专利名称：海马齿及其提取物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海马齿及其提取物的新用途。
背景技术：
随着全球人口的迅速增长，城市化步伐的不断加快以及农业、养殖业废水的排入， 造成近海海水严重富营养化，生态系统破坏，大面积的赤潮频繁发生，海洋污染日益 成为世界各国迫切关切的问题。近年来，各国科学家已经开展了各种富营养化治理的
相关研究，其中植物修复技术(Phytoremediation)作为一项新兴的技术，逐渐成为研 究的热点(Agency, U. (2000). Introduction to Phytoremediation， US Environmental Protection Agency)。目前植物修复技术在淡水系统中已经得到很好 的应用，人们利用大型水生植物治理富营养化水体，主要基于以下机制吸收大量营
养降低水体营养盐水平；遮荫和创造缺氧环境； 一些水生植物还能对藻类起克生作用，
抑制浮游藻类的生长和促进水中其它水生生物的代谢(Gross 2003， Allel叩athy of Aquatic Autotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences 22(3): 313-339; 方 云英2006，不同水生植物吸收去除水体氮效果及机理研究；Benson, 0'Neil et al. 2008， Using the aquatic macrophyte Vallisneria americana (wild celery) as a nutrient bioindicator. Hydrobiologia 596: 187-196; Hu， Ao et al. 2008， Treating eutrophic water for nutrient reduction using an aquatic macrophyte (Ipomoea aquatica Forsskal) in a deep flow technique system. Agricultural Water Management 95(5): 607-615; Penning, Dudley et al. 2008， Using aquatic macrophyte community indices to define the ecological status of European lakes. Aquatic Ecology 42(2): 253-264)。在海洋领域，植物修复技术的研究仍处于探索 阶段。近年来，国内外着重利用大型海藻治理海水富营养化和赤潮问题(Gross， Erhard et al. 2003， Allelopathic activity of C&rato/ 力jiJ咖flfe77ers〃/ff L and A^/as ssp. intermedia (Wolfgang) Casper. Hydrobiologia 506-509 (1) : 583-589; Nielsen 2003， Nutrient loading and consumers: agents of change in open-coast macrophyte assemblages. Proc Natl Acad Sci USA 100(13) : 7660-5; Erhard and Gross 2006， Allelopathic activity of ^/oofes c朋sc/e/ 57'51 and ^7oflfes y 〃"a77h' against epiphytes and phytoplankton. Aquatic Botany 85(3): 203-211; Hilt, Ghobrial et al. 2006， 57." allelopathic potential of妙/^'o/ 力j^mz yerficj'77(3t鹏(Haloragaceae) against selected phytoplankton species. Journal