专利名称：利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物育种技术，特别是涉及利用胚挽救培养获得三倍体葡 萄杂交幼苗，对所得杂种后代进行系统而全面的倍性早期鉴定的高效育种 技术，属于生物技术领域。
背景技术：
多倍体育种是培育果树新品种的重要途径，其优越性在于所表现出的 生长旺盛、枝粗、叶厚、果大、产量高及适应性强等特点，而多倍体产生 途径有自然芽变、人工化学诱变、人工有性杂交、胚乳培养及花药培养等。 其中利用二倍体品种与四倍体之间进行杂交应用最广，己在西瓜、香蕉、 柑桔中取得成果，获得了三倍体无籽果。葡萄作为全球性第二大水果，其 无核品种一直是当前国际消费的重要方向，而获得大粒无核葡萄新品种长 期以来备受育种学家的重视。三倍体葡萄除具有多倍体植株的诸多优越性 外，其果实无核或少核，因此三倍体葡萄育种开拓了培育大粒无核葡萄品 种的新途径。据研究报道，日本己育成三倍体无核葡萄品种尾玲、戴拉王、 蜜无核、甲斐美嶺、夏黑，我国已育成三倍体无核早红，并在生产上开始 推广。
三倍体葡萄品种可通过二倍体和四倍体品种间杂交、自然杂交、三倍 体品种的芽变、胚乳培养和花药培养等多种途径产生，但实际上，最有效 的途径仍然是利用二倍体和四倍体直接杂交。但是二倍体和四倍体杂交的 最大障碍是亲和力差，座果率低，杂种胚早期败育或胚乳解体，获得三倍体杂交种子生活力低，很难获得杂交后代。利用胚挽救技术，可阻止三倍 体杂交幼胚的早期败育，形成三倍体植株。
从上个世纪以来，经过胚珠培养，日本学者山下裕之利用有核葡萄的
四倍体和二倍体杂交，获得了三倍体植株(《园艺学会杂志》1993， 62 (2): 249-255)，其后李世诚(《上海农业学报》1998， 14 (4): 13-17)、 潘春云(《山东农业大学学报》1998， 29 (3): 299-302)、徐海英(《果树 学报》2001， 18 (6): 317-320)、郭印山(《沈阳农业大学学报》2005， 36 (5) : 606-608)等也采用胚挽救技术，克服了葡萄二倍体与四倍体常 规育种中杂交胚早期败育、育种效率低的障碍，成功的育成了三倍体杂种 幼苗，但少有系统的对所得杂交幼苗进行全面倍性检测，缺少完整高效的 育种体系。
通常多倍体鉴定的方法有植物性状鉴定、细胞学鉴定、分子生物学 鉴定等方法，而葡萄多倍体多采用显微镜下染色体数目鉴定，也有利用流 式细胞仪进行测定，染色体计数法直观有效，但材料仅限于茎尖和根尖， 且操作复杂。流式细胞仪是对待测植株DNA含量进行鉴定，在短时间内可 检测成千上万个细胞，能保证获得生物体细胞的群体特征，测量快速，结 果可靠，但仅能提供半定量的测量结果。
发明内容
本发明的目的就是针对现今三倍体葡萄育种现状以及各种多倍体鉴 定方法的优缺点，利用胚挽救培养获得三倍体葡萄杂种幼苗，结合流式细 胞术、去壁低渗法染色体计数，对所得杂种后代进行系统而全面的倍性早 期鉴定，提高三倍体葡萄的育种效率。
本发明的实施步骤如下
a.葡萄育种田间杂交采取花粉，在四倍体品种父本开花前1天或开花初期，采下发育正常 的花序，除去顶部约三分之一的部分，摘下花冠及花药后用纱网筛过后， 在日光灯下烘千至花药裂开，再次筛后倒入研钵中，研磨至粉状，装入处
理干净的小瓶，封口，放在装有无水CaCl2的干燥器中，4。C低温保存；
去雄授粉，选择欧洲无核葡萄品种母本树上发育一致的花序若干，开花前
3-4天进行人工去雄，之后立即用清水喷洒花序，并套袋和挂牌标记，当 柱头上开始分泌水滴状粘液时，用脱脂棉蘸取花粉进行人工授粉，连续授 粉3次，每天l次；
b. 胚挽救培养及成苗
