专利名称：黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，属于植物组织培养领域。
技术背景黑籽南瓜是一种一年生蔓生植物，主要分布在高海拔地区，与同属的其他种相比差异较 大，且与他们不能杂交产生后代。起源中心目前尚未统一，大部分人认为是美洲。目前主要 分布于墨西哥、智利、德国、法国、日本、菲律宾和中国(Andr6s 1990: Meng and Zeng 2000)。 黑籽南瓜用途广泛，未成熟的果实可以煮熟吃或者作为蔬菜罐头，成熟的新鲜果实可以制作 酒精饮料；黑籽南瓜最重要的营养价值是它的种子中含有大量的蛋白质和精油(Andr6s， 1990);黑籽南瓜还具有降血压和减缓糖尿病的功效(Alarcon-Aguilar et al. 2002; Roraan-Ramos et al. 1995: Roman-Raraos et al. 1992);最近智利的研究表明，黑籽南瓜 新鲜果实的提取酶类可以有效地处理来自于鱼类加工企业排出的废水。黑籽南瓜根系强大、耐贫瘠、耐寒、耐旱、抗枯萎黄萎病，常作为许多瓜类嫁接的砧木 [European and Mediterranean Plant Protection Organization (0EPP/EPP0) 2004]。但是， 黑籽南瓜还有许多不良的性状，例如对根腐病敏感和不抗根结线虫病等，因此需要对其进行遗传改良研究。目前关于黑籽南瓜再生体系的研究与其他瓜类作物(Colijn-Hooymans'a， 1988; Trulson and Shahin， 1986; Kathal, 1988: Moreno, 1985; NJedz, 1989)相比而言，报道较少，己 存在的再生体系是茎尖扩繁(Liu, 2004)和子叶结再生体系(Xu， 2007),但存在再生频率低、 培养周期长等缺点。胚芽作外植体，其优越性在于再生频率高、培养周期短、受外界环境和生理状态影响小、 结果较易重复等。 发明内容针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种再生频率高、培养周期短的黑籽南瓜胚芽 离体培养不定芽诱导植株再生的方法。 本发明是通过以下技术方案实现的黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，包括外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的 伸长、生根培养、移栽歩骤，其特征在于所述不定芽的诱导培养基为MS+3。/。重量的蔗糖+0.9Q/。 重量的琼脂+0. 5mg/L噻苯隆；所述不定芽的伸长培养基为MS+3M重量的蔗糖+0.9Q/。重量的琼脂+0.25mg/L激动素；所述生根培养基为1^+3%重量的蔗糖+0.9%重量的琼脂+0.1 mg/L吲哚 乙酸；所述各种培养基的pH均为5.8;所述外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的伸长、生根培养阶段的培养条件为培养温度25'c ± rc 。所述外植体是通过以下方法获得的将黑籽南瓜种子去壳后，70%乙醇(体积份数)表 面消毒30秒，无菌水清洗一次，0.1% (w/v)的氯化汞消毒5分钟，然后用无菌水清洗5次； 消毒的种子在黑暗中浸泡过夜后，接种到1/2MS培养基上催芽，光周期为8h黑暗/ 16h光照； 3天后分开两片子叶，挑取两片子叶基部的凸出部位，获得胚芽，即为外植体，必要时可在 解剖镜下剥离胚芽。所述移栽的歩骤为生根培养30天后，选生根良好的植株小苗，在培养瓶中注入l/3体 积的水，敞开培养瓶盖在培养架上放置2天后，用水轻轻的洗去琼脂(原培养基中的琼脂)，移栽到带有灭菌土的沙土体积比为h l的塑料钵中，用塑料袋罩上移栽苗用于保湿，每隔3天浇一次MS液体培养基，2星期后去掉塑料袋，在土培养环境中适应2周。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1、 本发明以黑籽南瓜胚芽作为外植体，取材方便，受外界环境和生理状态影响小，结果重复性好；2、 在MS+0.5mg/L TDZ的诱导培养基上，诱导培养再生频率高，达100%;每个外植体 产生的不定芽数量多，成簇发生；3、 切除伸长芽后可继续大量生成新的不定芽，不定芽的发生具有一定的持续性。 本发明克服了目前在黑籽南瓜植株再生培养中的再生频率低、培养周期长等缺点，建立了高频不定芽再生体系的技术，为黑籽南瓜的无性繁殖和农杆菌介导的黑籽南瓜遗传转化提供了有效的实用技术，具有一定的意义。
图1为剥离后的胚芽与胚芽周围的幼嫩组织示意图； 图2为不定芽的诱导示意图； 图3不定芽的萌发示意图； 图4为不定芽的伸长示意图； 图5为生根后的植株示意图； 图6为移栽后的再生植株示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明实施例h黑籽南瓜胚芽离体培养不定芽诱导植株再生 1.材料与方法1.1植物材料云南产黑籽南瓜。1.2植物激素与培养基本实验所用植物激素均购自sigma公司，分别为噻苯隆(TDZ)、激 动素(KT)、吲哚乙酸(IAA)。基本培养基为MS培养基(Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 1962， 15:473-497)，在培养过程中，根据不同的发育吋期在培养基中添加了不同的激素，其中，不 定芽的诱导培养基为MS+3。/。重量的蔗糖+0.9n/。重量的琼脂+0. 5mg/L噻苯隆；不定芽的伸长培 养基为MS+3。/。重量的蔗糖+0.9。/。重量的琼脂+0.25mg/L激动素；生根培养基为MS+3。/。重量的 蔗糖+0.9%重量的琼脂+0.1 mg/L吲哚乙酸；各培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH 值至5.8。 