专利名称：：5,7,4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮的合成方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物除草和抗菌剂的合成，特别是一种5,7,4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮的合成方法和应用，具体是从化感品种水稻0o;za^rfh;a丄.(PI312777)中分离得到的化感物质一5,7，4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮(俗称小麦黄素)的化学合成及其在抑制稻田杂草和抗菌方面的应用。技术背景众所周知，在水稻的生长过程中，稻田中经常会有大量的杂草(譬如稗草等)伴生，与水稻争夺养分，影响水稻的长势；同时水稻也会受到各种病菌的侵害，导致水稻枯萎或死亡。一般来说，稻农为了除掉杂草或抑制病菌，往往会喷施除草剂或杀菌剂。但是，喷施除草剂或杀菌剂之类的化学试剂，除了会增加生产成本之外，还会带来农药残留的健康问题以及对环境的不友好。有研究表明，施用除草剂或杀菌剂会危及稻田的生态系统环境。1988夏季，美国水稻遗传育种学家Dilday在一个受杂草严重侵染的田间观察到个别水稻品种周围的杂草被排挤的现象，研究认为这种现象是由这些水稻的化感抑草作用而引起的，自此水稻化感作用的研究引起了世界各国政府和科学家的广泛关注。例如，孔垂华,徐效华，胡飞，等发表的'以特征次生物质为标记评价水稻品种及单株的化感潜力'.科学通报，2002，47:203206。植物化感是指一个活体植物通过茎叶挥发、淋溶、根系分泌和分解等途径向环境中释放其产生的某些化学物质，从而影响周围植物的生长和发育。利用水稻的化感作用控制田间杂草不仅能有效提高水稻产量、降低生产成本和增加稻农的收入，而且能避免化学除草剂对环境造成的危害，适应农作系统内"三效"兼顾及农业可持续发展的需求。除此之外，通过对化感物质的合成和修饰，可以发展防止杂草、抑制病菌的生物调控物质，开发对生态环境友好的农药化学品。
发明内容本发明的目的是提供一种5,7,4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮的合成方法和应用。5,7，4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮是从化感品种水稻C^za虚/vaL(PI312777)中分离得到的一种次生代谢物，经生物活性测试表明其有明显的抑制农田稗草、异型莎草和碎米莎草生长和阻止稻瘟霉和立枯丝核菌的孢子萌发的作用。利用该物质的化感作用可以在不向系统引入难降解的化学物质的情况下，有效得抑制稻田杂草，提高水稻产量，从而避免施用农药造成的大量残留所引发的一系列难以解决的问题，促进农业的可持续性发展。5，7,4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮(C17H1407)的化学结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>5,7,4-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮的合成合成路线为:具体步骤是1)乙醚作溶剂，苯三酚在氯化氢和氯化锌存在下与乙腈用冰盐浴冷却搅拌反应，冰箱中放置48小时，生成得固体产物用无水乙醚洗涤，然后将固体加热回流水溶解，静置，固体产物重结晶，得到化合物A(Hoesch反应)。2)紫丁香酸与氯苄在碱性的乙醇溶液中回流反应2h。减压旋去一半溶剂，剩余物用稀盐酸酸化，析出产物用95%乙醇重结晶，得化合物B。3)化合物B在微量无水吡啶存在下于二氯亚砜中加热回流2h,减压除去溶剂,得化合物C。4)-78。C下，在含六甲基二硅胺锂的THF中，化合物A与化合物C反应，反应液倾入HC1的冰水中，氯仿萃取，无水Na2S04干燥，减压蒸去溶剂，制得化合物D。5)化合物D在冰醋酸和少量硫酸加热条件下关环的同时脱去苄基得到目标化合物E。其反应式简单描述如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>该化合物能够有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和异型莎草种子的生长，同时也能阻止稻瘟霉和立枯丝核菌的孢子萌发。'本发明是以紫丁香酸和间苯三酚为起始原料，经四步以56%的收率合成了目标产物。为避免紫丁香酸羟基参与反应，发明采用苄基将其保护，此保护基可以在反应最后一步用冰醋酸加热关环的同时一并脱掉，减少了反应步骤。和用Pd/C通氢气脱节基的方法相比，该操作方法更加简单、经济、安全。本发明利用该物质的化感作用可以在不向系统引入难降解的化学物质的情况下，能够有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和异型莎草种子的生长，抑制稻ffl杂草，提高水稻产量。