of Phycology 42(6): 1189-1198; 0rhan， Se匿et al. 2006， Turkish freshwater and marine macrophyte extracts show in vitro antiprotozoal activity and inhibit Fabl， a key enzyme of Plasmodium falciparum fatty acid biosynthesis. Phytomedicine 13(6): 388-93; Mulderij， Mau et al. 2007, Allelopathic activity of 5"tra"ote51 s7oi(/e51 on phytoplankton-towards identification of allelopathic-substances. Hydrobiologia 584(1): 89-100; Nagai， Imai et al. 2007， Dissolved iron and its speciation in a shallow eutrophic lake and its inflowing rivers." Water Res 41(4): 775-84)。但是现有研究表明，大型海藻存在着生长季节性和污损 生物附着等问题，严重制约了修复作用的进行(Blindow， Hargeby et al. 2002， Seasonal changes of mechanisms maintaining clear water in a shallow lake with abundant CAara vegetation. Aquatic Botany 72(3-4): 315-334; Gross, Hilt et al. 2007， Searching for allelopathic effects of submerged macrophytes on phytoplankton-state of the art and open questions. Hydrobiologia 584(1) : 77-88; Zhu, Mayer et al. 2007， Can Dreissenid Attachment and Biod印osition Affect Submerged Macrophyte Growth Journal of Aquatic Plant Management 45: 71-76)。 因此，找到既适合在海水环境中生长，又具有较高修复价值和经济价值的植物迫在眉 睫。
海水蔬菜长在海边盐碱滩涂上，用海水浇灌，除了含有普通蔬菜所含的各类营养 成分外，粗蛋白、维生素B2、维生素C以及胡萝卜素含量要比同类普通蔬菜高，其中 胡萝卜素含量高出近40倍，锌、硒等微量元素高出2-6倍，有突出的减肥、保健作 用(张华2006，海水蔬菜有前景.中国农业信息(2): 34.)。海马齿((&s"w'咖 party7acastr"// (Linn.) Linn.)为番杏科(Aizonaceae)海马齿属多年生肉质草本 植物，生长于海边沙地或盐碱地，具有良好的环境适应能力和药用价值，同时海马齿 是一种经济价值很高的海水蔬菜(Lonard and Judd 1997， The biological flora of coastal dunes and wetlands 5"e5wi咖portt/Zacsstra/zKL.) L. Journal of Coastal Research 13(1): 96-104)。 Magwa等(Magwa， Gundidza et al. 2006， Chemical composition and biological activities of essential oil from the leaves of Sesuvium portulacastrum. Journal of Ethnopharmacology 103(1): 85-89)的石开究 发现海马齿叶中具有挥发性油类物质，富含萜、烯，临床证明对发烧、坏血病等病症 具有很好的疗效。 发明内容本发明的目的是提供一种海马齿及其提取物的新用途。 本发明提供了海马齿及其提取物在修复富营养化水体中的应用。
