专利名称：一种小麦-黑麦t2bl.1rs新易位系种质的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，创 制抗病、丰产性状优异的种质资源，属于农业生物技术育种研究领域。
技术背景小麦育种的突破取决于优异种质基因资源的发掘和利用。但是随着 现代农业耕作制度的改进，栽培小麦种内的遗传变异急剧减少，优异种 质资源日益匮乏。众多的研究表明，小麦近缘植物蕴藏着许多丰富的、 有价值的基因资源。通过远缘杂交，向栽培小麦种内导入外源优良基因， 拓宽小麦的遗传基础，既可创造新物种，又可选育出具有某种优良特性 的新类型。因此，发掘和利用近缘植物中的优异基因，创制优异种质材 料，就成为解决小麦育种种质资源匮乏的最佳途径。小麦近缘植物黑麦是改良小麦产量、品质和抗性的重要基因源。它 具有大穗、多小穗、籽粒蛋白质和赖氨酸含量高等特点，而且具有抗条 锈、杆锈、叶锈和白粉的基因以及染色体相互作用所产生的优良性状等 (参考文献Schlegel R, Melz G Korzun V (1998). Genes, markers and linkage data of rye (Secale cereale L.): 5th updated inventory. Euphytica 101: 32-67,; Mcintosh RA， Yamazaki Y, Devos KM, Dubcovsky J， Rogers WJ, Appels R (2003). Catalogue of gene symbols for wheat. In: Pogna NE，Romand M， Pogna EA， Galterio Q eds. Proceedings of the 10th International Wheat Genetics Symposium. Paestum, Italy, pp. 1-6.)。通过种间特定的染色体易位和替换，目前在育成的小麦品种中，小麦-黑麦 T1BL.1RS易位系占推广品种的10 70%，在我国则达到50 70%，它 们主要是黑麦品种Pekus的T1BL.1RS易位系。但是，近十多年来，随着新的条锈病和白粉病病原小种(或菌系) 的出现和优势小种(或菌系)的发展，黑麦品种IRS上的抗条锈病基因 rW，抗白粉病基因户mS已经失效，抗叶锈基因丄"6的抗性也表现不稳 定，致使生产上主栽的原有小麦-黑麦T1BL.1RS易位系的品种陆续丧失 了对当前病害流行菌系的抗性，急需发掘和利用黑麦新的抗病优异种质 资源，以培育多抗、高产的小麦优良新品种。 发明内容本发明的目的在于针对目前生产上主栽的T1BL.1RS易位系品种因 病原新小种(菌系)的出现而陆续丧失抗性的问题，为了克服抗病品种 的单一化，增加抗源的多样性，提供一个抗病、高产小麦-黑麦T2BL.1RS 新易位系种质的选育方法。本发明要解决的技术问题是通过如下技术方案实现的这种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征包括以下步骤a、 亲本选择选择普通小麦品种小偃6号为母本，以近缘植物黑 麦品种德国白粒为父本进行远缘杂交；b、 远缘杂交在母本小偃6号抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔 离；母本开花后第二天上午9 11点，下午3 4点用父本授粉，连续重复3次；授粉后继续套袋，在授粉16 18天后采集幼穗于4。