同时也能阻止稻瘟霉和立枯丝核菌的抱子萌发，从而避免施用农药造成的大量残留所引发的一系列难以解决的问题，促进农业的可持续性发展。图1含有该化感物质的水稻根分泌物在不同生测条件下对稗草和异型莎草的抑制性。图2不同浓度的化合物对稻瘟霉孢子萌发的抑制性。图3不同浓度的化合物对立枯丝核菌的孢子萌发的抑制性。具体实施方式实施例15,7，4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮的合成1)化合物A的合成(Hoesch反应)5.0g无水间苯三酚、3.5mL乙腈溶于165mL干燥的乙醚，冰盐浴冷却至-l(TC,搅拌下加入2.7g熔融氯化锌，接着通入干燥的氯化氢气体2h,然后将反应瓶密封于冰箱中放置1d，次闩继续通氯化氢气体2h,再于冰箱中放置1d，有桔色固体析出，过滤，滤饼用无水乙醚洗两次，然后用250mL水溶解转移至圆底烧瓶，加热回流lh，静置过夜，析出黄色固体，用水重结晶两次，得到淡黄色针状晶体5.8g，产率87%。NMR(300MHz,DMSO)52.37(s,3H，CH3C=0)，7.40(s,2H,Ar-H);l3CNMR(IOOMHz,DMSO)S33.09,95.09,64.62,164.96,203.10。2)化合物B的合成将10.0g紫丁香酸溶于50mL95%乙醇'加入17.4mL氯苄和26mL2mol/L的NaOH溶液，搅拌回流，接着缓慢滴加5mol/L的NaOH溶液40mL，反应2h。减压旋去一半溶剂，剩余物用稀盐酸酸化，析出大量浅黄色固体，抽滤，滤饼用水洗涤三次(3xl0mL)。用95%乙醇重结晶，得白色针状晶体12.8g，产率91%。NMR(400MHz,CDCl3)S3.89(s，6H,-OCH3):5.12(s，2H，OCH2-)，7.47(d，2H,^7.2，Ar-H)，7.30-7.36(m，5H,Ar-H);nCNMR(IOOMHz,CDC13)S56.44,75.22，107.61，124.47,128.27,128.44，128.68,137.51,141.99，153.52,172.13，190.0。3)化合物C的制备将5.0g化合物B溶于10mL二氯亚砜，滴加一滴无水吡啶，加热回流2h,减压除去溶剂，得浅黄色固体5.2g,产率9813/0。4)化合物D的制备将3.7mLHMDS(六甲基二硅氮垸)溶于8mL无水THF，降温至-78。C，氩气保护下缓慢滴加2.8mol/L的正丁基锂6.4mL，2min后，将制好的LiHMDS(六甲基二硅胺锂)在15min内加到化合物A的THF溶液中(500mg,15mL)，反应液于-78。C搅拌1h，-20°。搅拌2h。继续降温至-78。C，在10min内加入化合物C的THF溶液(0.91g,7.0mL)，于-78。C搅拌30min，室温搅拌4h，然后将反应液倾入HC1(20.0mL)的冰水(500.0g)溶液中，用50mL氯仿萃取三次，合并萃取液用无水Na2S04干燥，减压蒸去溶剂，制得化合物D，未经纯化直接用于下一步反应。5)目标化合物E的合成将D溶于14.8mL冰醋酸，滴加74pL浓硫酸，于100。C反应1h，减压蒸去醋酸，剩余物经硅胶柱层析,K筑仿:r丙s-8:l洗脱,收集黄色部分，浓縮得黄色固体621mg,第四、五步总产率63%。本步在关环脱水的同时，脱去苄基,制得目标产物。'HNMR(400MHz,DMSO)S12.96(s，1H，5國0H),10.82(s,H，7-0H),9.34(s，lH,4'-OH)，7.32(s,2H，2'6'—H),6.98(s，1H，3—H),6.56(d,/=2.4,1H,8—H),6.20(s，1H，6—H),3.88(s,6H,3'5'-H);l3CNMR(IOOMHz,DMSO):S81.76，163.88，163.59，161.37,157.32，148.10,139.64,120.45,104.36,103.66，98.68,94.18,56.35。实施例21)培养皿抑草生物活性测试在直径9cm的培养皿底部垫入一层滤纸，然后加入设定浓度的黄酮水溶液，另设只加蒸馏水的培养皿为对照。预先萌发的受试稗草或异型莎草种子，以每皿50粒均匀播入培养皿中，培养皿放入培养箱在25±1'C和12h光照条件下生长7d。收获各培养皿中的幼苗在8(TC。12h条件下干燥后称取干重。2)盆栽抑草生物活性测试50粒稗草或异型莎草种子均匀播入含150g水稻土的盆(5cmx7cm)中，待出苗后，每盆间苗至10株，并向盆中施入设定浓度的黄酮水溶液，对照则只加蒸馏水。盆放入培养箱在25±1。C和12h光照条件下生长14d。幼苗收获后，从根苗分界处剪切，地上部在80。C，24h条件下于燥后称取干重。两种条件下的生测均针对不同的受试杂草和处理溶液设置3个重复，抑制率为在相同条件下处理相对于对照幼苗干重的百分数。■所有数据均用SPSS10.0软件进行统计分析。