专利名称：玉米中调节器官大小的与拟南芥ARGOS同源的基因ZmAl1及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米中调节器官大小的与拟南芥^及GOS同源的基因Z""〃 及应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
玉米是我国重要粮食作物和经济作物，玉米单株籽粒数和粒重与玉米产 量关系重大，经典遗传学和育种学将以上两个指标归结为微效多基因控制的 数量性状。长期以来，经典遗传学和育种学将以上两个指标归结为微效多基 因控制的数量性状(QT)。育种学家因此努力通过杂交手段集中较多的数量性 状座位(QTLs),来达到增加玉米产量性状的目的。
随着分子生物学和基因组学的发展，现代遗传学和分子育种学已逐渐被 应用于作物产量和品质性状的改良。育种学家希望对传统作物QTLs的分子标 记和定位，来逐渐接近并最终找到与性状相关性最大的座位或候选基因，或 称之为主效基因，进而通过基因工程等农业生物技术手段改良作物，以縮短 育种周期，加速获得新种质或品种。
转基因育种技术被认为是未来玉米育种的主要发展趋势和方向，转基因 玉米已成为仅次于大豆的第二大转基因作物。美国转基因玉米面积己由1996 年占玉米总种植面积的4%增至2005年的50%左右，生物科技应用于美国玉 米生产不仅大幅度提高了玉米产量，而且还降低了杀虫剂和除草剂的用量。 我国的玉米育种工作者也利用转基因技术将外源基因导入玉米获得了高蛋白
高赖氨酸含量的优质玉米，创造了巨大的经济效益和社会效益。
模式生物拟南芥、水稻、苜蓿等基因组序列的破译，为利用作物自身的 基因而不引进外源性基因以对产量品质等进行改良，继而研制生物安全性高 的"绿色遗传改造食品"提供了强有力的平台。通常采用的技术路线，其一 是直接利用模式植物的某些功能基因，把它们移植到需改良目的作物中，这
比用病毒或其他微生物的基因要安全得多；其二是以模式植物为参照系，参 照其基因位点，利用各种分子标记和比较基因组学手段，在目的作物中找到 相应基因(如抗病虫害或高产)，"就地取材"的改造作物。
植物体的器官大小是构成植物生物产量的重要因素，植物器官的增大或 减小往往导致植物体生物产量产生相应的增减。不仅植物的生物产量是农业 生产关注的首要目标，而且植物特定器官的增大也是园艺花卉等产业关心的 重要性状。
越来越多的研究发现，植物体器官的大小由细胞增殖引起的细胞数量变 化和细胞生长引起的细胞体积的变化所决定。虽然植物体存在着内在的发育 机制调节着细胞数量和细胞体积的动态平衡并以此严格的控制着植物器官的 体积，但许多研究也显示细胞数目的变化是影响植物器官大小的关键因素， 体积较大的器官往往含有更多的细胞，对突变体W,vve/戸妙和^朋to"c^ 的研究也发现细胞数目的增减导致了器官的体积发生了相应变化。
植物器官由起源于顶端或侧生分生组织的器官原基发育而来，器官的生 长、细胞数目的增多依赖于器官内部分生组织细胞持续交互的分裂，因此植 物器官细胞分生能力显得尤为关键。拟南芥^AT基因编码一个Ap2结构域的 转录因子，可以通过维持D类细胞周期蛋白表达而增强细胞的持续分裂能力，
过量表达^vr基因导致细胞的增殖和器官的增大。新近的研究发现，拟南芥 器官大小控制基因^及GOS基因是一个作用于^vr上游的植物所特有的基因，
参与生长素信号转导途径，并影响器官的发育。过量表达拟南芥^ GOS基因 可以导致^Vr基因和D类细胞周期蛋白Q^/3;/基因的转录水平提高和表达 时间延长，同时增强了细胞的增殖能力。相应的，过量表达^i G05基因的拟
南芥植株表现出了因细胞数目增多而导致的器官增大，其鲜重相对于对照植
株增加50%~120°/。，植株角果内种子数目比对照植株增加20%以上，这种表 型与人们所关心的作物产量性状密切相关。
WGOS基因为植物所特有并仅在模式植物拟南芥中克隆得到，GeneBank
中基因组数据库内仅有类似的水稻基因组序列，玉米中是否也有类似的同源
序列还是未知的。
发明内容
本发明首次从玉米(Zea ma")中分离得到与拟南芥(^ra/)!V/c;p^ Aa/^加) 器官大小控制基因^ GOS同源基因的全编码区cDNA，并命名为ZmJ丄7( 巡^s4及GOS^汰e^"e丄)基因。构建正义表达载体，利用农杆菌侵染法转化 拟南芥，转基因植株侧生器官较之对照明显增大。该基因可用于作物转基因 育种，提高作物生物产量。
本发明Z^4丄7基因的全长cDNA为539 bp (SEQ ID NO.l),其中开放 阅读框部分为318 bp,由此推得具有105个氨基酸的一段序列(SEQ ID N0.2)， 将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，表明与已发表的拟南芥ARGOS 蛋白以及水稻基因组序列中推导的同源蛋白相比，氨基酸同源性分别为 31.90%和64.29%,并具有类似的富含亮氨酸和脯氨酸结构域(见附图1), 表明本发明克隆得到了玉米内编码ARGOS基因的同源基因。
利用过量表达策略，将本发明ZmJ丄/基因转化拟南芥，将筛选出的转基 因植株与未转基因的野生型植株同时种植。结果显示，与野生型植株相比， 转基因植株侧生器官(如叶片)明显增大，表明转基因植株具有较高生物产 量(见附图4-6)。