C冰箱 中保存48 72小时；C、幼胚拯救培养剥离步骤b中获得的幼穗，将杂种Fo的幼胚于MS培养基上培养成苗，并在生根壮苗培养基上生根壮苗，4°C越夏， 经营养钵育苗后于当年的十月初移栽大田，获得根尖细胞染色体数目为 2n二28的F,幼胚再生植株；d、 秋水仙素半浸根法染色体加倍将步骤c中获得的幼胚再生植 株的部分根系，浸入0.05%的秋水仙素溶液中，进行染色体加倍，获得e、 鉴定、回交种植步骤d的Fi种子，获得根尖细胞染色体数目 加倍2n二56的F,植株；对Fi植株进行条锈病和白粉病的抗病性鉴定， 保留抗病的植株，并以步骤a中的原母本小偃6号作父本回交，获得回 交种子；f、 鉴定、自交种植步骤e获得的回交种子，对回交后代植株进 行细胞学鉴定，抗病性鉴定和农艺性状调査，定向选择综合性状优良的 单株自交，如此连续自交选育6代；采用连续的总基因组原位杂交技术 和三个探针的多色荧光原位杂交技术，对自交最终获得的根尖细胞染色 体数目为2n=42=21"W单株鉴定，黑麦的一对1RS染色体臂代换了小 麦的一对2BS染色体臂，确认为T2BL.1RS易位的小麦-黑麦新种质。所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于 步骤c所述的幼胚拯救培养的生根壮苗培养基是如下重量比例的MS 培养基50%、蔗糖2%、烯效唑0.025%、水余量。所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在于 步骤d所述的秋水仙素半浸根法染色体加倍是在次年春季3月中旬，在 步骤c中移栽到大田的F!幼胚再生植株一侧，挖一直径10cm左右的小 坑，露出1/2 2/3的根系，抖净泥土，其余根系仍留在土中，将10ml 小烧杯倾斜放入小坑内，把露出的根系分蘖节轻轻塞入小烧杯内，然后 用吸移管注入营养液浸没分蘖节，再在杯口处塞上浸过药液的棉花，在 坑口盖一块塑料膜，用土覆盖以减少药液蒸发，每天早、中、晚三次向 烧杯内添加营养液至浸没分蘖节，处理四天后，去掉烧杯，将根系至分 蘖节轻轻重新埋入土中，植株成熟收获时按单株考査结实情况，获得 Fj种子。所述小麦-黑麦T2BL.lRS新易位系种质的选育方法，其特征在于 所述的营养液是如下重量比例的秋水仙素0.05%、 二甲基亚砜1.5%、 MS培养基5M、水余量。所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在 于步骤e所述的抗病性鉴定包括人工接种鉴定对条锈病的抗性鉴定 以小麦品种铭贤169作感病对照，操作步骤为在每年春季3月上旬，在 麦苗的第一、二片心叶上去掉腊质后，用毛笔将条锈菌的病孢子涂抹在 第一、二片心叶上，并喷水保湿，两周后等感病对照铭贤169充分发病 时调查抗病性，用反应型表示0—免疫，0;—近免疫，1—高抗，2—中 抗，3—中感，4—高感。所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征在 于步骤e所述的抗病性鉴定包括自然诱发鉴定对白粉病的抗性操作步骤为在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔节期到灌浆期 45天内浇水3 4次以保持高湿环境，即可充分诱发白粉病，3 4周后 当感病对照铭贤169充分发病时调査抗病性，采用0 9级分级法O--免疫，1 2级--高抗，3 4级—中抗，5 6级—中感，7 9级—高感。本发明选育鉴定的小麦(小偃6号)-黑麦(德国白粒)T2BL.1RS 新易位系种质，不同于生产上一般常见的小麦-黑麦TlBL.lRS易位系， 它高抗条锈病当前流行菌系和白粉病的重要毒株，丰产性状优异，为培 育突破性的抗病、高产小麦新品种奠定了优异的种质基础。