所述富营养化水体可为海水也可为淡水。所述海马齿可为海马齿植株，所述海马 齿提取物可为海马齿各个器官的提取物，如根、茎、叶的提取物。 本发明还提供了海马齿及其提取物在抑制赤潮中的应用。 所述赤潮具体可为由中肋骨条藻引起的赤潮。
所述海马齿可为海马齿植株，所述海马齿提取物可为海马齿各个器官的提取物， 如根、茎、叶的提取物。
本发明还提供了海马齿及其提取物在抑制中肋骨条藻生长中的应用。
所述海马齿可为海马齿植株，所述海马齿提取物可为海马齿各个器官的提取物， 如根、茎、叶的提取物。
所述应用中，海马齿植株的用量可为至少1株海马齿/106个中肋骨条藻细胞。
所述提取物具体可为海马齿干粉的水提物。
所述海马齿干粉具体可为海马齿叶干粉、海马齿茎干粉和海马齿根干粉中的至少 一种，优选海马齿叶千粉。
以抑制率50%为有效抑制中肋骨条藻生长的标准，贝lj:以海马齿叶干粉计，所述 应用中，海马齿提取物的用量至少可为0.075g海马齿叶干粉/l()6个中肋骨条藻细胞； 以海马齿茎干粉计，所述应用中，海马齿提取物的用量至少可为0.61g海马齿茎干粉 /106个中肋骨条藻细胞；以海马齿根干粉计，所述应用中，海马齿提取物的用量至少 可为6g海马齿根干粉/l(f个中肋骨条藻细胞。
海马齿抑制赤潮暴发的最重要的作用机理是克生作用。在海马齿不同组织部位， 其克生作用的强弱差别明显(叶>茎>根)，这与不同组织器官中克生物质的含量和 组成密切相关。克生物质很可能最初是在叶中生成，通过茎向下输送到根部，克生物 质具有亲水性，比较容易由根系直接分泌到生长环境中。随着海马齿种植密度的升高，
克生物质的分泌量增多，海马齿对中肋骨条藻的克生作用增强；在低种植密度(lg FW/L)时，海马齿延迟骨条藻进入指数生长期，中等种植密度(2-3g FW/L)时，降 低藻细胞生长率和最大种群密度，高种植密度(4-5g FW/L)下，直接杀死藻细胞， 从而使藻细胞无法进入指数生长期。
利用海马齿修复富营养化水体，抑制赤潮，不仅基于其克生作用，海马齿还可以 吸收大量的营养盐，从而降低富营养化程度，降低赤潮发生的可能性和频率。虽然野 外栽培实验中发现海马齿自身对氮磷营养盐无富集作用，但在富营养化条件下海马齿 生长迅速，可以通过生物量的增加而去除水中氮磷营养盐。室内实验也显示，利用海马齿修复富营养化水体，平均每天单株海马齿鲜重能增加0. 039g，体内N和P的吸收 量分别为0. 858mg和0. 147mg。
低种植密度下，海马齿延迟中肋骨条藻进入指数生长期；中等种植密度下，海马 齿可降低中肋骨条藻细胞生长率和最大种群密度；高种植密度下，海马齿直接杀死中 肋骨条藻细胞，从而使中肋骨条藻细胞无法进入指数生长期。海马齿根、茎、叶干粉 的水提取物均能抑制中肋骨条藻的生长，既可降低中肋骨条藻的生长速率，又可减小 中肋骨条藻种群的最大密度；随着各种组织提取物浓度升高，对中肋骨条藻生长的抑 制作用增强，抑制作用最强的是叶，其次为茎，最后为根。海马齿可在体内吸收并通 过植株生长过程中生物量的增加来积累大量的氮磷营养盐，从而降低水体中富营养化 程度，降低赤潮发生的可能性和频率。海马齿同时是一种经济价值很高的海水蔬菜， 可广泛应用于近海海域富营养化污染以及赤潮的治理，具有很高的经济价值和社会意 义。
以下的实施例子便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为在海马齿培养11天过程中水体内叶绿素a(Chl a)浓度(n g/L)的变化。图 中数据为平均值士标准误差(『3)。
图2为在海马齿培养11天过程中水体内中肋骨条藻密度(X106细胞/L)的变化。 图中数据为平均值土标准误差(『6)。
图3为海马齿对水体内叶绿素a(Chl 3)浓度和中肋骨条藻密度的抑制率(％)， 其中，中肋骨条藻密度是在移植培养海马齿第6天测定的结果，水中叶绿素a(Chla) 浓度是在移植培养海马齿第8天测定的结果。
图4为在海区自然生长一个月的海马齿体内氮(N)和磷(P)的平均百分含量(％ )。
