专利名称：一种文蛤快速生长品系的育种方法
技术领域：
本发明涉及一种海水养殖贝类的制种技术，具体讲是利用文蛤不同地理群体间存 在的表型和遗传差异，通过杂交提高群体的遗传多样性，获得养殖生产上生长速度较快的 文蛤新品系。
背景技术：
杂交育种是遗传改良和新品种培育的有效手段，不仅可以综合双亲的优良性状、 增加变异性，还有可能产生超越双亲的杂种优势。在贝类方面，已有不少种间杂交成功的 先例，如黄海水产研究所的燕敬平等(1999)获得的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai) 与日本盘鲍(Haliotis discus discus)的杂交子代在成活率、生长速度等方面表现出 了明显的杂种优势；中国海洋大学的孙长森等(2007)发现栉孔扇贝与华贵栉孔扇贝 (Chlamysnobilis)的杂交子代幼虫比亲本具有更强的生长优势。虽然贝类种间杂交可以产 生更大的遗传变异，但常出现杂交不亲和、幼体不成活、杂种Fl代不育或育性差和“疯狂” 分离等“远缘杂交综合征”，影响了推广应用。地理种群间的“远距离杂交”，既可克服杂种后代的生殖和发育障碍，也能获得一 定的杂种优势。目前，国内已有利用地理群体杂交的制种方法获得多种贝类的快速生长 品系的报道，如中国科学院海洋研究所的张国范等(2004)开展了皱纹盘鲍中国群体和日 本群体杂交的研究；刘小林等(2003)研究了栉孔扇贝中国种群和日本种群杂交一代的早 期生长情况；厦门大学的柯才焕等(2005)进行了杂色鲍(Haliotis diversicolor)日本 群体与台湾群体杂交研究；上海水产大学的李家乐等(2007)开展了三角帆蛘(Hyriopsis cumingii)三个地理种群的杂交研究。文蛤是我国重要的滩涂经济贝类，近年来人工养殖生产上出现了抗逆能力下降、 生长速度放慢、性成熟个体小型化等性状退化现象，需要通过一定的育种手段，获得抗性 强、生长快的文蛤新品种。但迄今为止，还没有利用文蛤不同地理群体的表型性状和遗传背 景差异而通过杂交、杂种优势利用方法培育出生长快速的新品种(系)的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种文蛤快速生长品系的育种方法，它利用地 理群体间的杂交方法，获得具有杂交优势的杂交组合群体，为培育出具有生长快、抗性强等 优良性状的文蛤新品种提供育种材料。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种文蛤快速生长品系的育种方 法，其通过地理群体间杂交的方式获得的有杂交优势的子一代，然后以杂交子一代中生长 快的个体为基础群，经连续多代的表型选择育种，培育生长快速的文蛤新品系，其特征在于 亲本选择是山东群体为母本、江苏群体为父本。具体操作步骤为(1)亲本选择文蛤亲贝分别采自山东东营和江苏如东海区，随机取样壳高4 7cm的3 4龄个体，个体数均在100个以上；(2)促熟将亲贝置于铺沙的水泥池内，通过逐渐升温和投喂足量活体饵料强化 营养的方法促熟；(3)催产与精卵采集采用阴干、流水刺激和升温结合的方法催产，然后将文蛤单 个放入IL的烧杯中产卵和排精，严防精子污染；(4)杂交授精通过显微镜检测获得高质量的山东群体的未受精卵和活力强的江 苏群体的精液，以群交的方式进行人工授精，受精卵在600L的塑料缸中孵化；(5)生长对比设置山东自繁群体、江苏自繁群体、山东群体为父本与江苏群体母 本杂交组合为对照，测量活体重、壳长、壳高、壳宽等参数，利用Excel、SPSS等统计软件分 析杂交群体与自繁群体的差异，评价山东群体为母本(早)X江苏群体为父本( )杂交 Fl代的杂交优势。