杂交去雄授粉40-55天后，剥取杂交果穗中的胚珠进行胚挽救培养， 将果穗洗净后置超净工作台上，75%乙醇浸泡约lmin，无菌水冲洗3-5次， 再用0. 1%升汞消毒6min，无菌水冲洗3-5次，切开果粒取出胚珠接种于 内装40ml培养基的100ml三角瓶中，每瓶接种10-20粒，胚珠培养基采用 B5为基本培养基，附加0. 1-1. Omg/LBA 、 1, 5-2. 5mg/LIAA 、 0. 25-0.75mg/LGA3、 6%蔗糖、0.6%琼脂、0. 1%活性炭;培养8周后，在无菌条 件下剥取裸胚接种于胚萌发培养基中，以WP为基本培养基，附加O.l-0.5mg/LIBA、 2%蔗糖、0. 6%琼脂、0. 1%活性炭；继续培养10-15天，转移 至成苗培养基进行继代培养，采用1/2MS为基本培养基，附加O.l-0.3mg/LIBA、 2%蔗糖、0. 6%琼脂、0. 1%活性炭，在成苗培养基中长出叶片 后可进行后继的倍性鉴定，培养条件为温度25'C土2"，光照每天16h， 光强度20001ux;
c. 流式细胞仪对葡萄杂种后代进行半定量分析
经胚挽救培养获得的杂交后代倍性的初步鉴定采用流式细胞术测定 其DNA含量，取l-2片幼嫩的叶片或少量愈伤组织放入培养皿中，加入0.5-1.0ml的DNA提取液服-A，用刀片切碎后静置处理2-5min后，将样 品通过3(^m的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，再加入2ml 染色液HR-B，随即将样品上样于Partec流式细胞仪，DNA的含量分布图 由流式细胞仪自动生成，其中，先将父母本品种所产生的分析峰在横轴上 的荧光值FL设定，固定参数，再依次对杂交幼苗的荧光值迸行测定；
d. 通过去壁低渗法染色体计数对所得的测定结果进行鉴定
在超净工作台上取杂交试管苗的根尖或茎尖后，立即投入饱和的对二 氯苯溶液中常温下处理2h-3h;去除处理液，用蒸馏水冲洗数遍后注入新 配制的甲醇冰乙酸=3:1的固定液，常温下处理3h-5h;去除固定液，用 蒸馏水冲洗干净，加入3.5%的纤维素酶和果胶酶1:1的混合酶液，酶液 和材料的比例为30:1，在37。C恒温下酶解20-30min;蒸馏水冲洗后在 卡宝品红染色液中染色30min -3h;取一小块材料放在经70%乙醇浸泡的 载玻片上，滴上一滴卡宝品红染色液，用镊子捣碎后盖上盖玻片，然后按 压住一角用木制小棒均匀敲打盖玻片，至材料分散成雾状，最后用吸水纸 吸去多余的染色液，酒精灯上干燥后用0LMPUS-BX51型显微数码摄影系统 照相；
e. 胚挽救幼苗的炼苗移栽
春季选择壮苗4-5条根，根长3-5 cm， 4_5片叶，茎秆粗壮，基部无愈 伤组织，强光锻炼l周；将幼苗用无菌水冲洗后移栽到灭好菌的珍珠岩 草炭=1: l混匀的基质中，培养室炼苗，在幼苗上罩塑料杯，每5-10天浇 灌1000倍的多菌灵和1/8MS营养液，并及时除去发霉的叶片和茎杆，温室 温度控制在18-25。C，相对湿度60-70%,光照强度500-10001ux;待移栽出 的幼苗长出新根和新叶，在春季地温升高至18-23'C时移至大田，移栽后 立即搭遮荫网并灌足定根水，逐渐揭开遮荫网，并及时浇水和防病虫。采用本发明的方法，对杂交组合红宝石无核x藤稔、爱莫无核x黑奥
林进行离体培养，结果胚萌发率可分别达到23. 1%、 22. 2%，成苗率则分 别达到87.5%、 75%,因此，通过本发明得到了更多的杂交后代，提高了 育种效率，加速了三倍体葡萄品种的选育进程。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步说明本发明的操作方法
a.葡萄育种田间杂交的步骤如下
