专利名称：一种带根增殖的植物组织培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及一种带根增殖的植物组织培养外植体增殖的新方法。
背景技术：
随着我国改革开放的深入发展，党和政府对科学研究进一步重视，我国在森林植物、经济林木、观赏植物等方面不断有新的良种以及珍稀植物的品系出现。要把这些植物良种及珍稀品系迅速扩大繁殖，满足生产需要，组织培养作为植物良种无性快繁的重要手段之一，近年来我国从国家到地方以及许多公司建立了组培繁育基地，不少植物良种和珍稀品系在这里得到迅速繁育。所以对组织培养方法不断进行研究和改进是十分必要的，进一步满足生产实际的需要。
常规的组织培养过程是在无菌条件下，经过灭菌处理的外植体在芽诱导培养基上进行芽诱导培养，然后再转接于增殖培养基上，进行增殖培养，当增殖数量达到生产要求后，再转接于壮苗培养基上进行壮苗培养，最后把经壮苗培养的外植体上切割下的无根苗在生根培养基上进行生根培养。在常规的组织培养过程中，增殖培养是在增殖培养基上外植体未产生根的情况下，经过多次继代进行增殖，因此，培养过程外植体吸收营养是靠细胞壁的渗透作用，营养吸收效果是非常有限的。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种带根增殖的植物组织培养方法，该方法可以有效地提高组织培养增殖系数和芽苗生长高度，以及无根苗生根率。这对提高组织培养效益、降低组织培养成本具有重要作用。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案 一种带根增殖的植物组织培养方法，其特征在于，具体包括下列步骤 1)选择组培植物外植体进行灭菌处理； 2)经灭菌处理的植物外植体，接种于诱导培养基上诱导萌发； 3)诱导萌发至一定时间后，转接于增殖培养基上增殖培养，当增殖培养基上的芽子数量增加到规定数量，再转接到壮苗培养基上培养，壮苗培养的芽苗长到规定高度，即形成芽丛状外植体； 4)将芽丛状外植体转接于生根培养基上进行生根培养，当芽丛状外植体生出根后，再转接于增殖培养基上进行带根增殖培养； 5)经带根增殖培养后，当芽子增殖到一定数量，且芽苗高度达到一定要求时，从芽丛体外植体上进行无根苗切割； 6)切割下的无根苗按照常规的生根培养方法进行生根培养，生出根后形成一个完整植株，即可练苗移栽； 7)经无根苗切割后的带根并有少量芽子的剩余部分，在增殖培养基上继续带根增殖培养，待增殖达到规定程度后，再次进行无根苗切割，带根部分继续进行培养增殖，依次反复。
本发明的原理是，经过芽诱导培养的外植体，在增殖及壮苗培养基上培养一定时间，当外植体上增殖的芽子达到规定数量且芽子高度在2厘米以上时，把芽丛状的外植体转接在生根培养基上培养，当外植体长出根后，把带根的外植体又转接到增殖培养基中进行带根增殖。根对培养基中营养成分吸收属于主动吸收，并且根在培养基中长度不断增加，侧根不断大量形成，根系分布在培养基的各个部分。所以带根外植体对营养物质及其他成分的吸收远远优于不带根的外植体。而且增殖和壮苗两个过程很容易合为一个过程。其增殖系数和无菌苗株高都大于常规增殖方法。
带根芽丛状外植体在增殖培养基中培养一定时间后，当增殖的芽苗高度达到要求时，可以从原芽丛状外植体上切割下无根苗进行生根培养，生出根后形成一个完整植株，即可练苗移栽；然后将剩下的带根部分外植体仍旧培养在增殖培养基中，进行新一轮的增殖培养，通过转接此带根部分的外植体，可以不断地进行良好的外植体增殖，可继续切割无根苗进行生根培养。
本发明方法中，从经增殖培养的带根芽丛状外植体上切割的无根苗进行生根培养，它的生根率和根长大于常规培养的无根苗。