表l5,7,4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮对稗草和异型莎草的抑制性(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>该物质在盆栽土壤生测条件下的抑制活性明显低于培养皿条件下的生测，这与土壤降低了该化感物质的有效浓度有关。包含此化感物质的水稻根分泌物在培养皿生测条件下抑制活性较低，但在盆栽土壤生测条件下的抑制活性显著增强。很显然，这与盆栽生测条件下的土壤载体有关。在培养皿生测条件下，根分泌物中的营养物质可以较长时间存在，而在土壤生测条件下，这些营养物质可以在土壤微生物及其它生物和非生物因子的作用下消耗或降解，这样导致它们对化感物质的拮抗作用降低而使化感物质能对杂草表现抑制性。表25，7，4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮对稗草、碎米莎曹和异型莎草的抑制性(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>该化合物能够有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和异型莎草种子的生长，其能够起到抑草作用的最低浓度是1g土壤中含11.3吗和6.8吗(在稗草和异型莎草中)，其在稗草、异型莎草和碎米莎草生长过程中的ICso值分别是200和100吗'g-l。3)抗菌活性测试将待测物用丙酮溶解，然后加入9cm培养皿中，再加入10mL无菌水，对照直接加入lOmL无菌水，向培养皿中加入已经灭菌的培养基(约50mL)摇匀，冷凝后待用。PDA培养基200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，0.1MPa灭菌30min。将稻瘟病、文枯病菌丝琼脂块接种于已冷凝的培养基上，28t:培养，培养4d，用纸片法测定抑菌圈直径，取菌落辐射生长长轴直径和短轴直径的平均值，每个浓度设为一个处理，每个处理稻瘟病6个重复，文枯病3个重复。抑制率用下式计算i+CK菌落平均直径-处理菌落平均直径菌丝生长抑制率%=-CK菌落平均直径结论该化合物不仅能显著的阻止稗草、异型莎草和碎米莎草种子的生长，同时也能阻止稻瘟霉和立枯丝核菌的孢子萌发(图2，3)。其在稻瘟霉和立枯丝核菌的孢子萌发中的IC50值分别是50和70吗'g-l。该化合物在250吗'g-l条件下能够完全阻止两种病原菌的萌发，而在同样浓度下却不能完全阻止三种种子的生长。权利要求1、一种5，7，4’-三羟基-3’，5’-二甲氧基黄酮的化学合成方法，其化学结构式为其特征在于包括的步骤具体步骤是1)乙醚作溶剂，间苯三酚在氯化氢和氯化锌存在下与乙腈用冰盐浴冷却搅拌反应，冰箱中放置48小时，生成得固体产物用无水乙醚洗涤，然后将固体加热回流水溶解，静置，固体产物重结晶，得到化合物A；2)紫丁香酸与氯苄在乙醇的碱溶液中回流反应2h；减压旋去一半溶剂，剩余物用稀盐酸酸化，析出产物用95％乙醇重结晶，得化合物B；3)化合物B在微量无水吡啶存在下于二氯亚砜中加热回流2h，减压除去溶剂，得化合物C；4)-78℃下，在含六甲基二硅胺锂的THF中，化合物A与化合物C反应，反应液倾入HCl的冰水中，氯仿萃取，无水Na2SO4干燥，减压蒸去溶剂，制得化合物D；5)化合物D在冰醋酸和少量硫酸加热条件下反应关环的同时脱去苄基得到目标化合物E。2、按照权利要求1所述的合成方法,其特征在于步骤所述的5)化合物D在冰醋酸和少量硫酸在IO(TC下加热反应1小时后，减压蒸去醋酸，剩余物经硅胶柱层析，1^仿:7翻=8:1洗脱，收集黄色部分产物。3、权利要求卜4所述的合成方法得到的5,7，4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮用于水稻田中的抑草、抗菌。全文摘要本发明涉及一种5，7，4’-三羟基-3’，5’-二甲氧基黄酮的合成方法和应用，具体是从化感品种水稻OryzasativaL.(PI312777)中分离得到的化感物质一5，7，4’-三羟基-3’，5’-二甲氧基黄酮的化学合成。以紫丁香酸和间苯三酚为起始原料，经四步合成了目标产物。采用苄基将其保护，在反应最后一步用冰醋酸加热关环的同时一并脱掉，减少了反应步骤。和用Pd/C通氢气脱苄基的方法相比，该操作方法更加简单、经济、安全。本发明能够有效阻止伴生在水稻中的稗草、碎米莎草和异型莎草种子的生长，抑制稻田杂草，提高水稻产量。同时也能阻止稻瘟霉和立枯丝核菌的孢子萌发，从而避免施用农药造成的大量残留所引发的一系列难以解决的问题，促进农业的可持续性发展。文档编号A01N43/16GK101239960SQ20081005234公开日2008年8月13日申请日期2008年2月28日优先权日2008年2月28日发明者刘爱国,孔垂华,艳崔,徐效华,朱应栋,程辉敏,谢龙观,华赵,炜高申请人:南开大学