专利名称：：一种石斛种质资源的保存和保存后的恢复方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，具体地说涉及一种石斛属植物种质资源的保存和保存后的恢复方法。
背景技术：
：石斛属是兰科植物中的第二个大属。全世界有石斛属植物1600多种，在我国有76种。约1/4的石斛属植物可作观赏用，以花色艳丽而著称。石斛药用的记载始见于《神农本草经》，被列为上品，是"九大仙草"之首。根据《中国药典》2005版的记载，石斛具有益胃生津，滋阴清热的功效，还有利嗓明目，调节人体免疫力作用。可以说石斛集药用和观赏于一体，具有非常高的价值。国内一些名贵药用石斛资源奇缺，如铁皮石斛、金钗石斛、齿瓣石斛、鼓槌石斛等等，尤其是铁皮石斛的价格不断飚升，目前干品的价格已经到了每公斤2万多元。在利益驱动下，产区药农对野生资源毁灭性采挖，加之石斛繁殖率低，生长缓慢等特点，很多种类处于极度濒危状态，部分名贵野生石斛资源已经列入国家保护植物名录。目前，对于石斛属植物资源的保存方法主要是通过组织培养获得无菌苗，无菌苗在光照培养条件下无性繁殖继代，保持资源的延续。该方法存在的问题是多次的无性繁殖继代会导致种质的优良性状退化甚至消失，表现为植株生长缓慢，开花延迟或花朵变小，有效成分含量降低，从而造成植株的观赏价值和药用价值大幅度降低，不利于资源的保护。石斛属植物的蒴果保存期限很短，在常温或0-4'C的低温条件下保存2-3周就会开裂。为了克服无性繁殖无菌苗保存种质的缺点，同时也为了解决石斛的濒危现状，研究石斛种质资源的新的保存方法变得日益迫切。结合种子有性繁殖和组织培养技术成熟的优势，我们发明了一种全新的石斛种质资源保存方法。经检索，国内外未见此方面的报道。
发明内容本发明的目的是提供一套适合于石斛属植物种子、原球茎或幼苗的长期保存和恢复的技术方法。该方法操作工艺简便、效率高，种质恢复使用时方便快捷，能够实现大规模的种质资源保存。为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案1、保存的种质材料可以为种子或原球茎或幼苗；2、种质材料的保存条件为温度l-3(TC，光照红光或黄光或绿光或蓝光或无光。3、保存后的种质的恢复条件为温度8-3(TC，自然光或日光灯，每日光照l-24小时，光照强度500-6000Lx。该方法可应用于石斛属植物种质资源的研究及规模化生产。与以往的种质资源保存方法相比，本发明采用的技术方法具有以下优点1.保存的种质质量稳定，种质保存时间长，能够保持种质的优良性状。2.保存工艺简便，种质失活的风险低。3.技术稳定，可重复性强。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。但本发明的内容并不仅仅局限于此。实施例1:种质材料为广西南宁铁皮石斛野生植株生长的果实，果实表面消毒后，得到无菌的种子。种子保存在琼脂培养基上，保存条件为温度10-15'C，黄光光照。在种质保存1年和2年后分别取出部分种质材料转移到种质恢复条件下温度为18-25'C，光照培养，光照为自然光，每日光照8-10小时，光照强度为1600-2500Lx，在恢复条件下培养一个月后，种子播种到常规无菌萌发培养基上检查存活情况，培养基组成为大量元素减半的MS培养基，添加3.0%蔗糖，0.01%肌醇，0.85%琼脂粉，pH5.7。培养2个月时种子萌发，保存1年的种子的萌发率为91.5%，保存2年的种子的萌发率为90.6%，说明铁皮石斛种子长期保存后，其萌发能力不下降。萌发的种子继续培养能够形成正常的植株。实施例2:种质材料为广西南宁铁皮石斛野生植株生长的果实，果实表面消毒后，得到无菌的种子。种子播种到常规兰科种子无菌萌发培养基上，培养基为N6培养基，添加5%蔗糖，0.9%琼脂粉，pH5.8。在温度为25士2。C，每日光照10小时，光照强度为1000Lx的环境中诱导种子萌发形成幼苗。6个月后种质材料转移到种质保存条件中蓝光光照，温度10-15"C。种质材料保存2年和3年后，将幼苗转移到恢复条件下温度10-15'C，光照培养，光照由日光灯产生，每日光照18小时，光照强度为2500Lx，经过l个月的培养，保存的种质材料都恢复正常生长。其生物学性状与直接光照培养获得的幼苗相同。由于长期不继代，防止了幼苗的退化。实施例3:在贵州省赤水市的金钗石斛野生抚育区采摘蒴果。果实表面消毒后，得到无菌的种子。种子播种到琼脂培养基上，保存在种质保存条件中温度20-25X:，绿光光照。保存2.5年后，把种质材料转移到恢复环境条件下温度为20-25°C，光照培养，光照由日光灯产生，光照强度为2500Lx，每日光照16小时。