具体实施例方式 以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
申请人:以长俊木瓜、四倍体刺槐、树莓等为例，说明本发明的带根增殖的植物组织培养新方法和常规增殖方法相比带来的技术效果。
实施例1长俊木瓜的组织培养 长俊木瓜(Chaeomeles speciosa(sweet)Nakai C.Lagenearia(changjun)为蔷薇科(Rosaceae)，木瓜属(Chaenomeles lindi)植物。
1)材料来源及灭菌采自陕西杨凌银磊公司苗圃一株3年生长俊木瓜植株的萌生枝条。
将刚采来的萌生枝条，剪掉叶片，萌生枝条用自来水充分冲洗后，再用洗洁精水冲洗三遍，然后把萌生枝条剪成10厘米左右的茎段。
在超净工作台上，将茎段浸入75％的乙醇中30s，取出后浸入0.1％的HgCl2溶液中6min，处理后用无菌水冲洗三遍，再将茎段剪成多个小段，每小段带一芽。
2)经过灭菌处理的小段接种在芽诱导培养基上诱导萌发，芽诱导培养基的配方为MS+6-BA(0.5mg/L)+IBA(0.05mg/L)+GA3(0.5mg/L)。
3)诱导萌发30d后，再转接到增殖培养基上增殖培养，增殖培养基的配方为MS+6-BA(0.5mg/L)+IBA(0.01mg/L)+GA3(0.01mg/L)。芽子增殖到5-6个以上，再转接到壮苗培养基上培养，壮苗培养基的配方为MS+IBA(0.1mg/L)+GA3(0.5mg/L)+0.1％活性炭，经壮苗培养的芽苗长到一定高度，成为芽丛状外植体。
4)把培养的若干数量芽丛状外植体的一部分转接于生根培养基上生根培养，生根培养基的配方为1/2MS+NAA(3.0mg/L)+IBA(1.0mg/L)；另一部分经过切割，继续在增殖培养基上进行增殖继代培养作为对照。
5)在进行带根增殖方法和常规增殖方法对比试验的无菌苗中，各选出大小相似的苗若干，记录其株高和芽数，然后放入增殖培养基中，进行增殖培养。做3个重复，每个重复20瓶。芽苗高度和芽苗数目统计的方法是，每瓶株高以大于1cm芽的高度计算平均值，芽苗数目只统计高于0.5cm的芽。增殖系数为增殖后每瓶平均芽数与增殖前每瓶平均芽数之比。一个月后观察两组无菌苗的增值系数和株高情况。增值系数结果如表1所示 表1不同增殖方法对无菌苗芽增殖系数的影响
对试验结果的增值系数进行统计假设检验T＝9.2018，而t0.01(4)＝4.604，处理间差异极显著。由表1可以看出通过带根增殖方法，平均增殖系数3.5，而普通方法增殖系数仅为2.0，说明用带根增殖方法对芽的增殖作用非常明显。株高情况结果如表2。
表2不同增殖方法对无菌苗株高的影响
对每组无菌苗的株高进行方差分析，结果见表3 表3不同增殖方法对无菌苗株高的方差分析 对试验结果利用DPS6.55统计分析软件进行方差分析(F＝24.3000，p＜0.0079)，处理间差异极显著。由可以看出，带根增殖后的无菌苗总的平均增高为2.2cm，。而普通方法增殖后的无菌苗总的平均增高仅为1.3cm，所以带根增殖方法效果明显好于常规的增殖方法。
6)从带根增殖和不带根增殖的芽丛体上切割下株高4厘米以上的单芽和双芽无根苗，培养在生根培养基上进行生根培养。每处理3个重复，每重复20瓶。实验结果如表4 表4带根增殖方法与不带根增殖方法无根苗生根率的比较表
带根增殖方法与不带根增殖方法无根苗生根率的实验结果数据，经统计分析检验，1芽苗U＝1.7593，α＝0.05的单侧分位数U0.05＝1.645，因为U＞U0.05，所以带根增方法的生根率显著的大于常规增方法的生根率；2芽苗U＝5.3049，α＝0.01的单侧分位数U0.01＝1.96因为U＞U0.01，所以带根增方法的生根率极显著的大于常规增方法的生根率。说明带根增殖与不带根增殖的外植体上切割下的无根苗生根，前者都是显著的大于后者。说明带根增殖方法的无根苗的生根效果明显地好于不带根增殖方法无根苗。