步骤(1)亲本选择，母本来自山东东营沿海自然群体、父本来自江苏如东沿海自 然群体，壳高4cm以上、3-4龄、健壮无损伤个体。步骤(2)中混合投喂的各种人工培养的新鲜单胞藻可以包括金藻、扁藻、硅藻、小 球藻、角毛藻。步骤(4)中使用的混合精液应来自30个以上雄贝。与现有技术相比，本发明的优点在于它通过亲本的选择，利用地理群体间的杂交 方法，获得具有杂交优势的杂交组合群体，为培育出生长快、个体大、抗性强的优良文蛤新 品种提供材料，本发明操作简便，适用于规模化生产，培育出的文蛤快速生长品系与普通生 产用贝相比，生长速度提高20%以上，这对提高文蛤养殖产量和效益有重要意义。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。一种培育文蛤快速生长品系的育种方法，它利用地理群体间的杂交方法，获得具 有杂交优势的杂交组合群体，为培育出生长快、个体大、抗性强的优良文蛤新品系提供材 料。亲本选择是最重要的环节山东群体为母本、江苏群体为父本。本发明按以下操作技术流程来完成在文蛤育种过程中，解决亲贝培育、催产、精 卵采集、杂交受精、生长对比等技术环节。亲贝培育与催产技术亲贝培育的成功与否直接关系到精、卵质量的高低，继而会 影响后代的生长情况。应使亲贝暂养、人工促熟的总积温达到1900°C以上，以获得充分成熟 的卵子。采取方法适合、强度适宜的催产技术，以获得高质量的精卵。精卵采集与杂交受精技术由于文蛤精、卵排放之前难以鉴别雌雄，所以要获得不 受交叉污染的精、卵是进行杂交受精的前提条件。在进行群体杂交受精中，应考虑精、卵的 质量和受精的个体数。周年生长对比与杂交优势评价通过周年生长对比试验，采集杂交群体和对照组 的可量性状参数，采用数理分析软件评价杂交优势情况。实验组合各群体的遗传结构分析采用fAFLP分子标记技术对4个群体的遗传结 构进行分析，比较与亲本的差异。
具体实施方式
(1)亲贝培育与催产2006年5月10日，从山东东营、江苏如东文蛤产区采集文蛤，分别称为山东群体 (S)和江苏群体(J)，挑选健康无病、无伤损、壳色有光泽，壳高4 7cm的3-4龄文蛤各100 枚，作为亲贝。将亲贝置于铺有IOcm左右细沙的水泥池内，通过逐渐升温和投喂足量活体 饵料强化营养的方法进行促熟。具体升温办法是以升温前水温为起始温度，其后每隔1天 升温0.5°C，当水温到达26°C时保持恒定，以调节其性腺同步发育。饵料以投喂足量的金 藻、扁藻、角毛藻等混合饵料为主，保证营养的充足和全面。采用阴干、流水刺激和升温结合 的方法催产，将亲贝在夜间阴干10个小时，流水刺激1个小时，然后单个放入乘有过滤海水 IL的烧杯中产卵和排精，水温比自然海水高2 ；TC。(2)精卵采集与杂交授精2006年7月18日，对性腺发育成熟的亲贝进行催产。催产采用阴干和流水刺激结 合的方法亲贝阴干12个小时后流水刺激1个小时，然后为防止意外受精，将单个文蛤放入 IL的烧杯中产卵和排精。1小时后亲贝均先后产卵和排精，分别收集卵子和精液。按照完 全双列设计，文蛤山东群体(S)和江苏群体(J)的雌雄亲贝配成两个群体间杂交组合和两 个群体内自繁组合，及时完成各实验组合的人工授精，镜检每个卵子周围黏附5-10个精子 为宜。由此获得2个群体间杂交组合和2个群体内自繁组合。(3)幼虫和稚贝培育每个实验组设4个平行组，自然水温(27_29°C )培育。受精后大约14小时，各组合 受精卵发育到D形幼虫期。