a. l在开花初期，采下藤稔、黑奥林发育正常的花序，除去顶部约 三分之一的部分，摘下花冠及花药后用纱网筛过后，在日光灯下烘干至花 药裂开，再次筛后倒入研钵中，研磨粉状，装入处理干净的小瓶，封口， 放在装有无水CaCl2的干燥器中，4 °C低温保存；
a. 2开花前3天，选择母本品种红宝石无核、爱莫无核的树体上发 育一致的花序10穗，进行人工去雄，之后立即用清水喷洒花序，并套袋 和挂牌标记，当柱头上开始分泌水滴状粘液时，用脱脂棉蘸取花粉进行人 工授粉，连续授粉3次，每天l次；
b. 胚挽救培养及成苗的步骤是如下
b. l分别于授粉后48d、 47d采取杂交组合红宝石无核X藤稔、爱莫 无核X黑奥林的果穗进行离体培养，将果穗洗净后置超净工作台上，75% 乙醇浸泡约lmin，无菌水冲洗3次，再用O. 1%升汞消毒6min，无菌水 冲洗3次，切开果粒取出胚珠接种于内装40ml培养基的100ml三角瓶中， 每瓶接种10粒，胚珠培养基采用B5为基本培养基，附加0.5mg/LBA、 2.0mg/LIAA、 0. 5mg/LGA3、 6%蔗糖、0. 6%琼脂、0. 1%活性炭;培养8周后， 在无菌条件下剥取裸胚接种于胚萌发培养基中，以WP为基本培养基，附加O. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%琼脂、0.1%活性炭；继续培养两周，转 移至成苗培养基进行继代培养，采用1/2MS为基本培养基，附加 0. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%琼脂、0.1%活性炭，在成苗培养基中长出 叶片后可进行后继的倍性鉴定，培养条件为温度25'C土2'C，光照每天 16h，光强度20001ux;
C.利用流式细胞仪对葡萄杂种后代进行半定量分析
c. 1经胚挽救培养获得的杂交后代，采用流式细胞术测定其DNA含 量，初步鉴定其倍性，取杂交组合红宝石无核X藤稔、爱莫无核X黑奥林 所得幼苗的1-2片幼嫩的叶片或少量愈伤组织放入培养皿中，加入1. Oml 的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后静置处理3min后，将样品通过30^irn 的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，再加入2ml染色液HR-B， 随即将样品上样于Partec流式细胞仪，DNA的含量分布图由流式细胞仪 自动生成，其中，先将父母本品种所产生的分析峰在横轴上的荧光值FL 设定，固定参数，再依次对杂交幼苗的荧光值进行测定；
d. 对所得杂交幼苗实施去壁低渗法染色体计数
d. l配制所用试剂，3.5%混合酶液称取纤维素酶、果胶酶各0.7g， 加入20ml蒸馏水，4'C冰箱内保存；预处理液称取5g对二氯苯饱结晶 放入棕色试剂瓶中，加入100ml己加温至45i:的蒸馏水，振荡5min，静 置冷却后室温存放；固定液冰乙酸与甲醇的体积比=1:3;卡宝品红染色 液先配成三种原液，原液A: 3g碱性品红溶于100ml 70%酒精中，原液 B:取原液A10ml加入到90ml5。/。石炭酸水溶液中，原液C:取原液B55ml， 加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林，其中原液A和原液C可长期保存，原液 B限两周内使用，再取原液C20ml，加45%冰醋酸90ml，再加山梨醇1. 8g， 配成20%浓度的卡宝品红染色液，放置两周后使用；d. 2在超净工作台上取杂交试管苗的根尖或茎尖后，立即投入饱和
的对二氯苯溶液中常温下处理2h;
d. 3去除处理液，用蒸馏水冲洗数遍后注入新配制的甲醇冰乙酸
=3:1的固定液，常温下处理4h;
