专利名称：：一种富含饲用功能肽的发酵豆粕制备方法
技术领域：
：本发明涉及以去皮豆粕为原料，利用微生物发酵技术有效去除豆粕中各种抗营养因子，同时得到含有大量多肽发酵豆粕的一种生产工艺，尤其涉及一种多菌种混合固体发酵制备富含饲用功能肽豆粕的微生物发酵工艺。
背景技术：
：随着畜牧水产业的迅速发展，蛋白类饲料的需求量越来越大，但由于食品安全性问题，尤其是近年来各国限产鱼粉、禁止利用一些畜产品下脚料生产的肉骨粉等动物蛋白饲料，因此，人们越来越关注各种植物性蛋白质源的开发利用，其中，豆粕作为优质植物性蛋白源，来源广泛，营养丰富，豆粕蛋白的高值化利用一直是人们的研究开发热点。豆粕是我国乃至全世界应用最为广泛的植物性饲料蛋白质原料，但随着科技的进歩和研究的深入，人们发现80%左右的大豆蛋白质相对分子质量都在100kDa以上，且大多数分子内部呈反平行p-hdk非有序结构，分子高度压縮、折叠，使得豆粕蛋白质的消化性和生物学功能远不及鱼粉等动物性蛋白质饲料，此外，豆粕中存在多种抗营养因子也对动物产生毒害作用，严重影响了豆粕在动物生产上的应用价值。因此，旨在提高豆粕营养价值、扩大豆粕在畜禽水产上使用的研究就显得更加重要，同时弥补豆粕营养缺陷的各种加工处理法也相继应运而生。豆粕除了物理加热处理、化学浸提法处理外，生物处理法因其绿色、高效的特点受到人们欢迎，尤其是成本较低的微生物发酵处理法，己成为当前研究、应用的热点。微生物发酵即利用微生物的生长代谢活动及代谢过程中产生的各种酶类对豆粕的营养特性进行改善。与其它方法相比，微生物发酵法因其具有营养破坏性小、改善效果全面、经济效益高等优点。大量研究证明，利用微生物发酵技术，可使豆粕中的抗营养因子含量下降至饲用水平，基本上消除抗营养因子的抗营养作用，同时有的微生物还可将豆粕大分子蛋白质降解为小分子量蛋白、肽和氨基酸，使其营养特性改善，更易被动物消化吸收利用。另外，微生物发酵豆粕还可得到具有生理活性的抗菌肽、提高保健物质的生物活性，采用适当的加工工艺，还可使发酵豆粕中存有一定数量的益生菌，用于改善动物肠道微生态环境，对动物自身的健康和营养有很大作用。本发明技术主要针对上述提高豆粕营养价值的关键问题，通过系统研究多菌种混合固体发酵的发酵工艺参数，最终获得了一种富含饲用功能肽的发酵豆粕制备方法，这对于解决我国畜牧水产业发展中优质蛋白质源紧缺的问题提供了重要的理论依据和技术支持。
发明内容本发明的目的在于提供一种富含饲用功能肽的发酵豆粕制备方法，进一步促进豆粕在畜牧水产业上的有效利用，使其成为解决我国目前蛋白质饲料资源短缺的途径之一。本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明提供的一种富含饲用功能肽的发酵豆粕制备方法，其步骤为a.从原始出发菌种枯草杆菌属细菌和酵母菌属真菌中挑取一环菌体，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，于3(TC-37'C温度下，150-170rpm，摇床培养16-24小时后，直到OD6()()=0.7-0.9,停止培养，作为种子液。从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于3(TC-35'C温度下静止培养40-48小时，作为种子液。b.在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中以1_5%接种量接种种子液，于3(TC-37'C温度下，150-170rpm，摇床培养20—28小时。在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以1一5%接种量接种种子液，于3(TC-35'C温度下静止培养48小时。将枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌、乳酸菌的各种菌株发酵培养液按1.8:1:1比例混合均匀，作为豆粕发酵菌种液。c.将b中豆粕发酵菌种液以5。/。的接种量接种到含水量为50。/。的豆粕(过40目筛)中，同时加入5%的糖蜜，并混合均匀(初始pH值为7.0)，于4(TC温度下需氧发酵48小时，然后于6(TC下干燥制样，最后对发酵前后豆粕进行营养成分分析。d.发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6-9个月。e.