用300目的筛绢滤出D形幼虫，将其大致定量后，分别转入80L 的塑料中进行幼虫培养，控制密度为5个/mL左右。培育期间保持连续微量充气供氧，自然 水温(27-29°C )，投喂适量的等边金藻或角毛藻，饵料密度控制在2万个/ml，投饵频率为每 8hl次。每天用砂滤海水100%换水1次，浮游期每日换水后用高锰酸钾消毒培育容器。当 幼虫生长到180 μ m时，投用高锰酸钾消毒过的细砂(过80目筛)作为附着基。6天左右， 幼虫壳长约200 μ m时，开始变态附着。稚贝培育期间随着个体生长，每天适当增加投喂饵料量，饵料以金藻、角毛藻、扁 藻混合投喂。从稚贝壳长Imm以后，定期进行疏苗培养，具体措施如下第一次分苗9月18日，各实验组合随机选取5万颗稚贝放入IOm2的水泥池中培 育，每10天测量大小一次(多点随机取样100颗稚贝)。第二次分苗10月28日，各实验组随机选取1万颗稚贝放入IOm2的水泥池中培 育，每10天测量大小一次(多点随机取样100颗稚贝)。第三次分苗2007年1月18日，各实验组随机选取4千颗稚贝放入IOm2的水泥池 中培育。以后每隔30天测量大小一次(多点随机取样100颗稚贝)。(4)周年生长对比与杂交优势评价设置山东自繁群体和江苏自繁群体为对照，在显微镜下通过测微尺测量或用数显 游标卡尺测量获得壳长、壳高、壳宽参数，用电子分析天平获得活体重数据，每月测量一次， 得到一周年的数据；利用Excel、SPSS等统计软件分析杂交群体与自繁群体的差异，发现山 东群体(早)X江苏群体(3)杂交Fl代群体表现出较大的杂交优势。表1.文蛤不同地理群体自繁及杂交组合Fl早期(1-12月龄)生长发育杂种优势 比较
壳高10. 13±3.81Λ11.42±2.88b31.710.25 ±2. 84"18..27. 21 ±3. 35°士 As 冗宽5.52 +1. 24'b6.34 ±1.65b31.85.21 ±1.8°8.34. 10 ±1.92°体重0. 66 ±0. 47-0. 82 ±0. 57"65.70. 53 ±0. 49"7.10. 33 ±0. 58°壳长13. 23±3. 87a14. 44±4. 21b27.213,.09 ±4. 35'14.59. 04 士 4. 14。壳高12. 34士3. 24a13. 46±3.47b22.012..18±3. IT14.38. 98±3. 47°壳宽6. 74± 1.95a7.47 ±2. 17b30.66.78 ±2.43°18.54. 7±2. 06e体重0. 91±0. 75a1. 24±0. 97b85. 10.83 ±0. 70a23.90. 43 ±0. 69°壳长15. 80 士 4. 46"16. 55 ±4. 78"25.415.,01 ±4. 93"13.810. 59±4. 53b壳高13. 65 ±3. 76'14. 59±3.84a26.612.,58±4. 12"9.29. 39±3. 77"士 Cto 冗宽7. 65 ±2. 14*8. 10±2. 35'28.77.05 ±2. 36"12.04. 94 ±2. 26"体重1.26 + 0. 92°1. 54±1. 15"761.12 ±0. 85a280. 49 ±0. 79"注右上角字母相同的表示差异不显著由表1可见，在第2月各实验组的壳长、壳高差异显著，多重比较分析显示S$xSc 组合的稚贝明显大于其他3个组，而J xJc 组合的生长速度最慢，且与其他3个组合的差异 程度均达显著水平。总的表现为8 χ8(^〉8 χ^〉·Ι$χ8( >·Γ χ^。