d. 4去除固定液，用蒸馏水冲洗干净，加入3.5%的纤维素酶和果胶 酶混合酶液，酶液和材料的比例为30:1，在37。C恒温下酶解30min;
d. 5蒸馏水冲洗后在卡宝品红染色液中染色lh;
d. 6取一小块材料放在经70%乙醇浸泡的载玻片上，滴上一滴卡宝品 红染色液，用镊子捣碎后盖上盖玻片，然后按压住一角用木制小棒均匀敲 打盖玻片，至材料分散成雾状，最后用吸水纸吸去多余的染色液，酒精灯 上干燥后用0LMPUS-BX51型显微数码摄影系统照相。
e. 进行胚挽救幼苗的炼苗移栽
e. l次年3月中下旬选择壮苗4-5条根，根长3-5 cm， 4-5片叶， 茎秆粗壮，基部无愈伤组织，强光锻炼l周后，将幼苗用无菌水冲洗后移 栽到灭好菌的珍珠岩草炭=1: l混匀的基质中，培养室炼苗，在幼苗 上罩塑料杯用以保湿，
e. 2每周浇灌1000倍的多菌灵和1/8MS营养液，并及时除去发霉的 叶片和茎杆，温室温度控制在22"，相对湿度60°/。，光照强度10001ux，
e. 3待移栽出的幼苗长出新根和新叶，在春季地温升高至2"C时移至 大田，移栽后立即搭遮荫网并灌足定根水，逐渐揭开遮荫网，并及时浇水 和防病虫。
权利要求
1. 利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种技术，其特征是按以下步骤进行1.a葡萄育种田间杂交采取花粉，在四倍体品种父本开花前1天或开花初期，采下发育正常的花序，除去顶部约三分之一的部分，摘下花冠及花药后用纱网筛过后，在日光灯下烘干至花药裂开，再次筛后倒入研钵中，研磨至粉状，装入处理干净的小瓶，封口，放在装有无水CaCl2的干燥器中，4℃低温保存；去雄授粉，选择欧洲无核葡萄品种母本树上发育一致的花序若干，开花前3-4天进行人工去雄，之后立即用清水喷洒花序，并套袋和挂牌标记，当柱头上开始分泌水滴状粘液时，用脱脂棉蘸取花粉进行人工授粉，连续授粉3次，每天1次；1.b胚挽救培养及成苗杂交去雄授粉40-55天后，剥取杂交果穗中的胚珠进行胚挽救培养，将果穗洗净后置超净工作台上，75％乙醇浸泡约1min，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞消毒6min，无菌水冲洗3-5次，切开果粒取出胚珠接种于内装40ml培养基的100ml三角瓶中，每瓶接种10-20粒，胚珠培养基采用B5为基本培养基，附加0.1-1.0mg/LBA、1.5-2.5mg/LIAA、0.25-0.75mg/LGA3、6％蔗糖、0.6％琼脂、0.1％活性炭；培养8周后，在无菌条件下剥取裸胚接种于胚萌发培养基中，以WP为基本培养基，附加0.1-0.5mg/LIBA、2％蔗糖、0.6％琼脂、0.1％活性炭；继续培养10-15天，转移至成苗培养基进行继代培养，采用1/2MS为基本培养基，附加0.1-0.3mg/LIBA、2％蔗糖、0.6％琼脂、0.1％活性炭，在成苗培养基中长出叶片后可进行后继的倍性鉴定，培养条件为温度25℃±2℃，光照每天16h，光强度2000lux；1.c流式细胞仪对葡萄杂种后代进行半定量分析经胚挽救培养获得的杂交后代倍性的初步鉴定采用流式细胞术测定其DNA含量，取1-2片幼嫩的叶片或少量愈伤组织放入培养皿中，加入0.5-1.0ml的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后静置处理2-5min后，将样品通过30μm的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，再加入2ml染色液HR-B，随即将样品上样于Partec流式细胞仪，DNA的含量分布图由流式细胞仪自动生成，其中，先将父母本品