图1为连续GISH (A)和FISH (B)鉴定小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的图谱图2为连续GISH (A)和FISH (B)鉴定小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的图谱图3显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗条锈病的鉴定结果 图4显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗白粉病的鉴定结果 图5显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的农艺性状 图6显示的为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的穗子和籽粒 图中图1A、图2A分别显示的是以digoxigenin-ll-dUTP标记的黑麦基 因组DNA为探针，中国春DNA为封组的GISH图谱，其中小麦染色体 显示红色，黑麦染色体表现绿色，表明黑麦的一对染色体臂导入了小麦， 取代了小麦的一对染色体臂，形成了小麦-黑麦易位系。图1B、图2B分别显示的是在图1A、图2A同一个细胞上(GISH)， 继续采用一组p/ZvG38 (绿色)/pScl19.2 (红色)探针(图1B)和另外 一组p^sl (绿色)/p&119.2 (红色)探针(图2B)的FISH鉴定结果。 图1B、图2B表明导入小麦的一对黑麦染色体臂是黑麦1R染色体的短 臂，即1RS染色体，与其对应的小麦染色体为2B染色体的长臂，即2BL 染色体。三个探针相结合鉴定全部染色体的FISH结果表明该小麦-黑麦 易位系为一个小麦-黑麦T2BL.1RS易位系。图3显示的是小麦-黑麦T2BL.lRS易位系抗条锈病的鉴定结果。其 中a为黑麦品种德国白粒，对条锈病表现0级(免疫)；b为T2BL.lRS 易位系，表现l级(高抗)；c为对照小麦品种石4185，表现4级(高 感)。图4显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系抗白粉病的鉴定结果。其 中a为对照品种石4185，对白粉病表现7级(高感)；b为黑麦品种德 国白粒，表现0级(免疫)；c为T2BL.lRS易位系，表现2级(高抗)。图5显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的农艺性状。其中图5A 为成熟的单株；图5B为大田未成熟时的表现。图6显示的是小麦-黑麦T2BL.1RS易位系的穗子(正面和侧面)和 籽粒。
具体实施方式
1、小麦(小偃6号)-黑麦(德国白粒)T2BL.1RS新易位系种质 的选育方法a、亲本选择小麦品种小偃6号(7H"cww ae幼Vww L.， 2n=42，AABBDD)，是由李振声院士等利用长穗偃麦草和普通小麦远缘杂交选 育出的一个冬小麦品种，具有优质、早熟、抗逆性强，适应性广的特点， 被誉为我国小麦远缘杂交育种中表现最突出的品种，是我国小麦育种重 要的骨干亲本之一，但由于品种-…菌群互动，目前己丧失了对条锈病 和白粉病的抗性。黑麦为小麦的一个近缘种，是改良小麦产量、品质和抗性的重要基 因源，具有抗条锈、杆锈、叶锈，白粉、叶斑病和抗嫁虫的特性。黑麦 作为异交植物，不同品种之间甚至品种内部都具有较高的遗传多样性。 选择对条锈病当前流行菌系和白粉病毒株免疫的黑麦品种德国白粒 (5feca/e cerea/e L,; cv, German White, 2n=14， RR)为亲本，以期将黑 麦的抗病性导入遗传背景优良的骨干亲本小偃6号中，创制优异种质资 源。b、远缘杂交以小偃6号为母本，以黑麦品种德国白粒为父本， 配制杂交组合。在母本小偃6号抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔离； 母本开花后第二天上午9 11点，下午3 4点用父本授粉，连续重复3 次(天)；授粉后继续套袋，在授粉16 18天后采集幼穗于4。C冰箱中 保存48 72小时；C、幼胚拯救培养由于远缘杂交获得的Fo有胚无乳，必需进行幼胚拯救培养才能生长成苗。