专利名称：一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种杜仲毛状 根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化杜仲并获 得产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根的具体程序。本发明还提供利用基因工程技术获得的高产 桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根及其培养的子代。
背景技术：
植物次生代谢产物具有十分重要的经济学功能，在工农业生产和人们的日常生活中 具有广阔的应用前景，其中在天然药物开发中的地位尤为引人瞩目，然而至今仍没有找 到有效的或成熟的合成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长迅速、、 合成次生代谢物质能力强且遗传稳定性稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于 Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为 药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。
目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛状 根的相关研究较多，但对遗传转化杜仲获得产环烯醚萜类药用成分毛状根的研究仍是空 白。杜仲(五wcomm/a w/woW^ Oliv.)为杜仲科植物，是我国特有经济林木和名贵药用植 物。近年来药理上已证实杜仲在心血管系统、免疫系统、消化系统、性激素样作用和抗 菌保肝防癌等方面有较好的药理作用而被广泛用于医疗事业。但由于人们超量滥挖，绝 大部分地区杜仲濒临灭绝，加之杜仲生长周期长，恢复生产非一时能够见效。因而，寻 找新的药源十分必要。毛状根具有生长迅速、遗传稳定、能在无激素的培养基上生长等 特点，并且还能够合成与原植物含量相当或高于原植物含量的次生代谢产物，在植物细 胞工程领域具有较大的优势。因此毛状根培养已成为近年来发展起来的生产药用植物有 效次生代谢物的理想培养系统。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种转基因技术遗传转化杜仲获得产药用成分桃叶珊 瑚甙的毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入杜仲中，获得杜仲毛状根。
本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿主 细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是杜仲。 本发明的技术方案如下
一种获得产桃叶珊瑚甙杜仲毛状根的方法和利用该方法获得的产桃叶珊瑚甙的杜 仲毛状根，该毛状根是一种采用本发明所述方法创造的新生命体。 该方法步骤如下
1、 杜仲无菌外植体的获得；
2、 采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到杜仲细胞、组织、器官 或植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗 传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤
A、 活化发根农杆菌；
B、 用发根农杆菌浸染杜仲无菌外植体；
C、 发根农杆菌与杜仲无菌外植体的共培养，步骤如下
I、 将侵染后的杜仲外植体接种于添加100^moH/1乙酰丁香酮的MS固
体培养基上；
II、 置于温度为25'C土1.(TC恒温暗培养1 5天；
D、 外植体的除菌培养
3、 杜仲毛状根的获得与继代培养；
4、 杜仲毛状根的分子检测，方法如下-
A、 提取杜仲毛状根DNA;
B、 获得含ra/B和ro/C引物的PCR反应体系；
C、 PCR反应扩增毛状根特有基因ra/B和raZC;
D、 电泳检测目标条带；
5、 杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙的含量检测。
用上述方法获得的生命体，它是可生产环烯醚萜类药用成分的杜仲毛状根。 在本发明中，术语"生命体"指杜仲的细胞、组织、器官、植株。
在本发明中，术语"任何转基因方法"包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基 因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。
在本发明中，术语"在特定的条件下筛选和鉴定转化子"是指用在离体培养的条件 下根据毛状根的特殊形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、 Southern杂交、
Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。
在本发明中，术语"在适合的条件下培养杜仲毛状根"是指对经过鉴定的杜仲毛状 根离体培养，并检测桃叶珊瑚甙的含量，筛选桃叶珊瑚甙含量提高的优良转化子进行培 养，获得其后代。
在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入杜仲细胞获得 转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得桃叶珊瑚甙含量相对较高而稳定的毛状根无性 系，为桃叶珊瑚甙的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l
杜仲无菌外植体的获得
方法利用外植体建立杜仲无菌外植体
大小均匀一致的当年生新鲜杜仲种子(弃种皮)，0.4mg七"赤霉素(GA)浸泡24 小时；然后用0.1% (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡12分钟，无菌水冲洗5次；接着用 无菌纸吸干表面水分，并将其接种在基本培养基中(培养基盛于150mL三角瓶中，于 121。C灭菌20分钟)，该培养基配方为MS + 0.4 mg'I/1 GA， 30g'L"蔗糖，pH值为5.8， 再添加7.5g丄"的琼脂粉。在光照培养箱中培养杜仲的叶片，培养条件为25'C， 12h-d'1 光照，光照强度为55^11101.111-2<1。 40天后，杜仲种子经过吸胀、露白和成苗三个阶段， 诱导获得无菌的杜仲无菌幼苗，待其枝叶着生完全后可用于遗传转化。
实施例2
发根农杆菌遗传转化杜仲获得毛状根