发酵后的豆粕即可作为猪、鸡、罗非鱼等的饲料。本发明步骤a中所述的菌种种子LB培养基按重量百分比含有0.3%_0.5%的氯化钠、0.3%一0.5%的蛋白胨和0.5%—1.0%酵母膏，乳酸菌属培养基含有0.2%-0.4%的胰蛋白胨、0.3%-0.5%的NaCl、0.2%_0.4°/。的葡萄糖、0.3%的KH2P04、0.3%的K2HP04、0.02%的MgCl2、0.005%的CaS0d和0.2%的淀粉，麦芽汁培养基含有10%的麦芽膏粉和0.01%的氯霉素。本发明步骤a中所述的菌种为枯草芽孢杆菌(Sad〃u^w6rifc)3株、乳酸菌(Z^"o6fl"7/w)l株、啤酒酵母菌(&ccAarowyc^cre他/ae)1株。本发明步骤b中所述的三种液体扩大培养基的配方与步骤a相同。本发明具有以下有益效果本发明采用微生物发酵处理豆粕，避免了化学添加剂和物理法对豆粕蛋白功能性质的影响，发酵过程中产生的各种消化酶、中小分子蛋白(功能肽)、氨基酸、维生素、益生菌等也大大提高了豆粕的营养价值。无论从凝胶色谱中蛋白质分子量变化，还是从电泳中都能明显的看出，豆粕发酵后大分子蛋白质被明显降解，按隆丁分区法测定其中小分子蛋白质(饲用功能肽)，占发酵豆粕总蛋白质的53.61%，而未发酵豆粕只占3.47%。发酵后豆粕的氨基酸含量大多都增加了，也更加平衡了，其最缺乏的蛋氨酸增加了一倍多，更有利于机体的吸收利用。从测定结果看，混和发酵后豆粕中的抗营养因子去除效果很明显，如胰蛋白晦抑制因子、脲酶全部失活。发酵前豆粕中63.53%的磷都以植酸磷的形式存在，发酵后植酸磷明显下降，只占13.75%。具体实施例方式本发明提供的一种富含词用功能肽的发酵豆粕制备方法的实施例如下本实施例所用的菌种为枯草芽孢杆菌(few'""s^/6"7is)3株、乳酸菌"3"0&77^)l株、啤酒酵母菌(feccferoyzy^es1株。其具体步骤为a.由5克蛋白胨、5克酵母膏、3克氯化钠和1升水(pH7.0)组成的LB液体培养基，倒入无菌三角瓶中，制成枯草芽孢杆菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由2克蛋自M^、5克NaCl、2克葡萄糖、3克KH2P04、3克K2HP04、0.2克MgCl2、0.05克CaS04、2克淀粉和l升水(pH6.5)组成的乳酸菌属培养基，倒入无菌三角瓶中，制成乳酸菌种子液体培养基和液体扩大培养基；由100克麦芽膏粉、0.01克氯霉素和1升水〔pH6.0)组成的麦芽汁培养基，倒入无菌三角瓶中，制成酵母菌种子液体培养基和液体扩大培养基。b.从原始出发菌种枯草杆菌属细菌和酵母菌属真菌中挑取一环菌体，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，于3(TC-37'C温度下，150-170rpm，摇床培养16-24小时后，直到OD,二0.7-0.9,停止培养，作为种子液。从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于3(TC-35'C温度下静止培养40-48小时，作为种子液。c.在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中以1一5%接种量接种种子液，于3(TC-37'C温度下，150-170rpm，摇床培养20—28小时。在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以1一5%接种量接种种子液，于30'C-35t:温度下静止培养48小时。将枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌、乳酸菌的菌株发酵培养液按1.8:1:1比例混合均匀，作为豆粕发酵菌种液。d.将豆粕发酵菌种液以5°/。的接种量接种到含水量为50%的豆粕(过40目筛)中，同时加入5%的糖蜜，并混合均匀(初始pH值为7.0)，于40。C温度下需氧发酵48小时，然后于6(TC下干燥制样。e.对发酵前后豆粕进行营养成分分析。f.发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6-9个月。g.步骤f中发酵后的豆粕即可作为猪、鸡、罗非鱼等的饲料。