种所产生的分析峰在横轴上的荧光值FL设定，固定参数，再依次对杂交幼苗的荧光值进行测定；1.d通过去壁低渗法染色体计数对所得的测定结果进行鉴定在超净工作台上取杂交试管苗的根尖或茎尖后，立即投入饱和的对二氯苯溶液中常温下处理2h-3h；去除处理液，用蒸馏水冲洗数遍后注入新配制的甲醇∶冰乙酸＝3∶1的固定液，常温下处理3h-5h；去除固定液，用蒸馏水冲洗干净，加入3.5％的纤维素酶和果胶酶1∶1的混合酶液，酶液和材料的比例为30∶1，在37℃恒温下酶解20-30min；蒸馏水冲洗后在卡宝品红染色液中染色30min-3h；取一小块材料放在经70％乙醇浸泡的载玻片上，滴上一滴卡宝品红染色液，用镊子捣碎后盖上盖玻片，然后按压住一角用木制小棒均匀敲打盖玻片，至材料分散成雾状，最后用吸水纸吸去多余的染色液，酒精灯上干燥后用OLMPUS-BX51型显微数码摄影系统照相；1.e胚挽救幼苗的炼苗移栽春季选择壮苗4-5条根，根长3-5cm，4-5片叶，茎秆粗壮，基部无愈伤组织，强光锻炼1周；将幼苗用无菌水冲洗后移栽到灭好菌的珍珠岩∶草炭＝1∶1混匀的基质中，培养室炼苗，在幼苗上罩塑料杯，每5-10天浇灌1000倍的多菌灵和1/8MS营养液，并及时除去发霉的叶片和茎杆，温室温度控制在18-25℃，相对湿度60-70％，光照强度500-1000lux；待移栽出的幼苗长出新根和新叶，在春季地温升高至18-23℃时移至大田，移栽后立即搭遮荫网并灌足定根水，逐渐揭开遮荫网，并及时浇水和防病虫。
2.根据权利要求1所述的利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早 期鉴定的育种技术，其特征是具体操作方法如下2.a葡萄育种田间杂交2.a. l在开花初期，采下藤稔、黑奥林发育正常的花序，除去顶 部约三分之一的部分，摘下花冠及花药后用纱网筛过后，在日光灯下 烘干至花药裂开，再次筛后倒入研钵中，研磨粉状，装入处理干净的 小瓶，封口，放在装有无水CaCl2的干燥器中，4。C低温保存；2.&2开花前3天，选择母本品种红宝石无核、爱莫无核的树体 上发育一致的花序10穗，进行人工去雄，之后立即用清水喷洒花序， 并套袋和挂牌标记，当柱头上开始分泌水滴状粘液时，用脱脂棉蘸取 花粉进行人工授粉，连续授粉3次，每天1次；2.b胚挽救培养及成苗2. b. 1分别于授粉后48d、 47d采取杂交组合红宝石无核X藤稔、 爱莫无核X黑奥林的果穗进行离体培养，将果穗洗净后置超净工作台 上，75%乙醇浸泡约lmin，无菌水冲洗3次，再用0. 1%升汞消毒6min，无菌水冲洗3次，切开果粒取出胚珠接种于内装40ml培养基的100ml 三角瓶中，每瓶接种10粒，胚珠培养基采用B5为基本培养基，附加 0. 5mg/LBA、 2. Omg/LIAA、 0. 5mg/LGA3、 6%蔗糖、0. 6%琼脂、0. 1%活 性炭；培养8周后，在无菌条件下剥取裸胚接种于胚萌发培养基中， 以WP为基本培养基，附加0. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%琼脂、0.1% 活性炭；继续培养两周，转移至成苗培养基进行继代培养，采用1/2MS 为基本培养基，附加0. lmg/LIBA、 2%蔗糖、0.6%琼脂、0.1%活性 炭，在成苗培养基中长出叶片后可进行后继的倍性鉴定，培养条件为-温度25。