本发明从玉米中分离出编码拟南芥^ G05同源基因的Zm^〃基因，这 在国内外尚属首例。该基因过量表达能导致转基因拟南芥的生物产量较未转 基因的显著提高。玉米作为重要的粮食作物和经济作物，该基因在玉米或其 它植物中表达，将会提高其生物产量，从而提高其产量，具有非常重要的经 济效益和社会效益。
图1拟南芥及水稻ARGOS氨基酸序列和玉米中由ZmJZJ基因推断的氨 基酸序列同源性比对结果。其中相同的氨基酸残基用涂黑表示。Genebank的 登记号及其物种的来源如下^4及GOS(拟南芥，AY305869), OW及GOS(水 稻，DQ641272)。
图2半定量法表示玉米ZmAll基因在生长15天玉米根、茎、叶中的表达 情况。
图3半定量法表示拟南芥野生型对照与转ZmAll基因拟南芥株系(M4-3 和M2-9，过量表达ZmAll)的Zm^/基因表达情况。
图4相同条件下生长2个月的转ZmAll基因拟南芥株系(M4-3和M2-9， 过量表达ZmAll)与野生型拟南芥对照的长势对比。
图5相同条件下转ZmAll基因拟南芥株系(M4-3和M2-9,过量表达 ZmAll)与野生型拟南芥对照的果荚大小对比。
图6转ZmAll基因拟南芥株系(M4-3和M2-9，过量表达ZmAll与野 生型拟南芥对照的千粒重对比。
具体实施例方式
一、玉米中与拟南芥^^05>同源的基因2附^//的克隆
(1) RNA的提取釆用CTAB法或RNAkit提取总RNA。
(2) DNA第一条链的合成取ling总RNA，加入5 X反应缓冲液4 pl， 10 mM脱氧核糖核酸(dNTP) 2|iil，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/^il) 0.5^1， 引物oligodT(l fig/inl)1 ^U，反转录酶(10u/|iil) 2|iil， 42。C条件下反应60分 钟，然后在85。C条件下，放置IO分钟，终止反应。
(3) PCR反应:
根据PCR反应要求设计扩增玉米中与拟南芥/A尺GOS同源的基因的引物 如下
正向引物5'-TTCACATTACACTCATGACT誦3' 正向引物5'國TTCGACCACCCGAGCTCAGAT-3'
PCR体系与条件如下
反应体系
10 x反应缓冲液 5^1
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4^1
正向引物(5|iM) 4^a
反向引物(5pM) 4^1
模板cDNA 4 pl
T叫DNA聚合酶 0.5 |il
加水至总体积 50PCR反应条件为94。C3分钟；然后进入下列循环94°C 1分钟，56。C 1分钟，72°C1分钟，共28个循环；最后72。C延伸IO分钟。
(4) 基因克隆取2iilPCR产物与pGEM-Teasy载体进行连接，操作步 骤按Promega公司产品pGEM-T easy and pGEM-T easy Vector system说明书进 行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5ot菌株，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代P-D-半乳糖苷)的含氨苄青霉素(100 pg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中过夜培 养。
(5) 质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。
(6) 序列测定本工作由大连宝生物工程公司进行。
(7) 3'和5'序列的分离按Clontech公司的SMARTRACEcDNA Amplification Kit说明书进行。
(8) 同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与Genebank中的序列进 行比较。
二、玉米ZmJ/7的表达载体的构建。
(1)根据分离出的与拟南芥^ GOS同源的玉米基因Z""/7的核苷酸序 列，设计引物
正向引物5'-GAGTCGACTTCACATTACACTCATGACT -3' 反向弓I物I 5'-TGTCTAGATtcgACCACCCGAGCTCAGAT-3' 以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR反应。 PCR体系与条件如下 反应体系
10 x反应缓冲液 5 pi
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4^1
正向引物(5fxM) 4|ul
反向引物(5pM) 4^1
模板cDNA 4 pi
Taq DNA聚合酶 0.5 |il
加水至总体积 50 |ul
PCR反应条件为94。C3分钟；然后进入下列循环94°C 1分钟，56°C 1分钟，72°C1分钟，共28个循环；最后72。C延伸IO分钟。 可获得SEQ ID NO. 1所示全长为539 bp的cDNA序列。