因此，需剥离步骤b中获得的幼穗，将杂种Fo的幼胚于MS培养基上培养成苗，并在成分是如下重量比例的"MS 培养基50%、蔗糖2%、烯效唑0.025%、水余量。"生根壮苗培养基上 生根壮苗，4。C越夏，经营养钵育苗后于当年的十月初移栽大田，获得Fi幼胚再生植株。d、 秋水仙素半浸根法染色体加倍通过根尖细胞染色体和花粉母 细胞染色体制片，在显微镜下进行观察，F,幼胚再生植株根尖细胞的染色体数目为2n=28;花粉母细胞染色体的构型为2n=21'W+7'R。由于 F,幼胚再生植株不结实，因此必需通过染色体加倍获得后代种子。具体 操作是在次年春季3月中旬，在步骤c中移栽到大田的幼胚再生植株 一侧，挖一直径10cm左右的小坑，露出l/2 2/3的根系，抖净泥土， 其余根系仍留在土中，将lOml小烧杯倾斜放入小坑内，把露出的根系 分蘖节轻轻塞入小烧杯内，然后用吸移管注入是如下重量比例的"秋 水仙素0.05%、 二甲基亚砜1.5%、 MS培养基5。/。、水余量。"营养液浸 没分蘖节，再在杯口处塞上浸过药液的棉花，在坑口盖一块塑料膜，用 土覆盖以减少药液蒸发。每天早、中、晚三次向烧杯内添加药液至浸没 分蘖节，处理四天后，去掉烧杯，将根系至分蘖节轻轻重新埋入土中。 植株成熟收获时按单株考查结实情况，获得Fi种子；e、 鉴定、回交种植步骤d的FJ中子，获得染色体加倍的F,植株。 经细胞学鉴定，其根尖细胞的染色体数目为211=56。人工接种鉴定对条 锈病；自然诱发鉴定对白粉病的抗性，保留抗病的植株，并以步骤a中 的亲本小偃6号作父本回交，获得回交种子。人工接种鉴定对条锈病的抗性以小麦品种铭贤169作感病对照， 操作步骤为在每年春季3月上旬，在麦苗的第一、二片心叶上去掉腊质 后，用毛笔将条锈菌的病孢子涂抹在第一、二片心叶上，并喷水保湿， 两周后等感病对照铭贤169充分发病时调査抗病性，用反应型表示0-免疫，0;—近免疫，1—高抗，2—中抗，3—中感，4—高感。自然诱发鉴定对白粉病的抗性 一般在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在拔节期到灌浆期45天内浇水3 4次以保持高湿环境， 即可充分诱发白粉病。3 4周后当感病对照铭贤169充分发病时调查抗 病性，采用0 9级分级法0—免疫，1 2级—高抗，3 4级—中抗，5 6级--中感，7 9级—高感。农艺性状的精准鉴定通过对每一代小麦-黑麦材料进行农艺性状 的详细调查，包括株高，穗数，小穗数，穗粒数，不育小穗数，粒色，籽粒饱满度、千粒重等，并以小麦区试对照品种石4185和亲本小偃6 号为对照，定向选择丰产性状优良的后代材料。f、鉴定、自交种植步骤e获得的回交种子，对回交后代植株进 行细胞学鉴定；人工接种鉴定对条锈病当前流行菌系；自然诱发鉴定对 白粉病的抗性；精准鉴定综合农艺性状。定向选择形态特征趋向普通小 麦，育性正常，综合农艺性状优良，高抗或免疫条锈病和白粉病的单株 进行自交，如此连续自交选育6代，最终获得编号为WR04-32的小麦-黑麦材料。2、小麦(小偃6号)-黑麦(德国白粒)T2BL.1RS新易位系种质 的鉴定结果2-1、连续基因组原位杂交(GISH、 FISH)鉴定由中科院遗传与 发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室，对步骤f中 获得的细胞学稳定的小麦-黑麦材料WR04-32 (2n=42=21"W)，采用连 续的总基因组原位杂交技术(GISH)和三个探针的多色荧光原位杂交技术(FISH)相结合，准确识别鉴定全部黑麦染色体(片段)和小麦染色体 (片段)的归属，确定小麦-黑麦易位系的组成。其中以黑麦基因组为 探针，中国春为封组的GISH表明，小麦染色体(染色体片段)显示红 色，黑麦染色体(染色体片段)表现绿色，证明步骤f中获得的材料 WR04-32为一个小麦-黑麦易位系，如图1A，图2A所示。