1、发根农杆菌C58C1 (西南大学生物工程与生物技术教研室培养)。使用前自超 低温冰箱取出200 ^，接种于25 ml YEB液体培养基中(添加利福平终浓度为40 mg丄—1), 28°C， 200rpm振荡培养两次，复苏菌体。 2、 第二次活化培养结束两小时前加入乙酰丁香酮，使其终浓度达到100 /mioH/1 也即菌液OD6(K)=0.3时，加入乙酰丁香酮，继续28°C， 200 rpm振荡培养，菌液OD6M=0.5 时，可用于转化。
3、 室温下4000 rpm离心10分钟，弃上清，菌体用等体积MS液体培养基(含100 /rniol七—1乙酰丁香酮)悬浮，在28°C， 200 rp振荡培养30分钟，使菌液浓度达到的 OD60(p0.6左右，成为转化液，此时可用于杜仲的遗传转化；1、 2、 3个步骤称为活化
发根农杆菌。
4、 发根农杆菌与杜仲的共培养取无菌杜仲幼嫩真叶、子叶和胚轴各30份左右，
用无菌解剖针戳一些圆形伤口，放入上述转化液中，浸染5 25分钟后取出，用无菌卫 生纸吸干，接种于添加100/miol丄"乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养1~5天，培 养条件为25°C，无光照。
5、 杜仲的除菌培养共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转 移至无植物生长调节物的MS固体除菌培养基(添加500mg丄"头孢菌素以达到除菌的 目的)中培养，培养条件为25°C，黑暗条件下培养。10天后，在杜仲受伤的部位开 始出现毛状根。
6、 杜仲毛状根的获得与继代培养外植体每隔3天转入新鲜的同样的培养基中，
待转化外植体上诱导出的毛状根长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无 植物生长调节物的1/2 MS固体培养基上(添加500mg乇"头孢菌素以达到除菌的目的) 继代培养；在无植物生长调节物的1/2 MS固体培养基上生长的杜仲毛状根表现出毛状 根特有的形态学特征生长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性。以后每15 20天 继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除；然后分别转入1/2MS、 1/2MS+IBA0.2 mg.1/1固体培养基和1/2 MS液体培养基上继代培养。
实施例3
杜仲毛状根的分子检测
1、杜仲毛状根基因组DNA的提取，方法如下
(1) 取200mg液体培养两周的毛状根，过滤后用10mL蒸馏水洗涤，充分吸干， 液氮速冻，研磨成粉。
(2) 1.5 mLEppendorf管中，加500 ;/L抽提buffer (3%巯基乙醇)，充分震荡65 'C水浴50分钟，每5分钟颠倒混匀。
(3) 4°C、 12,000rpm，离心10分钟。
(4) 吸上清，加500pL酚氯仿异戊醇(25:24:1)，轻轻混匀，静置5分钟钟
至分层。
(5) 室温，12,000rpm，离心10分钟。
(6) 吸上清约350 /zL,加等体积的氯仿异戊醇(24:1),轻轻混匀，静置5分 钟至分层。
(7) 室温，12,000 rpm，离心10分钟。
(8) 吸上清约250 ^L，加2倍体积的无水乙醇(一2(TC预冷)，充分混匀，室温 放置10分钟见有絮状DNA析出。
(9) 室温，12,000 rpm，离心10分钟。
(10) 弃上清，沉淀用75%的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置IO 分钟，使乙醇挥发完全。
(11) 力B1 ;/LRNAase， 50//LTE，混匀，37。C水浴30—40分钟。
(12) 加40;/L氯仿，轻轻混匀，静置5分钟至分层。
(13) 室温，12,000rpm，离心10分钟。
(14) 吸取上清(约35〃L)到新Eppendorf管中，一2(TC保存，用于PCR检测。
抽提缓冲液配方如下
100mM Tris-HCl(pH8.0)
2.5%(V/V) 巯基乙醇
500mM NaCl
20mM EDTA
1.5%(W/V) SDS
2、杜仲毛状根中ra/B和ra/C基因的PCR检测
诱发并维持毛状根形态的w/5和ra/C基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。基因 检测的PCR引物n /B (423 bp )的引物为/ra氾(5 ， -GCT CTT GC A GTG CT A GAT TT-3，)，见序列表l， m /B (5，-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3，)，见序列表 2; ra/C (626 bp)的引物为/ro/C (5，-TAACATGGC TGAAGACGACC-3，)，见序 列表3， m /C (5，-AAACTTGCACTCGCCATGCC-3，)，见序列表4。
反应体系均为(25 //L): ddH20 18 //L， 10 x PCR buffer 2.5 //L， 25 mmoI/L MgCL2 2.0 ;/L， 10 mmol'L—1 dNTP mix 0.25 //L， 10 mmol/L primerl 0.25 //L， 10 mmol/L primer 20.25
pL， 71^ DNApolymerase 0.25 〃L (1.25 U)， Template基因组DNA 1.5//L。
PCR反应程序94。C 5min—35循环(94°C for40 sec—55°C for40 sec—72°C for
lmin)—72°C 8 min。阳性对照为相应的工程菌，杜仲的天然叶片作为阴性对照。PCR
产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。的扩增条带大小为423 bp， w/c为626bp。
实施例4
杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙含量与野生根中的含量比较
1、 桃叶珊瑚甙对照品的HPLC标准曲线的制作
Waters高效液相色谱仪Waters 1525型泵，Waters 2487型检测池。色谱条件色 谱柱为COSMOSILCirPAQ柱(4.6mmx250mm， 5(am);流动相为乙腈-水相(85:15)， 其中水相为水-四氢呋喃(THF)-H3P04 (85:12:0.3)，流速为1.0 mL/min，检测波长为 210nm。标准曲线绘制桃叶珊瑚武标准品(购自sigma公司)，以1000、 500、 250、 100、 50、 25、 10、 5ng'mL"标准液作HPLC分析。每一浓度进样三次记录图谱及色谱 参数，分别以峰面积和进样量(/^ml/1)进行线性回归，以进样量为横坐标，对照品 峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