经上述实例中微生物发酵法制备的豆粕成品的营养特性得到明显改善，粗蛋白提高了18.03%，蛋白质分子量明显降低，水溶性蛋白质含量升高了6.57倍，中小分子蛋白质(功能肽)含量升高了17.23倍，多种氨基酸含量都有所增加，蛋氨酸升高了1.23倍；发酵豆粕抗营养因子基本得到消除，胰蛋白酶抑制因子和脲酶完全失活；发酵豆粕还含有丰富的维生素、有益菌及未知生长因子，营养价值大大得到了提高。可较明显地提高了豆粕在动物水产生产上的应用。其效果如下(1)添加发酵豆粕对肉鸡生长的影响。选用21日龄商品岭南黄肉鸡192只，随机分为4组，每组4个重复，每个重复12只。第一组为对照组，饲喂基础日粮，其余3组为分别添加5%、10%、15%发酵豆粕处理组1、2、3，设计等氮等能日粮。试验期22天，研究在饲粮中添加高产多肽发酵豆粕对肉鸡生产性能、屠宰性能、血清生化、免疫器官重以及消化道重等指标的影响。结果表明①发酵豆粕可以提高肉仔鸡的生产性能，添加5°/。效果最佳，显著提高了平均日增重(P<0.05)、降低了料重比(P〈0.05)(表l);②发酵豆粕可以増加血清蛋白质含量，加速蛋白质合成代谢，但添加比例过大(159。)时，血清尿素氮显著增加(P〈0.05)，也加速了蛋白质的分解代谢(表2);③添加发酵豆粕有改善肉鸡免疫功能、优化消化道功能的趋势，而对肉鸡的屠宰性能、脂质代谢无影响(表3-表5)。表1不同发酵豆粕添加量对肉鸡生产性能的影响日采食量(g/d/羽)日增重(g/d/羽)实验期(26-48d)料重比全期(0-48d)料重比对照组104.41±1.31ab40.34±0.85a2.59±0.03a2.20±0.03a处理1108.03±0.12a42.87±0.17b2.52±0.01b2.17±0.01b处理2104.38土1.98"40.45±0.50a2.58±0.02ab2.20±0.02*处理3103.58±0.66b40.64±0.57a2.55±0.02ab2.18±0.02'b注肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05).未标注者表示差异不显著，下同。表2不同发酵豆粕添加量对肉鸡血清生化指标的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)断奶仔猪日粮中发酵豆粕替代代乳粉的研究。试验选取5~7kg杜长大三元杂健康断奶仔猪216头，按体重、胎次相近，性别各半的原则随机分成3个处理组(第l组代乳粉1组；第2组代乳粉2组；第3组发酵豆粕组)，每组4个重复，每个重复16头瞎，试验期为20天。试验结果表明断奶仔猪日粮中使用发酵豆粕，其在日增重、日采食量、饲料报酬上，比代乳粉1好，分别改善22.22%、4.67%、16.77%,差异显著(P〈0.05);与代乳粉2比较差异不显著(P>0.05)(表6);在腹泻率方面，发酵豆粕组比代乳粉组略高，但差异不显著(P>0.05);在断奶日粮中使用发酵豆粕替代代乳粉在技术上是可行的，可完全替代fi乳粉，对仔猪的生产性能无显著影响。表6各组断奶仔猪的生产性能指标处理组1处理组2处理组3平均始重(kg)平均未重(kg)平均日增重(g/d)平均日采食量(g/d)耗料增重比(F/G)6.21±0.1210.26±0.23202.52±0.32366.5±21.01.81±0.066.22±0.0811.24±0.21251.05±9.61391.6±23.41.56±0.096.20±0.1311.15±0.19247.56±12.43383.6±19.61.55±0.11注同行数字后字母不同者，表示相互间差异显著(P《0.05)。(3)配合饲料中添加发酵豆粕对吉富罗非鱼生长性能的影响。实验设4个组对照组为空白组词喂基础饲料，实验组在基础伺料中分别添加5%，10%，15%的发酵豆粕(分别记为处理组l、2、3)。每组2个重复，每个重复30尾鱼，实验期共计30天。结果显示以5%、10%的发酵豆粕添加水平时，罗非鱼各项指标均优于对照组和15%添加组，10%添加组罗非鱼的日增重、相对增重率、特定生长率与对照组和15%添加组间有显著性的差异(P<Q.05、P<0.01、P<0.01);15%添加组对罗非鱼的养殖效果不如对照组，但两者之间没有显著性差异(P>0.05)(表7)。