(2) 取2pl PCR产物与pGEM-Teasy载体进行连接，操作步骤按Promega公 司产品pGEM-T easy and pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后转化大 肠杆菌DH5a菌株，在表面涂X-gal (5-溴-4-氯-3-卩引哚-P-D-半乳糖苷)和IPTG
(异丙基硫代p-D-半乳糖苷)的含氨苄青霉素(100(ig/ml)的LB平板上生长 过夜。挑取白色单菌落，在LB液体培养基中培养过夜。然后碱法提取质粒 DNA，进行序列测定。
(3) 用効al和Sa/I两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T easy载体上切下， 与相同酶酶切的pBI121连接。连接产物转化DH5ot细胞，然后在含氨苄青霉素 的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
(4) 将构建好的表达载体转化农杆菌，所用菌株为GV3101。 三、转基因植物生物产量分析。
(1)种植拟南芥。
(2) 挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50 ng/ml卡那霉素的LB液体培养基 中，28 。C振荡培养。
(3) 离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5%蔗糖，0.1MMgCl2， 0.5% Silwet L-77 )悬浮，菌液00600值在0.8左右。
(4) 将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
(5) 收获的种子在筛选培养基(lxMS盐，1%蔗糖，pH5.7， 0.8%琼脂， 卡那霉素30pg/ml)上筛选，得到抗性植株。
(6) 将T3代纯合株系种子种于培养室，2月后观察生长状况。结果见附图4。
核苷酸序列表
<110〉山东省农业科学院高新技术研究中心
〈120〉玉米中调节器官大小的与拟南芥ARG0S同源的基因ZmAll及应用 〈160〉 6
〈210〉 1 〈211〉 539 〈212>腿
〈213〉玉米(Zea mays)
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (139)...(453) 〈400〉 1
tttcgaccac ccgagctcag atctgattac aaaacgttca gaaaacacaa ggcgttctca 60
caccgccttt cacttcttgc ttactttggc aaccactcac tgcgactggt ctccacctcc 120
acctacacca aagaacac atg gca age cga tct age gcg atg gaa gga ggg
171
Met Ala Ser Arg Ser Ser Ala Met Glu Gly Gly 1 5 10
gcg gca ata caa agg agg aat gcc gtg aag egg cat ctg cag cag cgt
219
Ala Ala lie Gin Arg Arg Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gin Gin Arg 15 20 25cag cag gag gcg gat ttc etc gac aag aag gtc ate gcg tec acc tac
267
Gin Gin Glu Ala Asp Phe Leu Asp Lys Lys Val lie Ala Ser Thr Tyr 30 35 40
ttc age ate ggg gcg ttc etc gtg etc gcc tgc etc acc gtc teg ctg
315
Phe Ser lie Gly Ala Phe Leu Val Leu Ala Cys Leu Thr Val Ser Leu 45 50 55
ctg ata ctg ccg ctg gtg ctg cct ccc ctg ccg ccg ccg ccg teg ctg
363
Leu lie Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu 60 65 70 75
ctg ttg tgg ctg ccg gtc tgc ctg etc gtc ttg ctg gtt gta ctg gcc
411
Leu Leu Trp Leu Pro Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala 80 85 90
ttc atg cct aca gat gtg cgc age atg gcc tec tct tac ctg taaatag
460
Phe Met Pro Thr Asp Val Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu 95 100 105