图5为抑制赤潮过程中平均每天单株海马齿增加的鲜重(g)和氮磷含量(mg)。
图6为不同种植密度的海马齿培养9天过程中水体内叶绿素a(Chl a)浓度(y g/L) 的变化。图中数据为平均值±标准误差(11=3)。
图7为不同种植密度的海马齿培养9天过程中水体内中肋骨条藻密度(X106细胞 /U的变化。图中数据为平均值士标准误差(『6)。
图8为不同种植密度的海马齿对水体内叶绿素a(Chl s)浓度和中肋骨条藻密度的 抑制率(％)，其中，中肋骨条藻密度是在移植培养海马齿第6天测定的结果，水中 叶绿素a (Chl 3)浓度是在移植培养海马齿第8天测定的结果。
图9为在不同提取物处理8天过程中水体内中肋骨条藻密度的变化(X106细胞 /L)。图中数据为平均值土标准误差(『6)。图10为不同提取物处理8天后水体内中肋骨条藻细胞的长度和宽度的变化(U m)。图中数据为平均值士标准误差(『30)，经LSD多重比较(P<0.05)，相同字 母表示处理组间差异不显著，不同字母表示处理组间差异显著。
图11为不同提取物处理8天后水体内中肋骨条藻细胞体积(u m3)的变化，图中数 据为平均值土标准误差(n二30)，经LSD多重比较(P<0.05)，相同字母表示处理组 间差异不显著，不同字母表示处理组间差异显著。
图12为在不同浓度的海马齿叶提取物处理11天过程中水体内中肋骨条藻密度的 变化(X 106细胞/L)。图中数据为平均值±标准误差(11=6)。
图13为在不同浓度的海马齿茎提取物处理8天过程中水体内中肋骨条藻密度的 变化(X H)6细胞/L)。图中数据为平均值士标准误差(『6)。
图14为在不同浓度的海马齿根提取物处理8天过程中水体内中肋骨条藻密度的 变化(X106细胞/L)。图中数据为平均值±标准误差(11=6)。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
厦门赏笃湖位于厦门岛西部，原为一个天然渔港，面积达10km2。 20世纪70年代初 经围垦后，成为一个基本封闭的半咸水湖。20世纪80年代初随着厦门经济特区城市的 建设和工业的发展，大量的污水未经处理就直接排入湖内，使原本清澈的湖水迅速恶 化，水生生物几乎灭绝(阮金山2006 ，厦门赏等湖水产生物体内重金属含量及评价. 海洋通报25(005): 84-89.)，氮磷等营养盐长期超出四类海水标准，属于严重的富营养 化水体，夏秋季节湖区藻类异常增殖，特别是硅藻门中的中肋骨条藻 (5!W"朋柳a cost"咖)为主要的优势种，导致赤潮频繁发生，严重破坏水体功能 和水生生态系统结构，并影响城市景观以及居民生活，因此，对湖区的生态治理刻不 容缓。以下实施例以赏笛湖的水进行试验。
以下实施例中所用的试验材料如下
① 中肋骨条藻
美国CCMP (美国国家海洋藻种中心)，编号为2092。
藻禾中无菌培养于f/2培养液(Guillard and Ryther 1962， Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyc_Zote77a "朋a Hustedt， and "e加i/7a co/ /"e/racea (cleve) Gran. Can J Microbiol 8: 229-39.)中，培养温度为15。C，光强为60 umolm2s—\光周期为12h。培养液的pH和盐度分别调至8. 0±0. 02和30。每天定 时晃动培养瓶2次，以防止藻附壁生长。
② 海马齿海马齿种苗由江苏晶隆海洋产业发展有限公司提供。
利用扦插枝条进行无性繁殖，水培培养于经醋酸纤维滤膜(0.45ym)过滤后的 厦门西海域天然清洁海水(盐度28-33)中。
③透明玻璃水缸长度X宽度X高度-30cmX20cmX 30cm。
海马齿的预培养剪取在海马齿扦插枝条，平均含有3个节、2片对生叶、株高 10-15cm，平均鲜重(FW)为5g，在经0. 45 u m醋酸纤维滤膜过滤后的厦门西海域天然 清洁海水中培养1个月。取新的0. 45 n m醋酸纤维滤膜过滤后的赏笞湖海水中添加 线、(NH4)孤和K2HP04 (腦3的终浓度为0. 5mg/L、(肌)2S04的终浓度为3. 5mg/L、 &朋04的终浓度为0. 05mg/L)，调盐度至30， pH至8. 0，将上述培养1个月后的海马 齿枝条置于透明玻璃水缸中再培养1周后，取生长良好且根系完整的植株进行以下三 个实施例的试验。
