专利名称：：一种培育转基因植物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种培育转基因植物的方法。
背景技术：
：利用土壤农杆菌转入外源基因是植物基因工程中的有效手段。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。普通双元载体已被广泛应用于农杆菌介导的植物转化，但这类载体通常只能转移520kb的外源DNA片段；而双元细菌人工染色体(BinaryBacterialArtificialChromosome，BIBAC)载体可以弥补普通双元载体的不足。双元细菌人工染色体(BIBAC)以细菌人工染色体(BAC)文库载体为基础，含有大肠杆菌F质粒和发根农杆菌Ri质粒的复制起点，能够在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝形式稳定复制，用于农杆菌介导的高分子量DNA的植物转化。在T-DNA区靠近左右边界序列处分别引入了植物选择标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)和潮霉素磷酸转移酶(HYG)基因，它们分别编码对氨基糖苷类抗生素和潮霉素的抗性。在NPTII和HYG两个基因之间有多克隆位点，可供插入外源大片段DNA。为提高克隆效率，还引入蔗糖致死基因sacB。故BIBAC不仅能作为基因组文库的载体，而且可以将完整的高分子量的核DNA导入植物基因组中，筛选到的候选BIBAC克隆可直接进行功能分析，省去了亚克隆的步骤。因此，BIBAC载体系统是一套可用于稳定转化大片段DNA进入到植物染色体上的转化系统。小盐芥(Thellugiellahalophila)是一种盐生植物，它生长在华东地区海滩盐土上，是一种不可忽视的非常有价值的自然资源，而且有许多特征和模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)相似。拟南芥完成其生活史的NaCl浓度最高不超过75mM，而小盐芥能在超过300mM的NaCl浓度下完成生活史。小盐芥和拟南芥有相似的形态和生活史，如个体小、生活周期短、自花传粉和基因组简单；它们有相近的亲缘关系(cDNA序列中90%的核苷酸相同)、相似的基因序列和排列。盐芥的基因组尺寸接近于拟南芥的两倍。因此，用小盐芥作为材料，通过系统的遗传分析将有可能发现耐盐基因，可用于研究植物耐盐的分子机理。虽然目前通过过量表达一些与盐有关的基因可以增加植物的耐盐能力，但单纯转化一个基因提高植物的耐盐能力是有限的。植物的耐盐性状是数量性状遗传。在同一条信号途径上面的基因可能成簇存在，通过同时转化与耐盐相关的基因簇，有可能明显提高植物的耐盐能力。
发明内容本发明的目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，是将含有外源DNA的重组双元细菌人工染色体导入农杆菌中，得到重组农杆菌，将所得到的重组农杆菌用如下溶液进行悬浮后，转化目的植物；所述溶液的溶剂为水，溶质是非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77和蔗糖，所述非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77的浓度为0.05%-0.1%(体积百分比浓度)，所述蔗糖的质量百分比浓度为5%，所述外源DNA具体可来自小盐芥的基因组DNA，所述目的植物具体可为拟南芥。本发明所述的植物转化方法，还包括如下耐盐筛选步骤当转基因植物培养至抽薹期用50mMNaCl浇灌3天，然后用lOOmMNaCl浇灌3天，最后用200mMNaCl浇灌3天，停止灌溉NaCl溶液。GUS组织染色和PCR检测证明，本发明的培育转基因植物的方法可将高达75kb的外源DNA片段导入目的植物中，这使与耐逆相关(特别是耐盐相关)的基因簇转入目的植物的可能性大大提高，为耐盐植物的培育奠定了技术基础。图1为转基因植物中的sacB和nptll基因PCR检测；M为分子量标记；1.sacB基因；2.nptll基因。图2为转基因植株的GUS染色结果；图3为MS平板上转化植株的的耐盐性筛选图；A:培养基中不含NaCl;B:培养基中含200mMNaCl。图4为土中进行的耐盐性筛选结果。