2、 杜仲中桃叶珊瑚甙含量的测定
通过分子检测且长势良好的杜仲毛状根称取鲜重后于50 'C下烘干，称重后研磨成 粉，称取150mg毛状根干粉用10mL72。/。的乙醇水溶液超声破碎(60 kHz) 30min，过 滤，重复一次，合并滤液。滤液于旋转蒸干仪上浓缩蒸干(50°C)，用甲醇(色谱级) 定容至10mL， -2(TC保存，作为供试样品溶液。对照为以同样方法提取的自然杜仲根 及皮供试样品溶液。样液于测定前用0.45 pm微孔滤膜过滤备用。
HPLC含量测定结果为杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙的含量最高达30.105wg'1 DW， 高于自然根及皮；在三种培养方式中，液体培养的毛状根系生物量增长最快，桃叶珊瑚 甙含量最高，1/2MS+IBA固体培养的毛状根系较1/2MS固体培养的毛状根系而言生物 量大，但是其桃叶珊瑚甙含量远不如1/2MS固体培养的毛状根系。可见杜仲毛状根的 诱导和培养技术是获取桃叶珊瑚甙的高效策略。
序列表
<110>西南大学
<120> —种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法 <130>无
<160> 4
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
gctcttgcag tgctagattt 20
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2
gaaggtgcaa gctacctcte 20
<210> 3 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3
taacatggct gaagacgacc 20
<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4
aaacttgcac tcgccatgcc 20
权利要求
1.一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化杜仲的细胞、组织、器官或植株，其步骤如下(1)杜仲无菌外植体的获得；(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到杜仲细胞、组织、器官或植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤A、活化发根农杆菌；B、用发根农杆菌浸染杜仲无菌外植体；C、发根农杆菌与杜仲无菌外植体的共培养，步骤如下I、将侵染后的杜仲外植体接种于添加100μmol·L-1乙酰丁香酮的MS固体培养基上；II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天；D、外植体的除菌培养共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转移至无植物生长调节物的MS固体除菌培养基中培养，培养条件为25℃，黑暗条件下培养，10天后，在杜仲受伤的部位开始出现毛状根；(3)杜仲毛状根的获得与继代培养；外植体每隔3天转入新鲜的同样的培养基中，待转化外植体上诱导出的毛状根长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2MS固体除菌培养基上继代培养；以后每15～20天继代培养一次，继代5次后，去除农杆菌；然后分别转入1/2MS、1/2MS+IBA 0.2mg·L-1固体培养基和1/2MS液体培养基上继代培养；(4)杜仲毛状根的分子检测，方法如下A、提取杜仲毛状根DNA；B、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；C、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；D、电泳检测目标条带；(5)杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙的含量检测。
2、 根据权利要求1所述的杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法， 特征在于，在杜仲毛状根的分子检测步骤中基因检测的PCR引物ra氾的引物为:^o/B(5，-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT- 3，)，见序列表1 ， m>/B (5，-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC- 3，)，见序列表2; w/C的引物为#o/C (5，-TAACAT GGC TGA AGA CGA CC隱3，)，见序列表3， m /C (5，-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC- 3，)，见 序列表4;反应体系均为ddH20 18^/L， 10 x PCRbuffer 2.5 j L， 25 mmol/L MgCL2 2.0 PL, 10 mmol丄-1 dNTP mix 0.25/iL， 10 mmol/L primer 1 0.25 //L， 10 mmol/L primer2 20.25 ^L， Tag DNApolymerase 0.25 pL， Template基因组DNA 1.5 ;/L。
3. 用权利要求1或2所述方法获得产桃叶珊瑚甙的杜仲的毛状根，其特征在于其 基因组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。
4. 用权利要求3所述方法获得杜仲毛状根的后代。
全文摘要
本发明提供了一种杜仲毛状根诱导生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，遗传转化获得可生产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根，其过程是用发根农杆菌遗传转化杜仲，获得了杜仲毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的杜仲毛状根能够生产桃叶珊瑚甙。本方法可以为药用成分桃叶珊瑚甙的生产提供一种新型可持续的新型药源。
文档编号A01H5/06GK101358197SQ200810070260
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者敏 孙, 孙一铭, 蕊 杨, 桅 雷 申请人:西南大学