专利名称：一种应用于仔猪养殖中取代药物添加剂的复合微生物菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、畜牧业、生物技术等领域，具体涉及一种 应用于仔猪养殖中取代药物添加剂的复合微生物菌剂。
背景技术：
在动物的胃肠道中，存在相对稳定殖居的微生物群落，而且数量
相当大，约为10"个微生物，分别来自400个不同的细菌类型。其中有 一些微生物对维持胃肠道环境的相对稳定和促进营养物质在肠道的 消化与吸收起着相当重要的作用。Fuller研究发现，肠道内相对稳定
的微生物群落的形成，有助于动物提高抵抗力，免受外来有害细菌的 感染，特别是对正常健康动物的胃肠道的感染，无菌动物比具有完整 胃肠道微生物群落的动物更易感染疾病。由于微生物群落在动物胃肠 道内的特殊功效，动物微生态学的概念和理论被提出并完善。在动物 养殖业中，利用动物微生态学理论，依据动物胃肠道微生态系统的客 观规律，因势利导，改善胃肠道的微生态环境，建立生物量更高的微 生态平衡，从而起到促生长，防疾病的功效。其成功应用表现在微生 态制剂(Prabiotics)在畜禽饲料中使用，具有极其良好的饲养效果。微 生态制剂的作用机理l.对病原菌的拮抗作用，益生菌通过占据肠黏
膜上的黏附位点阻止病原菌的附着，并在肠道内和病原菌竞争营养 素，产生有机酸、&02及其它抗菌物质等，抑制病原菌的生长繁殖， 从而达到抗菌治病的作用；2.提供营养素，促进消化吸收，提高饲料 转化率；3.刺激机体的免疫功能，增强机体免疫力；4.净化肠道内环 境，动物自身及许多致病菌都会产生各种有毒物质，有些有益生菌可 以阻止毒性胺和氨的合成，中和细菌毒素。乳酸菌能够产生有机胺和 抗菌物质，降低肠道内pH值和氧化还原电位，有利于宿主生长发育和 维持健康；5.减轻机体的应激反应，维持肠道微生态平衡
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于仔猪养殖中取代药物添加剂 的复合微生物菌剂，利用该微生物菌剂取代药物添加剂，提高动物抵 抗力，免受外来有害细菌的感染，促生长，防疾病。
本发明的技术解决方案是该复合微生物菌剂依以下步骤制备
1. 从健康猪的小肠中分离、纯化菌种；无菌操作取得刚宰杀健康 猪小肠一段约4cm，用无菌刀片将肠黏膜刮下，倒入无菌水稀释10 倍，搅拌2min，静置10min，取上层清液1 mL，接种到50mL预增 菌培养液中，3(TC恒温培养24h;其中，预增菌培养液为装满带玻璃 塞瓶中的鲜牛奶；
2. 取预增菌液0.1mL，涂布到9cm直径MRS培养基上，然后在 培养皿中再倒一层MRS培养基，在厌氧条件下3(TC培养36h;其中 MRS培养基牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g， 乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温-80 lmL， 硫酸
镁0.58g，硫酸锰0.25g，调pH至6.2 6.4，蒸溜水定容lOOOmL， 121。C灭菌15min;
3. 对上述稀释涂布厌氧培养所得单菌落进行选择，其中链球菌、 乳杆菌为目的菌种；
4. 在MRS培养基上以质量5%接种目的菌种，温度37-C发酵8
小时；
5. 第四步的链球菌、乳杆菌与实验室保存的益生菌Xg02混合，
得到混合菌液，三种菌质量比为杆菌球菌Xg02=l:l:3;
6. 混合菌液依质量5%加入液体种子培养基中得液体种子，其中， 液体种子培养基中各组份百分比为蛋白胨0.85%，牛肉膏2.0%， 葡萄糖2.0%，酵母浸出物0.7%，肝浸液5%(v/v);其中肝浸液的制 备200g猪肝脏加500g水，煮沸，纱布过滤，取滤液；
7. 液体种子按质量12%添加到固体发酵培养基中，37'C发酵20 小时，发酵结束低于65t:干燥粉碎得固态粉剂微生物菌剂；其中， 固体发酵培养基为米糠47.0%，麸皮42.5%，葡萄糖10.5%，起始 pH6.5，水份68%。
本发明具有以下优点①组成饲用微生物菌剂的益生菌不产生 任何内外毒素，即无毒、无害、安全、无副作用，有利于促进体内菌 群平衡，具有较好的黏附性能，以活菌体形式发挥作用的益生菌耐酸、 耐胆盐，益生菌株生长速度快、存活期长、易保存；②此微生物菌剂 含乳酸杆菌、链球菌等，活菌数大于10 9个/g，在仔猪养殖中添加量 少，增强抵抗力，饲养成本低。