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、农杆菌介导拟南芥转化1)构建小盐芥(Thellungiellahalophila)双元细菌人工染色体文库提取生长20天的小盐芥地上部分总DNA，用限制性内切酶BamHI对总DNA进行不完全酶切，经过脉冲凝胶电泳分析，将分子量在50-100kb之间的DNA片段从凝胶中回收，回收的DNA片段与同样经过BamHI酶切并脱磷的植物双源表达载体BIBAC2(HamiltonCM，FraryA，LewisC，Tanksley，SD(1996)StabletransferofintacthighmolecularweightDNAintoplantchromosomes.ProcNatlAcadSciUSA.93:9975-9)进行连接反应。连接产物利用电转的方法转入大肠杆菌DH10B中用于文库的扩增。l微升连接产物转化效率为1X10SBAC克隆，整个文库由23，040个克隆组成。稳定性检测结果表明，小盐芥基因组DNA能够在BIBAC载体中稳定存在。2)、农杆菌介导拟南芥转化从小盐芥BIBAC文库中挑选210个单克隆，这些克隆中的外源DNA插入片段的大小为50-100kb，分别提取上述克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法分别将各个质粒DNA单独导入农杆菌LBA4404中，得到210种含有一个外源质粒的重组农杆菌。分别挑取重组农4杆菌单克隆菌落转入34mlLB培养液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。培养得到的菌液转接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。当菌液0D值为1.0，分别收集菌液入离心管，4000rpm、20min，收集菌体。分别用新鲜配制的如下溶液重悬菌体溶剂为水，溶质是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(Fluka74385)的浓度为0.05%和蔗糖的质量百分浓度为5%。选取抽苔期的野生型Columbia生态型拟南芥健壮植株，分别带盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整个花序浸泡于上述菌体悬浮液中，而叶片尽量不与菌体悬浮液接触。30秒后将盆取下，横放于暗箱中约24h，并用塑料膜覆盖1天，保持湿润。然后将处理过的拟南芥植株放于2225t:的光照条件下使其正常生长。收获种子，干燥条件下保存待用。3)农杆菌介导拟南芥转化从小盐芥BIBAC文库中挑选210个单克隆，这些克隆中的外源DNA插入片段的大小为50-100kb，分别提取上述克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法分别将各个质粒DNA单独导入农杆菌LBA4404中，得到210种含有一个外源质粒的重组农杆菌。分别挑取重组农杆菌单克隆菌落转入34mlLB培养液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。培养得到的菌液转接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。当菌液OD值为1.0，分别收集菌液入离心管，4000rpm、20min，收集菌体。分别用新鲜配制的如下溶液重悬菌体溶剂为水，溶质是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(Fluka74385)的浓度为0.1%和蔗糖的质量百分浓度为5%。选取抽苔期的野生型Columbia生态型拟南芥健壮植株，分别带盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整个花序浸泡于上述菌体悬浮液中，而叶片尽量不与菌体悬浮液接触。30秒后将盆取下，横放于暗箱中约24h，并用塑料膜覆盖l天，保持湿润。然后将处理过的拟南芥植株放于2225t:的光照条件下使其正常生长。收获种子，干燥条件下保存待用。4)农杆菌介导拟南芥转化从小盐芥BIBAC文库中挑选210个单克隆，这些克隆中的外源DNA插入片段的大小为50-100kb，分别提取上述克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法分别将各个质粒DNA单独导入农杆菌LBA4404中，得到210种含有一个外源质粒的重组农杆菌。分别挑取重组农杆菌单克隆菌落转入34mlLB培养液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。培养得到的菌液转接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。