C土2X:，光照每天16h，光强度20001ux;2. c利用流式细胞仪对葡萄杂种后代进行半定量分析经胚挽救培养获得的杂交后代，采用流式细胞术测定其DNA含 量，来初步鉴定其倍性，取杂交组合红宝石无核X藤稔、爱莫无核X 黑奥林所得幼苗的1-2片幼嫩的叶片或少量愈伤组织放入培养皿中， 加入1. Oml的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后静置处理3min后，将 样品通过30nm的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，再加 入2ml染色液HR-B，随即将样品上样于Partec流式细胞仪，DNA的 含量分布图由流式细胞仪自动生成，其中，先将父母本品种所产生的 分析峰在横轴上的荧光值FL设定，固定参数，再依次对杂交幼苗的 荧光值进行测定；2. d对所得杂交幼苗实施去壁低渗法染色体计数2.d. l配制所用试剂，3.5%混合酶液称取纤维素酶、果胶酶各 0.7g，加入20ml蒸馏水，4。C冰箱内保存；预处理液称取5g对二 氯苯饱结晶放入棕色试剂瓶中，加入100ml己加温至45"C的蒸馏水， 振荡5min，静置冷却后室温存放；固定液冰乙酸与甲醇的体积比=1:3;卡宝品红染色液先配成三种原液，原液A: 3g碱性品红溶于100ml 70%酒精中，原液B:取原液A 10ml加入到90ml 5%石炭酸水 溶液中，原液C:取原液B55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林， 其中原液A和原液C可长期保存，原液B限两周内使用，再取原液C 20ml，加45%冰醋酸90ml，再加山梨醇1.8 g，配成20%浓度的卡 宝品红染色液，放置两周后使用；2. d. 2在超净工作台上取杂交试管苗的根尖或茎尖后，立即投入 饱和的对二氯苯溶液中常温下处理2h;2.d.3去除处理液，用蒸馏水冲洗数遍后注入新配制的甲醇冰 乙酸=3:1的固定液，常温下处理4h;2. d.4去除固定液，用蒸馏水冲洗干净，加入3.5%的纤维素酶 和果胶酶混合酶液，酶液和材料的比例为30:1，在37"C恒温下酶解 30min;2.(1.5蒸馏水冲洗后在卡宝品红染色液中染色lh;2. d. 6取一小块材料放在经70%乙醇浸泡的载玻片上，滴上一滴 卡宝品红染色液，用镊子捣碎后盖上盖玻片，然后按压住一角用木制 小棒均匀敲打盖玻片，至材料分散成雾状，最后用吸水纸吸去多余的 染色液，酒精灯上干燥后用0LMPUS-BX51型显微数码摄影系统照相。2. e进行胚挽救幼苗的炼苗移栽2. e. 1次年3月中下旬选择壮苗4-5条根，根长3-5 cm， 4_5片 叶，茎秆粗壮，基部无愈伤组织，强光锻炼l周后，将幼苗用无菌水 冲洗后移栽到灭好菌的珍珠岩草炭二l: l混匀的基质中，培养室 炼苗，在幼苗上罩塑料杯用以保湿，2. e. 2每周浇灌1000倍的多菌灵和1/8MS营养液，并及时除去 发霉的叶片和茎杆，温室温度控制在22"C，相对湿度60%，光照强 度10001ux，2. e. 3待移栽出的幼苗长出新根和新叶，在春季地温升高至2°C 时移至大田，移栽后立即搭遮荫网并灌足定根水，逐渐揭开遮荫网， 并及时浇水和防病虫。
全文摘要
本发明公开了一种利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种技术，其目的就是采用胚挽救技术培育三倍体葡萄，克服葡萄二倍体与四倍体常规育种杂交胚早期败育的缺陷，获得杂种幼苗，再结合流式细胞术、去壁低渗法染色体计数对所得杂种后代进行倍性的早期鉴定，提高三倍体葡萄的育种效率，加速了三倍体葡萄品种的选育进程，将为培育大粒无核葡萄品种开创广阔的前景。
文档编号A01N3/00GK101283669SQ20081001827
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者唐冬梅, 张宗勤, 张朝红, 王跃进, 艳 石 申请人:西北农林科技大学