专利名称：一种荧光假单胞菌及其在促进杨树生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种杨树根际高效解 磷的荧光假单胞菌及其在促进杨树生长中的应用。
背景技术：
磷是限制植物生长发育的必需大量矿质营养元素之一，但土壤中95%以上的磷素 与土壤中Ca^、 Fe2+、 Fe3+、 A^等金属离子结合而丧失植物有效性。施入土壤中的可溶 性磷肥大部分很快发生专性吸附和化学沉淀而被固定，当季利用率只有5%~10%，加上 作物的后效，利用率一般不超出25%，大部分磷肥以难溶性的磷酸盐在土壤中积累起来， 植物难以吸收利用；另一方面，大量施用磷肥既耗竭有限的磷矿资源又加剧环境的富营 养化，造成一系列的能源危机和环境污染等问题。因此，通过生物技术途径来解决这一 问题越来越为人们所接受。
研究表明，土壤中存在大量的解磷微生物，它们能将土壤中的难溶性磷酸盐转化为 植物可吸收利用的有效形态。这些微生物主要是在代谢过程中产生有机酸，通过降低土 壤环境的pH值以及有机酸阴离子的络合作用促进磷的释放。接种解磷微生物提高土壤 难溶性磷的植物有效性和磷肥利用率一直备受关注。与真菌、放线菌相比，植物根际细 菌被认为是最有效的解磷微生物，它们能高效的释放出土壤中难溶性磷酸盐，供植物吸 收利用。但通常该类微生物在植物根际的数量不足以和其它微生物竞争，难以有效的发 挥作用。因此，有必要在自然条件下，从特定植物的根面、根际土壤中筛选与该植物亲 和性好、高效的解磷细菌，制成菌剂后回接到土壤中以促进植物的生长。国内外不少文 献指出，向土壤或作物根系接种解磷菌，能够促进小麦、青菜、玉米、莜麦、甘蓝、花 生、油菜、柱花草、苜蓿等的产量。但目前尚未见在多年生作物接种解磷微生物的研究 报道。
杨树是世界中纬度平原地区栽培面积最大、木材产量最高的速生用材树种之一，是 短轮伐期工业用材林的重要经营树种，也是我国农林生态系统的重要组成树种。杨树因 生长快，轮伐期短且频，对土壤养分消耗大，易出现地力衰退现象。其中，磷素供应不 足是突出而具普遍性的问题，造成我国大部分地区的杨树生长不良，抗逆下降。杨树根 际高效解磷细菌能够提高土壤中难溶性磷的植物有效性和磷肥利用率，改善杨树人工林 生产中的磷素供应不足的矛盾、促进杨树生长发育。目前，有关杨树根际高效解磷细菌 的筛选及应用研究未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杨树根际高效溶解难溶性无机磷的荧光假 单胞菌；
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述荧光假单胞菌在促进杨树生长中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
从江苏省宿迁市泗洪县陈圩林场2年生351杨根际土壤中，筛选获得了一株高效解 磷的荧光假单胞菌(i^mfomomw ^wowsce朋)JW-JS1。已保藏于中国典型培养物保藏 中心CCTCC，保藏编号M209027，保藏日期2009年2月18日。
JW-JS1菌株主要生物学特征在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，颜色浅 黄，圆形、边缘整齐；菌体直杆状，革兰氏染色阴性，大小约0.45x0.74^im 1.91x2.06nm， 无芽孢，极生一根或三根鞭毛；好氧，氧化酶反应阴性，接触酶试验阳性，淀粉水解试 验阴性，发酵葡萄糖，M.R.与V.P.试验阴性，明胶水解试验阳性，硝酸还原试验阴性， 产氨和硫化氢试验阴性，柠檬酸盐生长试验阳性；在King's B(蛋白胨20g、甘油10g、 磷酸氢二钾1.5g、硫酸镁1.5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、 pH7.2)平板培养24h后，菌 落周围产生可扩散的青色素，在366 nm波长紫外光下菌落发绿色荧光，菌落周围显示 青到蓝色；菌体在荧光显微镜下自发荧光。
JW-JS1菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.l所示。
将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明， JW-JS1菌株与假单胞菌属(i^Womo"os)同源性都很高，其中与Py7t/omsce朋的相似 度为98%。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为荧光假单胞菌
JW-JS1菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂明显促进了杨树的生长发育。 有益效果JW-JS1菌株在液体摇培的情况下，对磷酸三钙(Ca3(P04)3)和羟基磷 灰石(CMP04)6(OH)2)具有较强的溶解效果，与对照(CK)相比，差异显著；JW-JS1 制成菌剂接种NL-895杨扦插苗和美洲黑杨实生苗，结果表明，该菌剂明显促进杨树苗 的生长发育。因此，本发明为开发杨树专用解磷细菌肥料提供了优良的菌株资源。
荧光假单胞菌(尸w^fowomwy Moresce M) JW-JS1已保藏于中国典型培养物保藏中 心CCTCC，保藏编号M209027，保藏日期2009年2月18日。 图1为JW-JS1菌株对磷酸三钙和羟基磷灰石的溶解能力。图2为接种JW-JS1菌剂美洲黑杨实生苗生长情况。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例l: J\V-JS1解磷能力试验