当菌液OD值为1.0，分别收集菌液入离心管，4000rpm、20min，收集菌体。分别用新鲜配制的如下溶液重悬菌体溶剂为水，溶质是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，SillwetL-77(LEHLESEEDS,USA，Cat#VIS_02)的浓度为0.1%和蔗糖的质量百分浓度为5%。选取抽苔期的野生型Columbia生态型拟南芥健壮植株，分别带盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整个花序浸泡于上述菌体悬浮液中，而叶片尽量不与菌体悬浮液接触。30秒后将盆取下，横放于暗箱中约24h，并用塑料膜覆盖1天，保持湿润。然后将处理过的拟南芥植株放于2225t:的光照条件下使其正常生长。收获种子，干燥条件下保存待用。5)农杆菌介导拟南芥转化从小盐芥BIBAC文库中挑选210个单克隆，这些克隆中的外源DNA插入片段的大小为50-100kb，分别提取上述克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法分别将各个质粒DNA单独导入农杆菌LBA4404中，得到210种含有一个外源质粒的重组农杆菌。分别挑取重组农54mlLB培养液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。培养得到的菌液转接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:摇菌过夜。当菌液0D值为1.0，分别收集菌液入离心管，4000rpm、20min，收集菌体。分别用新鲜配制的如下溶液重悬菌体溶剂为水，溶质是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，SillwetL-77(LEHLESEEDS,USA，Cat#VIS_02)的浓度为0.05%和蔗糖的质量百分浓度为5%。选取抽苔期的野生型Columbia生态型拟南芥健壮植株，分别带盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整个花序浸泡于上述菌体悬浮液中，而叶片尽量不与菌体悬浮液接触。30秒后将盆取下，横放于暗箱中约24h，并用塑料膜覆盖1天，保持湿润。然后将处理过的拟南芥植株放于2225t:的光照条件下使其正常生长。收获种子，干燥条件下保存待用。6)转化植株的筛选收集步骤2)、3)、4)和5)中转化后的拟南芥的1\代种子，晾晒约一周后，放入1.5ml离心管保存(加入硅胶颗粒保持干燥)。取约0.lml种子放入1.5ml离心管，加入lml70%乙醇漂洗2min。离心沉淀种子，吸干乙醇；加入10%漂白剂(bleach)漂洗20min，离心沉淀种子，吸干漂白剂；在超净台中用无菌水漂洗4次，每次加入lml无菌水；用0.2%琼脂重悬浮种子，并将其均匀的铺在1/2MS盐培养基(含50iig/ml卡那霉素+150yg/ml羧节青霉素)平板上；4。C春化2天后，移入22t:植物培养箱(光暗周期为16/8小时)；培养约二周后，可以筛选到具有抗性的拟南芥，具有抗性的拟南芥表现为真叶呈深绿色，根深长至培养基中，将具有抗性的拟南芥移至正常MS培养基中。10天后将苗移入土中培养，收获T2种子。7)转化植株的鉴定1.转化植株的GUS组织染色将步骤2)、3)、4)和5)的拟南芥T2代种子消毒灭菌播在MS平板上，待长出4片真叶后，随机取20个株系，进行GUS组织染色。GUS染色方法参见JeffersonRA，KavanaghTA，Bevan丽(1987)GUSfusions:b-glucuronidaseasasensitiveandveratilegenefusionmakerinhigherplants.EMBOJ6:3901-7GUS组织染色结果如图2所示，GUS基因表达很强。步骤2)、3)、4)和5)的拟南芥T2幼苗中的20个株系中分别有18、15、18、17个株系呈蓝色GUS活性，图中仅显示其中一株的结果，其他均与其相同。2.转化植株的PCR检测以拟南芥T2代植株的基因组DNA为模板，进行PCR检测。用于检测NPTII基因的引物序列正向为5'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3';反向为5'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3'。用于检测sacB基因的引物序列正向为5'-GGTCGGCGACAACTCAATCGACAG-3';反向为5'-GCGGCACTGCGAAGTGAGAGTAAG-3'。