进一步在GISH 的同一个细胞上，采用p/7vG38 (绿色)/p5bl19.2 (红色)和pjsl (绿 色)/p5H19.2 (红色)两组探针结合的FISH表明，步骤f中获得的材 料WR04-32为黑麦的一对1RS染色体臂代换了小麦的一对2BS染色体 臂，确认为小麦-黑麦T2BLlRS易位系，如图1B，图2B所示。2-2、抗病性综合鉴定在中科院栾城国家生态系统观测台站病圃 连续4年的抗病性鉴定结果表明，小麦-黑麦材料WR04-32高抗至免疫 条锈病当前流行菌系(CY30、 CY31、 CY32和水源类型)的混合菌系。 由中国农科院植保所进行的苗期分小种抗病性鉴定结果表明，WR04-32 免疫至近免疫条中CY28 (0-0;级)，免疫CY29; CY30和CY31 (0级)， 高抗CY32 (l级)。条锈病成株期抗性鉴定结果表明，WR04-32免疫条 中CY31 (0级)，高抗CY32 (l级)，高抗条锈病当前流行的混合菌系 (条中29号、条中30号、条中31号、条中32号、Su-4、 Su-6、 Su-ll、 Su-12、 Su-14)。对白粉病自然诱发鉴定和混合菌系的接种鉴定表现高抗 (2级)。WR04-32的亲本小偃6号均高感条锈病和白粉病；黑麦品种 德国白粒均免疫条锈病和白粉病。目前生产上主栽的T1BL.1RS易位系 的代表性品种石4185 (国家区域试验对照品种)不论对条锈病(4级)和 白粉病(7级)也均表现高感，如图3、图4所示。2-3、农艺性状的精准鉴定最终选育出的代号为WR04-32的小麦-黑麦T2BL.lRS 易位系， 表现半冬性，中早熟，株高75cm左右，叶片 上挺，株型紧凑，茎秆粗壮，抗倒伏性强。穗层整齐，分蘖力强，成穗 率高(15个)，平均小穗数24个，穗粒数68个。穗长方型，长芒，白 壳，白粒，硬质。穗大、粒多，籽粒椭圆型，饱满度好，千粒重40-42g。作为一个种质材料，小麦/黑麦T2BL.lRS易位系突出特点是由于外 源黑麦染色体的导入，其高抗条锈病(图3)、白粉病(图4)，综合抗 病性强，并且株型紧凑，穗层整齐，分蘖力强，产量性状优异，如图5 和图6所示。为了促进小麦/黑麦种质资源的有效利用，目前利用小麦-黑麦T2BL.1RS易位系已经配置了 100多个杂交组合。本发明列举的实施例旨在进一步地阐述小麦-黑麦T2BL.1RS新易 位系种质的选育鉴定方法，而不对本发明的范围构成任何限制。
权利要求
1. 一种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征包括以下步骤a、亲本选择选择普通小麦品种小偃6号为母本，以近缘植物黑麦品种德国白粒为父本进行远缘杂交；b、远缘杂交在母本小偃6号抽穗后第二天人工去雄，后套袋隔离；母本开花后第二天上午9～11点，下午3～4点用父本授粉，连续重复3次；授粉后继续套袋，在授粉16～18天后采集幼穗于4℃冰箱中保存48～72小时；c、幼胚拯救培养剥离步骤b中获得的幼穗，将杂种F0的幼胚于MS培养基上培养成苗，并在生根壮苗培养基上生根壮苗，4℃越夏，经营养钵育苗后于当年的十月初移栽大田，获得根尖细胞染色体数目为2n＝28的F1幼胚再生植株；d、秋水仙素半浸根法染色体加倍将步骤c中获得的幼胚再生植株的部分根系，浸入0.05％的秋水仙素溶液中，进行染色体加倍，获得F1种子；e、鉴定、回交种植步骤d的F1种子，获得根尖细胞染色体数目加倍2n＝56的F1植株；对F1植株进行条锈病和白粉病的抗病性鉴定，保留抗病的植株，并以步骤a中的原母本小偃6号作父本回交，获得回交种子；f、鉴定、自交种植步骤e获得的回交种子，对回交后代植株进行细胞学鉴定，抗病性鉴定和农艺性状调查，定向选择综合性状优良的单株自交，如此连续自交选育6代；采用连续的总基因组原位杂交技术和三个探针的多色荧光原位杂交技术，对自交最终获得的根尖细胞染色体数目为2n＝42＝21″W单株鉴定，黑麦的一对1RS染色体臂代换了小麦的一对2BS染色体臂，确认为T2BL.1RS易位的小麦-黑麦新种质。