以下实施例中涉及的试验方法如下
① 植物体中氮磷含量的测定氮(N)测定使用Vario III元素分析仪(德国)， 磷(P)测定采用钼锑抗比色法(鲍士旦(1992) 土壤农化分析，农业出版社)。
② 水中叶绿素Chl a浓度的测定水样经Whatman GF/F玻璃纤维滤膜过滤后， 滤膜保存于冻存管中，在-2(TC，以N， N-二甲基甲酰胺(DMF)为萃取剂萃取24h，每 12小时振荡一次，萃取液经有机相样品针式过滤器(0.45um)抽滤后用Turner 10AU Fluorometer测定Chl a。
③ 中肋骨条藻密度的测定样品用Lugol' s试剂(浓度为1% (体积比))固定， 在倒置显微镜(Leica DM 1L)下、用浮游生物计数板计数。
④ 中肋骨条藻大小的测定在荧光显微镜(Leica DM4500B)下获得图像，使用图 像测量软件Image-Pro Express 6. 0测定大小。
⑤ 数据统计与分析利用OriginPro 7.5对实验数据作图，SPSS 13.0 (One-way ANOVA)进行方差分析，各处理组平均值的多重比较采用LSD检验。处理组间差异不 显著用相同字母(如a)表示，处理组间差异显著则用不同字母(a，b，c，d等)表示。
实施例1、海马齿对赤潮暴发的抑制作用和对富营养化海水的修复作用 取赏笞湖海水(0.45ym醋酸纤维滤膜过滤)，加入N、 P营养盐(KN03的终浓度
为0.5mg/L、 (NH》2S04的终浓度为3.5mg/L、 &即04的终浓度为0. 05mg/L)，调盐度至
30、 pH至8.0，得到溶液A。
一、海马齿对赤潮暴发的抑制作用
取9只水缸，每一水缸中加入15L溶液A，接入处于指数生长期的中肋骨条藻，使其初始密度为1X106细胞/L。分成3组，每组设3个重复，分别进行以下处理 CK组(对照组)不移植海马齿；
I处理组试验一开始(即中肋骨条藻处于停滞期时)就移植海马齿，种植密度 为15株/缸(相当于5g FW/L);
W处理组等发生赤潮时(即中肋骨条藻处于指数生长期时)再移植海马齿，种
植密度为15株/缸(相当于5g FW/L)。
以上3组均培养lld， 24h通气和水循环，平均光照为130 umolm231，光周期 为12h，平均气温为24/30。C，水温为28士2'C。每天定时取样，测定水中叶绿素(Chl a)浓度(每个重复取样一次)和中肋骨条藻密度(每个重复取样两次)。
水中叶绿素(Chla)浓度的测定结果见图l。水中中肋骨条藻密度的测定结果见 图2。结果表明海马齿能够明显抑制赤潮的暴发，显著抑制中肋骨条藻的生长，降 低水中Chl a浓度；另外，在中肋骨条藻生长指数期再移入海马齿，同样能够降低中 肋骨条藻的生长速率，使中肋骨条藻不能达到种群最大密度，并且可以加快赤潮的衰 败。
根据试验各种处理下水体中叶绿素a (Chls)浓度和中肋骨条藻密度，分别计算 试验第6天海马齿对中肋骨条藻的抑制率和试验第8天海马齿对叶绿素(Chl a)的 抑制率，计算方法如下
抑制率(％)=(对照组数值一处理组数值)/对照组数值X100X。 抑制率结果见图3。结果表明不管在中肋骨条藻生长停滞期述是在指数期，海 马齿都能有效抑制赤潮暴发；W处理组中(即中肋骨条藻处于指数生长期时再移植海 马齿)，海马齿对水中Chl a和中肋骨条藻密度的抑制率分别为35.5X和22.4M; I 处理组中(即中肋骨条藻处于停滞期时就移植海马齿)，海马齿的作用效果更加明显， 对水中Chl a和中肋骨条藻密度的抑制率分别达到了 98. 6%和97. 5%。 二、海马齿对富营养化海水的修复作用
植物对水体营养盐的修复程度主要由植物从水中吸收的氮磷含量来体现。图4为 在海区条件下生长一个月内海马齿体内N和P的百分含量，分别平均为2. 23%和0. 38 %。