表7添加发酵豆粕对吉富罗非鱼生长性能的影响指标对照组处理组1处理组2处理组3平均初重(g)7,74±0.127.30±0.387,35±0.017.36±0.25平均末重(g)36.48±0.4138.14±1.7241.54±0.7534.77±1.09平均日增重0.96±0.02a1.03±0.04ab1.14±0.02bO.91±O.03a相对增重率374.15±12.46a422.85±3.65ab464.95±9.42b372.10±l.llaSGR5.6±0.09a5.5±0.02ab5.77±0.06b5.17±O.0〗aPER273.47±0.12294.09±16.44300.10±0.14273.36±20.48FCR1.16±0.00051.08±0.061.06±0.00051.17±0.08成活率(％)100100100100注表中上标英文字母不同的同行数值间差异显著或极显著(其中平均日增重显著性水平为0.05,相对增重率和SGR显著性水平为O.CH)。权利要求1、一种富含饲用功能肽的发酵豆粕制备方法，其步骤为a.从原始出发菌种枯草杆菌属细菌和酵母菌属真菌中挑取一环菌体，分别接种到LB种子培养基和麦芽汁种子培养基中，于30℃-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养16-24小时后，直到OD600＝0.7-0.9，停止培养，作为种子液。从原始出发菌种乳酸菌属细菌中挑取一环菌体，接种到乳酸菌属培养基中，于30℃-35℃温度下静止培养40-48小时，作为种子液。b.在液体扩大LB培养基(枯草杆菌属细菌)和麦芽汁培养基(酵母菌属真菌)中以1-5％接种量接种种子液，于30℃-37℃温度下，150-170rpm，摇床培养20—28小时。在液体扩大乳酸菌属培养基(乳酸菌属细菌)中以1-5％接种量接种种子液，于30℃-35℃温度下静止培养48小时。将枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌、乳酸菌的各种菌株发酵培养液按1.8∶1∶1比例混合均匀，作为豆粕发酵菌种液。c.将b中豆粕发酵菌种液以5％的接种量接种到含水量为50％的豆粕(过40目筛)中，同时加入5％的糖蜜，并混合均匀(初始pH值为7.0)，于40℃温度下需氧发酵48小时，然后于60℃下干燥制样，最后对发酵前后豆粕进行营养成分分析。d.发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6-9个月。e.发酵后的豆粕即可作为猪、鸡、罗非鱼等的饲料。2、根据权利要求l所述的富含饲用功能肽的发酵豆粕的制备方法，其步骤a中所述的菌种种子LB培养基按重量百分比含有0.3%—0.5%的氯化钠、0.3%—0.5%的蛋白胨和0.5%—1.0%酵母膏，乳酸菌属培养基含有0.2%-0.4%的胰蛋白胨、0.3%-0.5。/。的NaCl、0.2°/。-0.4%的葡萄糖、0.3%的KH2P04、0.3%的K風、0.02%的MgCl2、0.005%的CaS(X和0.2%的淀粉，麦芽汁培养基含有10%的麦芽膏粉和0.01%的氯霉素。3、根据权利要求1所述的富含饲用功能肽的发酵豆粕的制备方法，其步骤a中所述的菌种为枯草芽孢杆菌(5ac!7^tf3株、啤酒酵母菌(&cctora，'c^1株以及乳酸菌(丄at'to6ac!'〃Ks)1株、。全文摘要本发明公开了一种富含饲用功能肽的发酵豆粕制备方法。本发明涉及以去皮豆粕为原料，利用微生物发酵技术有效去除豆粕中各种抗营养因子，同时得到含有大量多肽发酵豆粕的一种生产工艺，尤其涉及一种多菌种混合固体发酵制备富含饲用功能肽豆粕的微生物发酵工艺。将扩大培养好的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)3株、啤酒酵母菌(Saccharomycescrevisiae)1株以及乳酸菌(Lactobacillus)1株的发酵培养液按1.8∶1∶1比例混合均匀，以5％的接种量接种到含水量为50％的棉籽粕(过40目筛)中，同时加入5％的糖蜜，并混合均匀(初始pH值为7.0)，于40℃温度下需氧发酵48小时，然后于60℃下干燥制样，最后对发酵前后豆粕进行营养成分分析。发酵豆粕成品经称量、包装后放于阴凉干燥处，在室温下可存放6-9个月。发酵后的豆粕即可作为猪、鸡、罗非鱼等的饲料。文档编号A23K1/00GK101455267SQ200810219198公开日2009年6月17日申请日期2008年11月18日优先权日2008年11月18日发明者丘银清,叶明强,徐志宏,潘木水,罗国庆,赵祥杰,邝哲师,薇陈申请人:广东省农业科学院农业生物技术研究所;广东宝桑园健康食品研究发展中心