在恢复条件下培养一个月后，把种子播种到常规无菌萌发培养基上检查种子的存活情况，经验证，种子具有活力，种子萌发率为75.3%，继续培养形成正常植株。实施例4:在云南西双版纳采集齿瓣石斛果实，果实表面消毒后，得到无菌的种子。种子播种到常规兰科种子无菌萌发培养基上，培养基组成为大量元素减半的MS培养基，添加3.0%蔗糖，0.01%肌醇，0.85%琼脂粉，pH5.7。培养在温度25±2°C，每日光照12小时，光照强度为1000Lx的环境中，培养3个月后种子萌发形成幼苗。把幼苗保存在种质保存条件中无光照，温度为8-icrc。保存2年和3年后，把幼苗转移到恢复条件中温度20-25"C，光照由日光灯产生，光照强度为1000Lx，每日光照16小时。在恢复条件下培养一个月后，幼苗都恢复正常生长，3个月后，其生物学性状与直接光照培养获得的幼苗相同。实施例5:在云南西双版纳采集长苏石斛果实，表面消毒后，得到无菌的种子。种子播种到常规兰科种子无菌萌发培养基上，培养基组成为大量元素减半的MS培养基，添加3.0%蔗糖，0.01%肌醇，0.85%琼脂粉，pH5.7。培养基组成为大量元素减半的MS培养基，添加3.0%蔗糖，0.01%肌醇，0.85%琼脂粉，pH5.7。培养条件为温度25士2。C，光照强度为1000Lx，每日光照为12小时，培养2个月后种子萌发形成原球茎。把上述种质材料保存在种质保存条件中蓝光光照，温度10-15。C。保存2年和3年后把种质材料转移到恢复生长的条件下温度20-25'C，光照为自然光，光照强度为2100-3000Lx，每日光照8-10小时，经3个月诱导，种质材料恢复生长形成正常植株。实施例6:在云南西双版纳采集鼓槌石斛的果实，表面消毒后，得到无菌的种子。种子播种到常规兰科种子无菌萌发培养基上，培养基组成为大量元素减半的MS培养基，添加3.0%蔗糖，0.01%肌醇，0.85%琼脂粉，pH5.7。培养条件为温度25士2'C，光照强度为1000Lx，每日光照为12小时，培养2个月后种子萌发形成原球茎。把上述种质材料保存在种质保存条件中红光光照，温度为15-20°C。保存2年和3年后把种质材料转移到恢复生长的条件下温度20-25i:，光照由日光灯产生，光照强度为2500Lx，每日光照16小时。经过4个月的恢复生长，种质材料恢复生长形成正常植株。比较例种子播种到常规兰科种子无菌萌发培养基上，培养基为N6培养基，添加5%蔗糖，0.9%琼脂粉，pH5.8。在温度为25士2。C，每日光照10小时，光照强度为1000Lx的环境中诱导种子萌发，4个月后种子萌发形成无菌幼苗。把无菌幼苗保存在四种条件下(1)黄光培养；(2)无光培养；(3)蓝光培养；(4)光照培养，光照由日光灯产生，每日光照12小时，光照强度1500Lx,四种处理的培养温度均为25士2'C。每种处理设置4个重复，在保存6个月时，测定各处理的生物学性状，结果见表1。每处理每重复调查20株幼苗取平均数，使用方差分析检验各平均数的显著性。统计结果表明，(1)(2)(3)号处理组的幼苗生长缓慢，各项生物性状指标的数值，如株高、茎粗、鲜重、干重无显著差异，但以上各处理组与(4)号处理组相比，各项指标都有极显著差异。说明在种质保存环境条件下，幼苗具有较慢的生长速度。表l光照和培养基对幼苗生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注数据为4个重复的平均数，数字右上方的"表示某性状在同一培养基不同环境条件下存在极显著差异。权利要求1、一种石斛属植物种质资源的保存和保存后的恢复方法，内容包括(1)石斛属植物的种质材料，种质材料的保存条件为温度1-30℃，光照红光或黄光或绿光或蓝光或无光；(2)保存后的种质的恢复条件为温度8-30℃，自然光或日光灯，每日光照1-24小时，光照强度500-6000Lx。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于石斛属植物的种质材料为种子或原球茎或幼苗。3、根据权力要求1所述的方法，该方法可应用于石斛属植物种质资源的研究及规模化生产。全文摘要本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及了一种石斛属植物种质资源的保存和保存后的恢复方法，内容包括种子或原球茎或幼苗的长期保存和恢复生长。应用该项技术保存种质时间长、种质质量稳定，且种质保存工艺简便，技术稳定可靠，可重复性强，适合大规模石斛属植物种质资源的保存。文档编号A01H4/00GK101564028SQ20081009395公开日2009年10月28日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者侯晓强,房慧勇,燕李,王春兰,郭顺星,陈晓梅申请人:中国医学科学院药用植物研究所