另取3只水缸，每一水缸中加入15L溶液A，接入处于指数生长期的中肋骨条藻， 使其初始密度为lXl(f细胞/L。种植海马齿，种植密度为15株/缸(相当于5gFW/L)。 培养11天，实验开始时和实验结束时测定植物鲜重和体内氮磷的含量。将15株植物 鲜重和氮磷总增加量除以天数再除以植株数，计算平均每天每株植株的增加量，见图 5。结果表明海马齿在试验过程中，生长迅速，进行完ll天的试验后，平均每株 海马齿鲜重增加0. 424g(占试验前海马齿总重的0. 484%)，体内N含量增加了 9. 439mg (占试验前N含量的0. 484%),体内P含量增加了 1. 620 mg占试验前P含量的0. 484%)。 平均每天每株海马齿鲜重增加0. 039g (占试验前海马齿总重的0.044%)，体内N含 量增加了 0.858mg (占试验前N含量的0. 044%)，体内P含量增加了 0. 147mg (占试 验前P含量的0.044%)。可见，海马齿能够通过生物量的增加而大量吸收水中的氮和 磷，从而去除水中氮磷营养盐。结果表明海马齿可以显著降低水体中氮磷的含量，修 复富营养化的水体。
实施例2、营养盐充足时不同种植密度的海马齿对中肋骨条藻的抑制作用
取赏笞湖海水(0.45ym醋酸纤维膜过滤)，加入N、 P营养盐(KN03的终浓度为 0. 5rag/L、 (NH4)2S(^的终浓度为3. 5mg/L、 1(2^04的终浓度为0. 05mg/L)，调盐度至30、 pH至8.0，得到溶液A。
取18只水缸，每一水缸中加入15L溶液A，接入指数生长期的中肋骨条藻，使其 初始密度为0.2X1()6细胞/L。然后分成6组，每组设3个重复，分别进行以下处理
第一组不移植海马齿；
第二组移植海马齿，海马齿的种植密度为3株/缸(相当于lg FW/L) 第三组移植海马齿，海马齿的种植密度为6株/缸(相当于2g FW/L) 第四组移植海马齿，海马齿的种植密度为9株/缸(相当于3g FW/L) 第五组移植海马齿，海马齿的种植密度为12株/缸(相当于4g FW/L); 第六组移植海马齿，海马齿的种植密度为15株/缸(相当于5g FW/L); 为了保证营养盐充足，以上六组均隔天添加N、P营养盐(KN03的终浓度为0. 5mg/L、 (NH》2S04的终浓度为3.5mg/L、 &朋04的终浓度为0,站mg/L) ， 24h通气和水循环，平 均光照130 umol m2 s—、光周期为12h，平均气温24/3(TC，水温为28土2。C。每天 定时取样，测定水中叶绿素(Chl a)浓度(每个重复取样一次)和水中中肋骨条藻 密度(每个重复取样两次)。试验进狞9天。.
水中叶绿素(Chls)浓度的测定结果见图6。水中中肋骨条藻密度的测定结果见 图7。结果表明海马齿能够显著降低水中Chl a的浓度和中肋骨条藻的密度，抑制 赤潮的发生，而且海马齿的种植密度在一定程度上决定了抑制作用的强弱。随着海马 齿种植密度的升高，对中肋骨条藻生长的抑制作用增强。另外，在不同种植密度下， 海马齿对中肋骨条藻生长抑制作用的动态过程略有不同。在海马齿种植密度为lgFW/L 吋，海马齿延迟中肋骨条藻进入指数生长期，而海马齿种植密度稍高时，不仅抑制中肋骨条藻的生长，而且降低最大中肋骨条藻种群密度，尤其是当海马齿种植密度》4g FW/L时，可完全抑制中肋骨条藻的生长。
记录各种处理下水体中的叶绿素a (Chla)浓度和中肋骨条藻密度，分别计算试 验第6天海马齿对中肋骨条藻的抑制率和试验第8天海马齿对叶绿素(Chl a)的抑 制率。
抑制率结果见留80结果表明，在不同种植密度下，海马齿对水中Chl 3和水中 中肋骨条藻生长的抑制率基本都达到了 80%以上。
试验进行9天后，检测海马齿植株生长指标的变化，计算每缸中海马齿鲜重总增 加量、N总增加量和磷总增加量，见表l。
表1不同种植密度的海马齿培养9天后植物鲜重及体内氮磷的总增加量
处理lg/L2g/L3g/L4g/L5g/L
鲜重增加量(g)2. 173. 365. 846. 247. 00
N增加量(mg)48. 3174. 80130.01138. 91155.83
P增加量(mg)8. 2912.8422. 3123. 8426. 75
实施例3、海马齿根、茎、叶提取物对中肋骨条藻的抑制作用