7)带根增殖的芽丛状外植体，经切割无根苗后的剩余带根部分无菌苗有单芽、双芽、三芽和丛生状的不同苗态，把这些不同苗态的无菌苗转接到增殖培养基上继续培养，一个月后，观察其生长及增殖情况发现，各种苗态的无菌苗均生长良好，增殖及生长能力较强。
以上各培养过程培养条件均为培养基蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为6g/L，PH调到5.6-5.8。培养温度为25℃左右，光照强度为1200-2500lx，每日光照16h，相对湿度为60-80％。
实施例2四倍体刺槐K2的组织培养 四倍体刺槐K2(Gigas type locust(2))为蝶形花科(Papilionaceae)刺槐属(Robinia pseudoacacia L)植物 1)材料来源及消毒采自引自北京林业大学四倍体刺槐K2一年生嫁接苗的枝条。
将刚采来的枝条，剪掉叶片，枝条用自来水充分冲洗后，再用洗洁精水冲洗三遍，然后把枝条剪成10厘米左右的茎段。
在超净工作台上，将茎段浸入75％的乙醇中30-60s，取出后浸入0.1％的HgCl2溶液中6min，处理后用无菌水冲洗三遍，再将茎段剪成多个小段，每小段带一芽。
2)经过灭菌处理的小段接种在芽诱导培养基上诱导萌发，芽诱导培养基的配方为MS+6-BA(1.0mg/L)+GA3(0.5mg/L)。
3)诱导萌发30d后，再转接到增殖及壮苗培养基上进行增殖及壮苗培养，增殖及壮苗培养基的配方为MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L+IBA(0.5mg/L)(该培养基既有增殖作用又有壮苗作用)。芽子增殖到5-6个以上，芽苗长到一定高度，成为芽丛状外植体。
4)把培养的若干数量芽丛状外植体的一部分转接于生根培养基上生根培养，生根培养基的配方为1/2MS+6-BA(0.5mg/L)+IBA(0.5mg/L)+IAA(0.5mg/L)；另一部分经过切割，继续在增殖壮苗培养基上进行增殖继代培养作为对照。
5)在进行带根增殖方法和常规增殖方法对比试验的无菌苗中，各选出大小相似的苗若干，记录其株高和芽数，然后放入增殖壮苗培养基中，进行培养。做3个重复，每个重复20瓶。芽苗高度和芽苗数目统计的方法是，每瓶株高以大于1cm芽的高度计算平均值，芽苗数目只统计高于0.5cm的芽。增殖系数为增殖后每瓶平均芽数与增殖前每瓶平均芽数之比。一个月后观察两组无菌苗的增值系数和株高情况。增值系数结果如表5所示 表5不同增殖方法对无菌苗芽增殖系数的影响
对试验结果的增值系数进行统计假设检验T＝7.5969，而t0.01(4)＝4.604，差异极显著。说明带根增殖的增殖系数极显著的好于常规增殖，用带根增殖方法对芽的增殖作用非常明显。
株高情况结果如表6。
表6不同增殖方法对无菌苗株高的影响
对试验结果的无菌苗的增高效果数据进行统计假设检验T＝5.1180，而t0.01(4)＝4.604，差异极显著。说明带根增殖的无菌苗增高效果极显著的好于常规增殖，带根增殖后的无菌苗总的平均增高为2.1cm，。而普通方法增殖后的无菌苗总的平均增高仅为1.3cm，所以带根增殖方法效果明显好于常规的增殖方法。
6)从带根增殖和不带根增殖的芽丛体上切割下株高3厘米以上的单芽无根苗，培养在生根培养基上进行生根培养。每处理3个重复，每重复20瓶。实验结果如表7 表7带根增殖方法与不带根增殖方法无根苗生根率的比较表