1.3方法1.3.1外植体的获得黑籽南瓜种子去壳后，70%乙醇表面消毒30秒钟，无菌水清洗一次，0.1%的氯化汞消毒5分钟，然后用无菌水清洗5次，消毒的种于在黑暗中浸泡过夜后，接种到1/2MS培养基上催芽，光周期为8h黑暗/ 16h光照。3天后用镊子和刀片分开两片子叶，解剖针挑取两片子叶基部的凸出部位，获得胚芽(可在解剖镜下进行)。1.3.2不定芽的诱导将剥离的胚芽外植体转接到不定芽的诱导培养基上，如图1所示，30天后统计不定芽的发生情况。1.3.3不定芽的伸长以及生根在不定芽的诱导培养基上诱导培养30天后，将带有从生芽原 基的外植体转接到不定芽的伸长培养基上，用于芽的伸长。随后伸长的不定芽，被切割下来 转到生根培养基上进行生根培养。培养温度均为25±1°C。1.3.4移栽生根培养30天后，选生根良好的植株小苗，在培养瓶中注入1/3体积的水，敞 开培养瓶盖在培养架上放置2天后，用自来水轻轻的洗去琼脂，将生根良好的的植株小苗移栽到带有灭菌土的沙土的体积比为l: l的塑料钵中，用塑料袋罩上移栽苗用于保湿，每隔3天浇一次MS液体培养基，2星期后去掉塑料袋，在土培养环境中适应2周。 2结果与分析2.1不定芽再生的诱导胚芽外植体在不定芽的诱导培养基上，诱导率为100%，即每个外植 体均可有效的产生大量的不定芽，通常成簇发生，如图2、图3所示。2.2芽的伸长在不定芽的诱导培养基上仅有少数的不定芽可以伸长，大部分不定芽通常变 粗、玻璃化、黄化，在形态上表现为不JH常的芽，且在芽的周围产生一些愈伤组织。当诱导的不定芽转接到不定芽的伸长培养基上时，三周后诱导的不定芽可以伸长为正常的芽，如图 4所示。芽切除转接后，剩下的外植体能够继续产生大量的不定芽，这些不定芽转接的芽伸 长培养基上时也能够继续伸长，发育成正常的芽。这一现象对于黑籽南瓜的扩繁是极为有利 的。2.3不定芽的生根和移栽伸长2cm的不定芽转接到生根的培养基上，7天后出现根的凸起。 培养20天根的发生率为100%，每个小苗生根4 5个，如图5所示。在研究中我们发现黑籽 南瓜的芽极易生根，这可能与黑籽南瓜本身的基因型有关。4周后生根良好的小苗按照材料 与方法的描述，进行驯化培养，移栽成活率达到85.0%，如图6所示。3结论本发明以催芽3天的黑籽南瓜胚芽作为外植体材料，在不定芽的诱导培养基上，进 行诱导培养，诱导30天后，不定芽的诱导率为100%，且不定芽成簇发生；转到不定芽的伸 长培养基上进行芽的伸长培养，大部分诱导芽可正常伸长，30后将伸长2cm的不定芽切下， 转接到生根培养基上，生根率为100%，平均每个小苗生根4-5个，生根培养30天后，进行 驯化移栽，成活率为85.0%。
权利要求
1.黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，包括外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的伸长、生根培养、移栽步骤，其特征在于所述不定芽的诱导培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.5mg/L噻苯隆；所述不定芽的伸长培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.25mg/L激动素；所述生根培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.1mg/L吲哚乙酸；所述各种培养基的pH均为5.8；所述外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的伸长、生根培养阶段的培养条件为培养温度25℃±1℃。
2. 根据权利要求1所述的黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，其特征在于所述外植体 是通过以下方法获得的将黑籽南瓜种子去壳后，70°/。乙醇表面消毒30秒，无菌水清洗 一次，0.1%的氯化汞消毒5分钟，然后用无菌水清洗5次；消毒的种子在黑暗中浸泡过夜 后，接种到1/2MS培养基上催芽，光周期为8h黑暗/16h光照；3天后分开两片子叶，挑 取两片子叶基部的凸出部位，获得胚芽，即为外植体。
3. 根据权利要求1所述的黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，其特征在于所述移栽的 步骤为生根培养30天后，选生根良好的植株小苗，在培养瓶中注入1/3体积的水，敞 开培养瓶盖在培养架上放置2天后，用水轻轻的洗去琼脂，移栽到带有灭菌土的沙土体 积比为l: l的塑料钵中，用塑料袋罩上移栽苗用于保湿，每隔3天浇一次MS液体培养基，2星期后去掉塑料袋，在土培养环境中适应2周。
全文摘要
本发明公开了一种黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法包括外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的伸长、生根培养、移栽步骤，其中，不定芽的诱导培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.5mg/L噻苯隆；不定芽的伸长培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.25mg/L激动素；生根培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.1mg/L吲哚乙酸。本发明克服了目前在黑籽南瓜植株再生培养中的再生频率低、培养周期长等缺点，建立了高频不定芽再生体系的技术，为黑籽南瓜的无性繁殖和农杆菌介导的黑籽南瓜遗传转化提供了有效的实用技术，具有一定的意义。
文档编号A01H4/00GK101322475SQ20081013849
公开日2008年12月17日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者何启伟, 霍雨猛 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所