解磷培养基A:葡萄糖10g， Ca3(P04)3 5g， MgCL2 5g， KCL 0.2g， MgS04.7H20 0.25g， (NH4)2SO40.1g，蒸馏水lOOOmL ， pH7.0。
解磷培养基B:用Can)(P04)6(OH)2代替解磷培养基A中的Ca3(P04)3，其它成分和
含量相同。
将活化的JW-JSl菌株接种NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏 水1000mL， pH7.2~7.4)中，3(TC振荡培养18~24h制成种子液，取0.5ml种子液分别 接种于含50mL解磷培养基A和50mL解磷培养基B的lOOmL三角瓶中，以接相同体 积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理3个重复，30°C， 180r/min振荡培 养72h后，发酵液4'C， 10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液有效磷含量 (见图1)。
从图l中可看出，以Ca3(P04)3为唯一磷源时，发酵液有效磷含量达669.56mg丄—1， 是对照(CK)的18.61倍；以Caw(P04)6(OH)2为唯一磷源时，发酵液有效磷含量为546.24 mg.1/1，是对照(CK)的113倍。综上表明，JW-JS1菌株对磷酸三钙和羟基磷灰石具 有较强的溶解能力。
实施例2: JW-JS1最适解磷条件试验
以NBRIP (国际植物研究所磷酸盐生长培养基，配方同解磷培养基A)为基本培养 基，改变C源、N源、不同C/N和环境条件。结果表明，最适解磷条件为，100mL三 角瓶中，以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源，C/N为80/1-100/1，装液量20 30mL、初始 pH值7.0-7.2、接种量3%~4%、温度28。C 30。C。
实施例3: JW-JS1温室盆栽试验
将JW-JS1活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50mLNB培养基(牛肉膏3g， 蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL， pH 7.2~7.4)的100mL三角瓶中，29°C ， 180r/min 振荡培养72h。发酵液(4°C， 6000r/min)离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体2 3次 后，用无菌生理盐水调节菌悬液(7~8xl08cfii/mL)制成菌剂。分别接种NL-895扦插苗
5和美洲黑杨实生苗(苗龄60天)，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为扦插苗15mL/ 株、实生苗5mL/株。每处理6个重复，置于温室统一管理，光照为12h/天，适时浇水。 NL-895杨扦插苗150天生长情况(见表1)。从表1可看出，接种JW-JS1菌剂对 NL-895盆栽扦插苗的具有明显的促生作用。接种处理使NL-895杨的苗高、茎粗、鲜重 和干重比对照有不同程度的增加。其中，苗高和茎粗比对照分别增加了 21.96%和5.04 %;鲜重和干重比对照分别增加了 57.33%和54.36%。
表1 JW-JS1对NL-895杨扦插苗的生长及生物量
处理苗高(cm)增长率 (%)茎粗(mm)增长率 (%)鲜重(g)增长率 (%)干重(g)增长率 (%)
JW-JS178.57土6.11b21.967.29士0.30b5.0457.33土3.12b57.8322.21士2.13b54.36
CK64.42士4.09a—6.94士0.28a—36.32士1.02a14.39±0.69a—
注P<0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著
美洲黑杨实生苗90天生长情况(见表2及图2)。从表2可看出，接种JW-JS1菌 剂对美洲黒杨盆栽实生苗的具有明显的促生作用。接种处理使美洲黒杨实生苗的苗高、 地径、鲜重和干重比对照有不同程度的增加。其中，苗高和地径比对照分别增加了 51.66 %和1.98%;鲜重和干重比对照分别增加了 150.18%和168.49%。
表2 JW-JS1对美洲黑杨实生苗的生长及生物量
处理苗高(cm)增长率 (%)地径(mm)增长率 (%)鲜重(g)增长率 (%)干重(g)增长率 (%)
JW-JS152.37士2.11b51.664.80士0.13b1.9820.59士0.50b150.187.87士0.42b168.49
CK34.53土0.76a一4.71士0.18a一8.23±0.34a一2.92i0.22a—
注P<0.05,同列不同行小写字母不相同代表差异显著
6SEQUENCE LISTING
〈110〉南京林业大学
<120〉 一种荧光假单胞菌及其在促进杨树生长中的应用
<130> njfu090122
<160〉 1
<17t)> Patentln version 3. 3
〈210〉 1
<211> 1323
〈212〉 ■
<213> Pseudomonas fluoresceins