PCR体系(50ii1):1ii1lOiiM正向引物，lii110iiM反向引物，1ii1TaqDNA聚合酶，liildNTP，liilDNA模板(浓度为100ng/iil)，5ii110Xbuffer,40ii1ddH20。PCR反应参数6首先94°C4min;然后94°C45s、55。C30s、72。C2min，30个循环；最后72°C10min。反应结束后，产物进行1%的琼脂糖凝胶上，电泳后于紫外灯下照相。PCR检测结果表明，在GUS组织染色呈蓝色的株系中均检测出NPTII基因扩增产物和sacB基因扩增产物。GUS组织染色和PCR检测结果都表明，利用双元细菌人工染色体和农杆菌介导能将外源DNA片段导入拟南芥中。8)转化拟南芥植株的耐盐性筛选1.含盐的MS平板上初筛将步骤2)、3)、4)和5)中转化后的拟南芥的T2代种子及野生型种子消毒灭菌播在无NaCl的MS平板上。4t:春化2天后，移入22t:植物培养箱。当植株长到四片真叶时，分别把相同株数的转基因植株与野生型植株移到含有200mMNaCl的MS平板上。在22。C植物培养箱培养两周，观察转基因植株和野生型植株的耐盐表型。野生型植株的叶片几乎全部发黄、枯萎，将步骤2)、3)、4)和5)中转化后的拟南芥的L代株系中新生叶片均保持绿色的株系挑出，作为候选耐盐的株系。结果，在分别得到5、4、6、8个候选耐盐的株系。2.土壤中筛选平板中筛选得到的耐盐株系，其筛选过程是在人工配制好的培养基上进行的，而且所考察的过程没有涉及植物的整个生长和营养周期，不能确定在植物抽苔和开花、结果期间对盐的耐受能力。故采用如下方法对所得到的耐盐株系在土壤中进行直接筛选选取候选耐盐的各个株系及野生型植株各IO株，在拟南芥即将抽苔时，依次用50mMNaCl、100mMNaCl禾P200mMNaCl处理植株的根系，其中，50mMNaCl的处理时间为3天，100mMNaCl的处理时间为3天，200mMNaCl的处理时间为3天。15天后，观察耐盐植株与野生型植株的抗盐表型，并拍照记录。野生型植株均发黄、萎蔫，候选耐盐的各个株系中各个株系均有2个株系叶片颜色健康，上述叶片颜色健康、生长状况良好的株系为耐盐株系。权利要求一种培育转基因植物的方法，是将含有外源DNA的重组双元细菌人工染色体文库导入农杆菌中，得到重组农杆菌，将所得到的重组农杆菌用如下溶液进行悬浮后，转化目的植物，得到转基因植物；所述溶液的溶剂为水，溶质是壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77和蔗糖；所述壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77的体积百分比浓度为0.05％-0.1％，所述蔗糖的质量百分比浓度为5％。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述外源DNA来自小盐芥的基因组DNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物为拟南芥。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下耐盐筛选步骤在转基因拟南芥的抽薹期，依次用50mMNaCl、100mMNaCl禾P200mMNaCl处理植株的根系，其中，所述50mMNaCl的处理时间为3天，所述lOOmMNaCl的处理时间为3天，所述200mMNaCl的处理时间为3天。全文摘要本发明公开了一种培育转基因植物的方法，是将含有外源DNA的重组双元细菌人工染色体导入农杆菌中，得到重组农杆菌，将所得到的重组农杆菌用如下溶液进行悬浮后，转化目的植物溶剂为水，溶质是非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77和蔗糖；其中，壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77的体积百分比浓度为0.05％-0.1％，蔗糖的质量百分比浓度为5％。利用本发明的方法能将高达75kb的外源DNA片段导入目的植物中，这使与耐逆相关(特别是耐盐相关)的基因簇转入目的植物的可能性大大提高，为耐盐植物的培育奠定了技术基础。文档编号A01H1/00GK101736013SQ200810226759公开日2010年6月16日申请日期2008年11月21日优先权日2008年11月21日发明者夏然,张译月,谢旗申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所