2、 根据权利要求1所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方 法，其特征在于步骤c所述的幼胚拯救培养的生根壮苗培养基是如下 重量比例的MS培养基50n/c)、蔗糖2%、烯效唑0.025%、水余量。
3、 根据权利要求1所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方 法，其特征在于步骤d所述的秋水仙素半浸根法染色体加倍是在次年 春季3月中旬，在步骤c中移栽到大田的F!幼胚再生植株一侧，挖一直 径10cm左右的小坑，露出1/2 2/3的根系，抖净泥土，其余根系仍留在 土中，将10ml小烧杯倾斜放入小坑内，把露出的根系分蘖节轻轻塞入小 烧杯内，然后用吸移管注入营养液浸没分蘖节，再在杯口处塞上浸过药 液的棉花，在坑口盖一块塑料膜，用土覆盖以减少药液蒸发，每天早、 中、晚三次向烧杯内添加营养液至浸没分蘖节，处理四天后，去掉烧杯， 将根系至分蘖节轻轻重新埋入土中，植株成熟收获时按单株考査结实情 况，获得Fi种子。
4、 根据权利要求3所述小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方 法，其特征在于所述的营养液是如下重量比例的秋水仙素0.05%、 二甲 基亚砜1.5%、 MS培养基5。/。、水余量。
5、 根据权利要求1所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育 方法，其特征在于步骤e所述的抗病性鉴定包括人工接种鉴定对条锈 病的抗性鉴定以小麦品种铭贤169作感病对照，操作步骤为在每年春 季3月上旬，在麦苗的第一、二片心叶上去掉腊质后，用毛笔将条锈菌 的病孢子涂抹在第一、二片心叶上，并喷水保湿，两周后等感病对照铭 贤169充分发病时调查抗病性，用反应型表示0-免疫，0;--近免疫， 1—高抗，2—中抗，3—中感，4—高感。
6、 根据权利要求1所述的小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育 方法，其特征在于步骤e所述的抗病性鉴定包括自然诱发鉴定对白粉 病的抗性操作步骤为在每年春季4月初，在自然菌源充足的病圃，在 拔节期到灌浆期45天内浇水3 4次以保持高湿环境，即可充分诱发白 粉病，3 4周后当感病对照铭贤169充分发病时调查抗病性，采用0 9 级分级法0—免疫，1 2级—高抗，3 4级—中抗，5 6级—中感，7 9级--高感。
全文摘要
本发明提出一种小麦-黑麦T2BL.1RS新易位系种质的选育方法，其特征包括选择普通小麦品种小偃6号为母本，以近缘植物黑麦品种德国白粒为父本进行远缘杂交；经过幼胚拯救培养，秋水仙素半浸根法染色体加倍获得种子，再经抗病性鉴定、细胞学鉴定、并以原亲本小偃6号作父本回交，获得回交种子；再经抗病性鉴定、细胞学鉴定，定向选择综合性状优良的单株自交，如此连续自交选育6代，最终获得的单株经采用连续的总基因组原位杂交技术和三个探针的多色荧光原位杂交技术鉴定，确认为小麦-黑麦T2BL.1RS易位系。它高抗条锈病当前流行菌系和白粉病的重要毒株，丰产性状优异，为培育突破性的抗病、高产小麦新品种奠定了优异的种质基础。
文档编号A01H1/04GK101263782SQ200810054899
公开日2008年9月17日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者安调过, 张晓天, 滨 李, 王春梅, 王瑞芳, 琪 郑, 强 高 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所