一、 提取液制备
各取15g海马齿根、茎、叶的干粉末，加100ml无菌水在常温黑暗中浸提24h， 每次用超声波萃取l h，重复3次。然后在4000 g下离心10 min，收集上清液并经 0.22 um混合纤维滤膜过滤，滤液保存在4。C，作为母液备用。
二、 提取液对中肋骨条藻的抑制作用
以f/2培养液为基本培养液，调盐度、pH分别至30和8.0，高温灭菌后，分别 加入海马齿根、茎、叶的提取物母液，使浓度为3 g DW/L (以干粉计，每升培养液中 含有海马齿干粉3 g)。接入处于指数生长期的中肋骨条藻，初始密度为2X1()6细胞 /L，每个处理重复6次。培养8天，每天定时取样lml，测定中肋骨条藻密度以及大 小。
中肋骨条藻密度见图9。结果表明在培养液中加入海马齿根、茎、叶提取物均 降低了中肋骨条藻的生长速率和种群的最大密度；对中肋骨条藻密度生长抑制作用最 强的是叶，其次为茎，最后为根。
培养第8天，中肋骨条藻的形态大小见图10和图11。其中处理组间以相同字母(如 a)标记表示两者无显著差异，若处理组间以不同字母(如a与b)标记则表示两者存 在显著差异。结果表明在培养液中加入海马齿根、茎、叶提取物均改变了中肋骨条藻细胞的大小形态；海马齿各种提取物的抑制作用体现在明显增大了中肋骨条藻细胞 的长度和体积，分别是对照组的2-3倍，尤其是在海马齿叶提取物的作用下，中肋骨 条藻的体积增大了2.5倍，同时中肋骨条藻细胞宽度也较对照组大(p二O.OOl)。荧 光显微镜下观察，不同海马齿组织提取物处理之后，单个中肋骨条藻细胞明显由椭球 形变为长棒形，而且部分细胞发生质壁分离现象，核质增多，液泡变大。
实施例4、不同浓度的海马齿提取物对中肋骨条藻的抑制作用
一、 海马齿叶提取物对中肋骨条藻的抑制作用
取15g海马齿叶的干粉末，加100ml无菌水在常温黑暗中浸提24h，每次用超声 波萃取1 h，重复3次。然后在4000 g下离心10 min，收集上清液并经0. 22 u m混 合纤维滤膜过滤，滤液保存在4'C，作为母液备用。
以f/2培养液为基本培养液，调盐度、pH分别至30和8.0，高温灭菌后，加入 海马齿叶提取物母液，以叶干粉计，每升培养液中分别含有O g (CK) 、 0.5 g、 3 g、 6 g海马齿叶干粉。接入处于指数生长期的中肋骨条藻，使其初始密度为2X1()6细胞 /L，每个处理重复6次。培养11天，每天定时取样lml，测定中肋骨条藻密度。
中肋骨条藻密度见图12。
结果表明海马齿叶提取物的克生作用非常明显。在海马齿叶提取物最低浓度为 0.5g L—'时，对中肋骨条藻生长的抑制作用即达到99%。根据Sigmoidal Model (OriginPro 7. 5) (R2=l)函数处理实验结果，当海马齿提取物的浓度为0. 075g海马齿 叶干粉/106个中肋骨条藻细胞，其抑制率即可达到50%。
二、 海马齿茎提取物对中肋骨条藻的抑制作用
取15g海马齿茎的干粉末，加100ml无菌水在常温黑暗中浸提24h，每次用超声 波萃取l h，重复3次。然后在4000 g下离心10 min，收集上清液并经0. 22 y m混 合纤维滤膜过滤，滤液保存在4"C，作为母液备用。
以f/2培养液为基本培养液，调盐度、pH分别至30和8.0，高温灭菌后，加入 海马齿茎提取物母液，以茎干粉计，每升培养液中分别含有O g (CK) 、 0.5 g、 3 g、 6 g海马齿茎干粉。接入处于指数生长期的中肋骨条藻，使其初始密度为5乂106细胞 /L，每个处理重复6次。培养8天，每天定时取样lml，测定中肋骨条藻密度。
中肋骨条藻密度见图13。结果表明随着海马齿茎提取物浓度的升高，对中肋骨 条藻生长的抑制作用增强。当海马齿茎提取物浓度为6gL—'时，对中肋骨条藻生长的 抑制率最高，为99.8%，其次为3 g L_1， 79.1%，再次为1 g L—'， 44.1%，最后为 0. 5gL—'，其抑制率为29. 1%。根据Sigmoidal Model (OriginPro 7. 5) (R2=0. 995)函数处理实验结果，当海马齿提取物浓度为0. 61g海马齿茎干粉/106个中肋骨条藻细 胞时，其抑制率达到50%。