图l为仔猪生长曲线图。
具体实施例方式
该复合微生物菌剂依以下具体步骤制备
1. 从健康猪的小肠中分离、纯化菌种；无菌操作取得刚宰杀健康 猪小肠一段约4cm，用无菌刀片将肠黏膜刮下，倒入无菌水稀释10 倍，搅拌2min，静置10min，取上层清液1 mL，接种到50ml预增 菌培养液中，3(TC恒温培养24h;其中，预增菌培养液为装满带玻璃 塞瓶中的鲜牛奶；
2. 取预增菌液0.1mL，稀释涂布到9cm直径MRS培养基上，然 后在培养皿中再倒一层MRS培养基，在厌氧条件下3(TC培养36 h; 其中MRS培养基牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g， 乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温-80 lmL,硫酸 镁0.58g，硫酸锰0.25g，调pH至6.2 6.4,蒸溜水定容1000mL， 121。C灭菌15min;
3. 对上述稀释涂布厌氧培养所得单菌落进行选择，其中链球菌、
乳杆菌为目的菌种；
4. 在MRS培养基上以质量5%接种目的菌种，温度37'C发酵8
小时；
5. 第四步的链球菌、乳杆菌与实验室保存的益生菌Xg02混合，
得到混合菌液，三种菌质量比为杆菌球菌Xg02=l:l:3;
6. 混合菌液依质量5%加入液体种子培养基中得液体种子，其中，
液体种子培养基中各组份百分比为蛋白胨0.85%，牛肉膏2.0%， 葡萄糖2.0%，酵母浸出物0.7%，肝浸液5%(v/v);其中肝浸液的制 备200g猪肝脏加500g水，煮沸，纱布过滤，取滤液； 7.液体种子按质量12%添加到固体发酵培养基中，37"C发酵20小 时，发酵结束低于65'C干燥粉碎得固态粉剂微生物菌剂；其中，固 体发酵培养基为米糠47.0%，麸皮42.5%，葡萄糖10.5%，起始 pH6.5,水份68%。
实验仔猪的选择品种相同的痩肉型健康断奶仔猪25头，体重 8公斤左右，性别比例相当，试验在断奶后一周进行，在试验准备 期内对所有试验猪进行常规的免疫和驱虫。
实验仔猪的分组将所有试验猪进行编号，随机分成五组，每 组5头，五组的编号为l、 2、 3、 4、 5，第l组为对照组，2、 3、 4、 5组为试验组。
微生物菌剂在日粮中的浓度配比将微生物菌剂按质量比(即微 生物菌剂与日粮的质量之比)按0.5%>， 1%。， 2%。， 4%。的比例分别 掺加到2， 3， 4， 5组仔猪的日粮中。
饲喂方法第1组仔猪供应添加常规量抗生素(黄霉素在仔猪曰 粮中的使用量为10mg/kg)的基础日粮，实验结束时做对照组；实验 组喂养添加了微生物菌剂的日粮；每日喂料两次，分别于上午7: 30—8: 00和下午5: 00—5: 30饲喂，所有实验猪均自由采食，并 随时供给洁净的饮水。
实验仔猪的相关信息收集如表1、 2、 3和图1所示，图1为仔猪体重
变化曲线，表1为仔猪的始末重量表，表2为五组仔猪增重重量因素 方差分析表，表3为饲料报酬对比表。
表1仔猪的始末重表
表1仔猪始末重量
组别头数实验天数平均始重 平均末重总增重平均日增重
(公斤)(公斤)(公斤)(克)
第l组5408. 3023. 2614. 96374.0
第2组5408. 3725. 7616. 39409.8
第3组5408. 2527. 0818. 83470.8
第4组5408. 6628. 3719. 71492.8
第5组5408.4328. 1519. 72493. 0
表2五组仔猪增重重量单因素方差分析表组别仔猪平均重量Xij和Ti平均平方和
1 8.3012. 3016. 0419. 64 23. 2379. 5415.911404
2 8.3712. 6716. 8520.82 25. 7684. 4716. 891612
3 8.2513. 1517. 9722. 68 27. 0889. 1317. 531812
4 8.6613. 7618. 8223.75 28. 3793. 3618. 671987