ataaataggt ettggecaga ttttctgtgt tttgcagctg caggattcgt cctaagacga 520
gtcatgagtg taatgtgaa
539
〈210〉 2 〈211〉 105 〈212〉 PRT
〈213〉玉米(Zea mays) 〈220〉
〈221〉 S皿LAR 〈222〉 (1)…(105) 〈400〉 2
Met Ala Ser Arg Ser Ser Ala Met Glu Gly Gly Ala Ala lie Gin Arg 1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gin Gin Arg Gin Gin Glu Ala Asp 20 25 30
Phe Leu Asp Lys Lys Val lie Ala Ser Thr Tyr Phe Ser lie Gly Ala 35 40 45
Phe Leu Vai Leu Ala Cys Leu Thr Val Ser Leu Leu lie Leu Pro Leu 50 55 60
Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Trp Leu Pro 65 70 75 80
Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro Thr Asp 85 90 95
Val Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu 100 105
〈210〉 3 〈211〉 20 〈212〉 DNA
〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根据PCR反应要求设计扩增玉米(Zea mays)中与拟南芥(Arabidopsis
thaliana) ARG0S同源的基因的正向引物 〈400〉 3
ttcacattac actcatgact 20
〈210〉 4 〈211〉 29 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根据PCR反应要求设计扩增玉米(Zea mays)中与拟南芥(Arabidopsis
thaliana) ARG0S同源的基因的反向引物 〈400〉 4
ttcgaccacc cgagctcagat 21
〈210〉 5 〈211〉 28 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增与拟南芥(Arabidopsis thaliana)
ARGOS同源的玉米(Zea mays) ZmAll基因的正向引物 〈400〉 5
gagtcgactt cacattacac tcatgact 28
〈210〉 6 〈211〉 29 〈212〉瞧 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉根据PCR反应要求设计，用于扩增与拟南芥(Arabidopsis thaliana)
ARG0S同源的玉米(Zea mays) ZmAll基因的反向引物 〈400〉 6
tgtctsgatt cgaccacccg agctcagat 29
权利要求
1.玉米中调节器官大小的与拟南芥ARGOS同源的基因ZmA11，其特征在于，该ZmAL1基因的全长cDNA为539bp的序列，其中开放阅读框部分为318bp，SEQ ID NO.1。
2、 根据权利要求1所述的玉米中调节器官大小的与拟南芥^W^5"同源的 基因Z/al^，其特征在于，由Z/a4〃基因的全长cDNA SEQ ID NO. 1推得具有 105个氨基酸的一段序列，SEQ ID NO. 2，将此氨基酸序列在国际基因库中进 行检索，表明与已发表的拟南芥ARGOS蛋白以及水稻基因组序列中推导的同 源蛋白相比，氨基酸同源性分别为31.90%和64.29%，并具有类似的富含亮氨 酸和脯氨酸结构域。
3、 根据权利要求1所述的玉米中调节器官大小的与拟南芥^^6^同源的 基因Z/^7厶其特征在于，在玉米或其它植物中表达该基因，将会提高其生物 产量，从而提高总产量。
全文摘要
本发明公开了玉米中调节器官大小的与拟南芥ARGOS同源的基因ZmAl1及应用，属于分子生物学和生物技术领域。首次从玉米中分离得到拟南芥器官大小控制基因ARGOS同源基因的全编码区cDNA，并命名为ZmAL1(Zea mays ARGOS Like gene 1)基因。构建正义表达载体，利用农杆菌侵染法转化拟南芥，转基因植株侧生器官较之对照明显增大。该基因可用于作物转基因育种，提高作物生物产量。
文档编号A01H1/00GK101368182SQ20081001713
公开日2009年2月18日 申请日期2008年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者孟静静, 徐平丽, 李新国, 毕玉平, 赵晋平, 峰 郭 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心