带根增殖方法与不带根增殖方法无根苗生根率的实验结果数据，经统计分析检验，U＝3.2826，U0.01＝2.576.带根增殖与不带根增殖的外植体上切割下的无根苗生根率之间差异极显著的，说明带根增殖方法的无根苗的生根效果明显地好于不带根增殖方法无根苗。
7)带根增殖的芽丛状外植体，经切割无根苗后的剩余带根部分无菌苗有单芽、双芽、三芽和丛生状的不同苗态，把这些不同苗态的无菌苗转接到增殖培养基上继续培养，一个月后，观察其生长及增殖情况发现，各种苗态的无菌苗均生长良好，增殖及生长能力较强。
以上各培养过程培养条件均为培养基蔗糖浓度为30g/L(生根培养基为20g/L)，琼脂浓度为6g/L，PH调到5.6-5.8。培养温度为25℃左右，光照强度为1200-2500lx，每日光照16h，相对湿度为60-80％。
实施例3树莓的组织培养 树莓(Rubus idaeus)是蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)树莓亚属(Ideobatus)植物。
1)材料来源及消毒采自引自中国林科院品种为图拉美1年生苗木的枝条。
将刚采来的枝条，剪掉叶片，枝条用自来水充分冲洗后，再用洗洁精冲洗三遍，然后把枝条剪成5厘米左右的茎段。
在超净工作台上，将茎段浸入75％的乙醇中30s，取出后浸入0.1％的HgCl2溶液中5min，处理后用无菌水冲洗三遍，再将茎段剪成多个小段，每小段带一芽。
2)经过灭菌处理的小段接种在芽诱导培养基上诱导萌发，芽诱导培养基的配方为MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA3(0.5mg/L)。
3)诱导萌发30d后，再转接到增殖培养基上进行增殖培养，增殖培养基的配方为MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L).芽子增殖到5-6个以上，再转接到壮苗培养基上培养，壮苗培养基的配方为MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA3(3.0mg/L)，经壮苗培养的芽苗长到一定高度，成为芽丛状外植体。
4)把培养的若干数量芽丛状外植体的一部分转接于生根培养基上生根培养，生根培养基的配方为1/2MS+IBA(0.1mg/L)；另一部分经过切割，继续在增殖培养基上进行增殖继代培养作为对照。
5)在进行带根增殖方法和常规增殖方法对比试验的无菌苗中，各选出大小相似的苗若干，记录其株高和芽数，然后放入增殖培养基中，进行培养。做3个重复，每个重复20瓶。芽苗高度和芽苗数目统计的方法是，每瓶株高以大于1cm芽的高度计算平均值，芽苗数目只统计高于0.5cm的芽。增殖系数为增殖后每瓶平均芽数与增殖前每瓶平均芽数之比。一个月后观察两组无菌苗的增值系数和株高情况。增值系数结果如表8所示 表8不同增殖方法对无菌苗芽增殖系数的影响
对试验结果的增值系数进行统计假设检验T＝10.4103，而t0.01(4)＝4.604，差异极显著。说明带根增殖的增殖系数极显著的好于常规增殖，用带根增殖方法对芽的增殖作用非常明显。
株高情况结果如表9。
表9不同增殖方法对无菌苗株高的影响
对试验结果的无菌苗的增高效果数据进行统计假设检验T＝8.5732，而t0.01(4)＝4.604，差异极显著。说明带根增殖的无菌苗增高效果极显著的好于常规增殖，带根增殖后的无菌苗总的平均增高为2.0cm，。而普通方法增殖后的无菌苗总的平均增高仅为1.3cm，所以带根增殖方法效果明显好于常规的增殖方法。