5 8.4313. 3818. 4923. 34 28. 1591. 7918. 361929
总和T. =438. 29总平均^..=17. 538744
仔猪的饲料报酬率对比情况表组别头数实验天数总耗料量总增重量料肉比比较
(公斤)(公斤)
第l组540173.5474. 802. 320100
第2组540180.6481.952. 20495
第3组540191. 7794. 152. 03787.8
第4组540194. 2598. 551.97185.0
第5组540194.4498. 601.97185.0
9组别头数实验天数平均始重 平均末重总增重平均日增重
(公斤)(公斤)(公斤)(克)
第l组5408. 3023. 2614. 96374.0
第2组5408. 3725. 7616. 39409.8
第3组5408. 2527. 0818. 83470.8
第4组5408. 6628. 3719. 71492.8
第5组5408.4328. 1519. 72493. 0
表2五组仔猪增重重量单因素方差分析表组别仔猪平均重量Xij和Ti平均平方和
1 8.3012. 3016. 0419. 64 23. 2379. 5415.911404
2 8.3712. 67 由表和图可知在仔猪日粮中按照不同比例添加微生物菌剂，对 仔猪的生长具有明显的促进作用，其中2%。添加量组与对照组相比， 平均日增重提高31.8%，料肉比降低了15%，腹泻率降低了91.4% 。
权利要求
1. 一种应用于仔猪养殖中取代药物添加剂的复合微生物菌剂，其特征在于该复合微生物菌剂依以下步骤制备(1)从健康猪的小肠中分离、纯化菌种；无菌操作取得刚宰杀健康猪小肠一段4cm，用无菌刀片将肠黏膜刮下，倒入无菌水稀释10倍，搅拌2min，静置10min，取上层清液1mL，接种到50ml预增菌培养液中，30℃恒温培养24h；其中，预增菌培养液为装满带玻璃塞瓶中的鲜牛奶；(2)取预增菌液0. 1mL，稀释涂布到9cm直径MRS培养基上，然后在培养皿中再倒一层MRS培养基，在厌氧条件下30℃培养36h；其中MRS培养基牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温-80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，调pH至6.2～6.4，蒸溜水定容1000mL，121℃灭菌15min；(3)对上述稀释涂布厌氧培养所得单菌落进行选择，其中链球菌、乳杆菌为目的菌种；(4)在MRS培养基上以质量5％接种目的菌种，温度37℃发酵8小时；(5)第四步的链球菌、乳杆菌与实验室保存的益生菌Xg02混合，得到混合菌液，三种菌质量比为杆菌球菌Xg02＝1:1:3；(6)混合菌液依质量5％加入液体种子培养基中得液体种子，其中，液体种子培养基中各组份百分比为蛋白胨0.85％，牛肉膏2.0％，葡萄糖2.0％，酵母浸出物0.7％，肝浸液5％(v/v)；其中肝浸液的制备200g猪肝脏加500g水，煮沸，纱布过滤，取滤液；(7)液体种子按质量12％添加到固体发酵培养基中，37℃发酵20小时，发酵结束低于65℃干燥粉碎得固态粉剂微生物菌剂；其中，固体发酵培养基为米糠47.0％，麸皮42.5％，葡萄糖10.5％，起始pH6.5，水份68％。
全文摘要
本发明公开了一种应用于仔猪养殖中取代药物添加剂的复合微生物菌剂，依以下步骤制备无菌操作取得刚宰杀健康猪小肠一段，用无菌刀片将肠黏膜刮下，倒入无菌水稀释10倍，搅拌2min，静置10min，取上层清液1mL，接种到预增菌培养液中，30℃恒温培养24h；在MRS培养基上以质量5％接种目的菌种，温度37℃发酵8小时；培养后目的菌种与实验室保存的益生菌Xg02混合得到混合菌液；混合菌液依质量5％加入液体种子培养基中得液体种子；液体种子按质量12％添加到固体发酵培养基中，发酵结束低于65℃干燥粉碎得固态粉剂微生物菌剂；在仔猪养殖中利用微生物菌剂取代药物添加剂，提高动物抵抗力，免受外来有害细菌的感染，促生长，防疾病。
文档编号A23K1/16GK101380335SQ20081015546
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者李相前 申请人:淮阴工学院