陷，和颌面部肿瘤切除。19.权利要求17的方法，其中所述收缩剂包括成纤维细胞。20.权利要求19的方法，其中成纤维细胞来自人组织。21.权利要求19的方法，其中成纤维细胞得自选自以下的组织新生雄性包皮，真皮，腱，肺，尿道，脐带，角膜基质，口腔粘膜，和肠。22.治疗受试者的口腔病况的方法，所述方法包括向受试者的口腔组织移植培养组织构建体，其中所述培养组织构建体包括第一层，和位于第一层上的第二层，所述第一层包括胶原蛋白凝胶而不存在细胞，所述第二层包括第二胶原蛋白凝胶，第二胶原蛋白凝胶包含胶原蛋白和收缩剂。23.权利要求22的方法，其中口腔病况选自口腔齿龈退缩，牙间乳头缺失，牙槽嵴缺陷，口腔植入失败，牙齿分叉缺陷，和颌面部肺瘤切除。24.权利要求22的方法，其中所述收缩剂包括成纤维细胞。25.权利要求24的方法，其中成纤维细胞得自选自以下的组织新生雄性包皮，真皮，腱，肺，尿道，脐带，角膜基质，口腔粘膜，和肠。26.权利要求22的方法，其中第二层包括人表皮细胞。27.权利要求24的方法，其中成纤维细胞来自人组织。28.权利要求l、7、17和22中任一项的方法，其中成纤维细胞经过基因修饰以产生细胞外基质组分。29.权利要求28的方法，其中成纤维细胞经过基因修饰以产生生长因素、激素、肽或蛋白质。全文摘要本发明公开了通过对受试者的口腔组织移植培养组织构建体治疗口腔病况的方法。该培养组织构建体包括培养的细胞和内源性产生的细胞外基质组分，而无需外源性基质组分或者网络支撑件或支架部件。本发明的一些组织构建体包含多个细胞层或超过一种的细胞类型。本发明的组织构建体具有与其细胞由来的组织相似的形态特征和功能，并且它们的强度使得其容易操作。本发明的优选的培养组织构建体包括人组织由来的细胞。文档编号A01N63/00GK101489395SQ200780015826公开日2009年7月22日申请日期2007年3月5日优先权日2006年3月3日发明者D·C·埃克隆德申请人:器官发生有限公司