6)从带根增殖和不带根增殖的芽丛体上切割下株高2厘米以上的单芽无根苗，培养在生根培养基上进行生根培养。每处理3个重复，每重复20瓶。实验结果如表10 表10带根增殖方法与不带根增殖方法无根苗生根率的比较表
带根增殖方法与不带根增殖方法无根苗生根率的实验结果数据，经统计分析检验，U＝2.6968，U0.01＝2.576.带根增殖与不带根增殖的外植体上切割下的无根苗生根率之间差异极显著的，说明带根增殖方法的无根苗的生根效果明显地好于不带根增殖方法无根苗。
7)带根增殖的芽丛状外植体，经切割无根苗后的剩余带根部分无菌苗有单芽、双芽、三芽和丛生状的不同苗态，把这些不同苗态的无菌苗转接到增殖培养基上继续培养，一个月后，观察其生长及增殖情况发现，各种苗态的无菌苗均生长良好，增殖及生长能力较强。
以上各培养过程培养条件均为培养基蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为6g/L，PH调到5.6-5.8。培养温度为25℃左右，光照强度为1200-2500lx，每日光照16h，相对湿度为60-80％。
需要说明的是，本发明是申请人长期实验探索的结果，不限于上述实施例，可以扩展到植物良种无性快繁的其它植物的组织培养上。按照本发明的方法，在增殖培养和壮苗培养一定时间后就进行生根培养，然后进行带根增殖。这样的带根增殖，由于根主动进行吸收营养，因而增殖和壮苗过程营养吸收要远远优于常规植物组织培养方法。从技术、经济角度来讲其效果均非常明显。
权利要求
1.一种带根增殖的植物组织培养方法，其特征在于，具体包括下列步骤
1)选择组培植物外植体进行灭菌处理；
2)经灭菌处理的植物外植体，接种于诱导培养基上诱导萌发；
3)诱导萌发至一定时间后，转接于增殖培养基上增殖培养，当增殖培养基上的芽子数量增加到一定数量，芽苗高度达到所要求的高度，再转接到壮苗培养基上培养，壮苗培养的芽苗长到规定高度，即形成芽丛状外植体；
4)将芽丛状外植体转接于生根培养基上进行生根培养，当芽丛状外植体生出根后，再转接于增殖培养基上进行带根增殖培养；
5)经带根增殖培养后，当芽子增殖到一定数量，且芽苗高度达到一定要求时，从芽丛体外植体上进行无根苗切割；
6)切割下的无根苗按照常规的生根培养方法进行生根培养，生出根后形成一个完整植株，即可练苗移栽；
7)经无根苗切割后的带根并有少量芽子的剩余部分在增殖培养基上继续带根增殖培养，待增殖达到规定程度后，再次进行无根苗切割，带根部分继续进行培养增殖，依次反复。
2.如权利要求1所述的带根进行植物组织培养的方法，其特征在于，所述的灭菌处理是将植物外植体浸入75％的乙醇中30s，取出后浸入0.1％的HgCl2溶液中6min，处理后用无菌水冲洗三遍即可。
全文摘要
本发明公开了一种带根增殖的植物组织培养方法，该方法不同于常规的组织培养方法，常规的组织培养方法是把经过灭菌处理的外植体按启动培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的程序进行，缺点是增殖缓慢，生根率较低，而且根长较小。而本发明是把经过启动培养的外植体，在增殖培养和壮苗培养一定时间后就进行生根培养，然后进行带根增殖。这样的带根增殖，由于根主动可以进行吸收营养，因而增殖和壮苗过程营养吸收要远远优于常规植物组织培养方法。本发明所提供的新方法从技术、经济角度来讲其效果均非常明显。
文档编号A01H4/00GK101347100SQ20081015081
公开日2009年1月21日 申请日期2008年9月5日 优先权日2008年9月5日
发明者董丽芬, 朱海兰, 郭有燕, 钰 程, 邵群, 邵崇斌 申请人:西北农林科技大学