<400> 1
acacatgcaa gtcgagcggc agcacgggta cttgtacctg gtggcgagcg gcggacgggt 60
gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggataacg ctcggaaacg gacgctaata 120
ccgcatacgt cctacgggag aaagccaggg gaaccttcgg gccttgcgct atcagatgag 180
cctaggtcgg attagctagt tggtggaggt aatggctcac caaggcgacg attccgtaac 240
tggtctgaga ggatgatcca gtcacactgg aactgaggac acggtccaga ctcctacggg 300
鄉cagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgaaagcctg atccagccat gccgcgtgtg 360tg朋gaaggt cttcggattg taaagcactt taagttggga ggaagggcag ttacctaata 420
cgtaattgtt ttgacgttac cgacagaata agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacag agggtgc犯g cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc gcgtaggtgg 540
tttgttaagt tggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcattc aaaactgaca 600
agctagagta tggtagaggg tggtggaatt tcctgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 660
ggaaggaaca ccagtggcga aggcgaccac ctggactgat actgacactg aggtgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcaacta 780
gccgttggga gccttgagct cttagtggcg cagctaacgc attaagttga ccgcctgggg 840
agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcac犯gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg ccttgacatc caatgaactt 恥O
tccagagatg gattggtgcc ttcgggaaca ttgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacggagc gcaacccttg tccttagtta 1080
ccagcacgta atggtgggca ctctaaggag actgccgtgt gacaaaccgg aggaetggtgg 1140
ggatgaacgt caaggtctat caatggccct tacggctctg ggctacaceic gtgctacaat 1200
ggtcggtaca gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tcccacaaaa ccgatcgtag 1260
tccggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca 1320
gaa 1323
8
权利要求
1、一种荧光假单胞菌，其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)JW-JS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号M 209027，保藏日期2009年2月18日。
2、 权利要求l所述的荧光假单胞菌在促进杨树生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种分离自杨树根际土壤、高效溶解难溶性无机磷的荧光假单胞菌，其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)JW-JS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号M 209027，保藏日期2009年2月18日。本发明还公开了上述荧光假单胞菌在促进杨树生长中的应用。JW-JS1菌株在液体摇培的情况下，对磷酸三钙和羟基磷灰石具有较强溶解效果；JW-JS1菌剂接种NL-895杨扦插苗和美洲黑杨实生苗。结果表明，该菌剂能明显促进杨树苗的生长。因此，本发明为开发杨树专用解磷细菌肥料提供了优良的菌株资源。
文档编号C05F11/08GK101575583SQ20091002588
公开日2009年11月11日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者辉 刘, 叶建仁, 吴小芹 申请人:南京林业大学