三、海马齿根提取物对中肋骨条藻的抑制作用
取15g海马齿根的干粉末，加100ml无菌水在常温黑暗中浸提24h，每次用超声 波萃取l h，重复3次。然后在4000 g下离心10 min，收集上清液并经0. 22 yra混 合纤维滤膜过滤，滤液保存在4'C，作为母液备用。
以f/2培养液为基本培养液，调盐度、pH分别至30和8.0，高温灭菌后，加入 海马齿根提取物母液，以根干粉计，每升培养液中分别含有O g (CK) 、 0.5 g、 3 g、 6 g海马齿根干粉。接入处于指数生长期的中肋骨条藻，使其初始密度为2Xl(/细胞 /L，每个处理重复6次。培养8天，每天定时取样lml，测定中肋骨条藻密度。
中肋骨条藻密度见图14。结果表明当海马齿根提取物浓度较低时，对中肋骨条 藻的抑制作用不明显，当海马齿根提取物的浓度升高时，对中肋骨条藻的生长具有一 定的抑制作用，在海马齿根提取物浓度为6gL—'时，对中肋骨条藻生长的抑制作用达 到最大，为28%。根据Sigmoidal Model (OriginPro 7. 5) (R2=0. 960)函数处理实验 结果，若要使对中肋骨条藻的抑制率达到50%，海马齿根提取物的浓度至少应为6g 海马齿根干粉/106个中肋骨条藻细胞。
权利要求
1、海马齿及其提取物在修复富营养化水体中的应用。
2、 海马齿及其提取物在抑制赤潮中的应用。
3、 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述赤潮是由中肋骨条藻引起的。
4、 海马齿及其提取物在抑制中肋骨条藻生长中的应用。
5、 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用中，海马齿的用量至少为l株海马齿/106个中肋骨条藻细胞。
6、 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述提取物为海马齿干粉的水提物。
7、 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述海马齿干粉为海马齿叶干粉、海马齿茎干粉和海马齿根干粉中的至少一种。
8、 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述海马齿干粉为海马齿叶干粉，以海马齿叶干粉计，所述应用中，海马齿提取物的用量至少为0.075g海马齿叶干粉 /106个中肋骨条藻细胞。
9、 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述海马齿干粉为海马齿茎干粉，以海马齿茎干粉计，所述应用中，海马齿提取物的用量至少为0. 61g海马齿茎干粉/106 个中肋骨条藻细胞。
10、 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述海马齿干粉为海马齿根干粉， 以海马齿根干粉计，所述应用中，海马齿提取物的用量至少为6g海马齿根干粉/106 个中肋骨条藻细胞。
全文摘要
本发明公开了一种海马齿及其提取物的新用途。本发明提供了海马齿及其提取物在修复富营养化水体、抑制赤潮和抑制中肋骨条藻生长中的应用。海马齿低密度种植时，延迟中肋骨条藻进入指数生长期；中密度时，降低中肋骨条藻细胞生长率和最大种群密度；高密度时，直接杀死中肋骨条藻细胞，使其无法进入指数生长期。海马齿根、茎、叶干粉的水提物均能抑制中肋骨条藻生长，降低生长速率和种群的最大密度，随着提取物浓度升高，抑制作用增强；自强至弱为叶、茎、根。海马齿可通过生物量的增加积累氮磷营养盐，降低水体富营养化程度和赤潮发生频率。海马齿是高经济价值的海水蔬菜，可广泛应用于近海海域富营养化污染和赤潮的治理，具很高的生态经济及社会价值。
文档编号A01N65/08GK101416649SQ200810239400
公开日2009年4月29日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者丹 姜, 张志英, 李银心, 林施泉, 董美艳, 黄凌风 申请人:中国科学院植物研究所