其后2个杂交组合的 生长速度开始加快，至3月龄时与组合接近，多重比较也表明这3个实验组之间无显 著差异，但与J ΧJd组合的稚贝大小的差距进一步拉开。从第3个月开始2个杂交组合在各 个性状上表现出一定的杂交优势，其范围在6-168%之间；第6个月开始各性状在数值上主 要表现为{？^^^？⑶^^权⑶汐^？^^，统计分析表明这4个实验组合各分析性状 大多无显著差异。不同性状的杂交优势有明显的差别，其中活体重的杂种优势远大于其他 3个性状，而后3者之间的差别比较小，各性状的杂种优势的平均值表现为活体重85. 6% >壳宽 25. 8%>壳长 24. 壳高 22. 7%。(4)杂交Fl的遗传结构分析采用fAFLP分子标记技术对杂交F1的遗传结构分析结果分别见表2、表3。从表2可见两杂交群体的遗传多样性接近母本而又比母本稍高，这一方面说明杂 交后代遗传结构偏向母本，也说明经过杂交增加了群体的遗传多样性；从表3可见，SJ与JS 群体间的遗传距离最大，说明地理群体间杂交使文蛤群体的遗传结构变异增加，这对杂交 优势的产生十分有利。分析结果表明，杂交后代接受父、母亲本的遗传物质并非均等，而以 偏母本的方式遗传，S早XJ $与J早XS $间的遗传距离最大，可见地理群体间杂交使文 蛤群体的遗传结构变异增加，杂交后代的遗传多样性水平与生长性状有时表现相一致。表2. 4个F1代群体的多态位点比例、Nei (1973)基因多样性和香侬信息指数
群体扩增位点数多态位点数多态微点比例Nei基因多样性Shannon信息指数JJ25324797.63%0.3022 士 0.14720.4632 ±0.1872SS24924995.18%0.3288 ±0.14270.4948 ±0.1843S$xJc 24222693.39%0.3407 ±0.15930.5038 ± 0.2096J xS( 24223597.11%0.3085 ±0.15510.4682 ± 0.2000 表3. 4个群体的群体间遗传相似性系数和相对遗传距离
权利要求
一种文蛤快速生长品系的育种方法，其通过地理群体间杂交的方式获得的有杂交优势的子一代，然后以杂交子一代中生长快的个体为基础群，经连续多代的表型选择育种，培育生长快速的文蛤新品系，其特征在于亲本选择是山东群体为母本、江苏群体为父本。
2.照权利要求1所述的选育方法，其特征在于所述的杂交其步骤依次为(1)亲本选择文蛤亲贝分别采自山东东营和江苏的东海区，随机取样壳高4 7cm的 3 4龄个体，个体数均在100个以上；(2)促熟将亲贝置于铺沙的水泥池内，通过逐渐升温和投喂足量活体饵料强化营养 的方法促熟；(3)催产与精卵采集采用阴干、流水刺激和升温结合的方法催产，然后使文蛤单个进 行产卵和排精，严防精子污染；(4)杂交授精通过显微镜检测获得高质量的山东群体的未受精卵和活力强的江苏群 体的精液，以群交的方式进行人工授精，然后受精卵孵化；(5)生长对比设置山东自繁群体和江苏自繁群体、以及山东群体为父本与江苏群体 母本杂交组合为对照，测量活体重、壳长、壳高、壳宽参数，分析杂交群体与自繁群体的差 异，评价山东群体早X江苏群体 杂交Fl代的杂交优势。
3.按照权利要求2所述的选育方法，其特征在于步骤(1)亲本选择，母本来自山东 东营沿海自然群体、父本来自江苏如东沿海自然群体，壳高4cm以上、3-4龄、健壮无损伤个 体。
4.按照权利要求2所述的选育方法，其特征在于步骤(2)中混合投喂的各种人工培 养的新鲜单胞藻包括金藻、扁藻、硅藻、小球藻、角毛藻。
5.按照权利要求2所述的选育方法，其特征在于步骤(4)中使用的混合精液应来自 30个以上雄贝。
6.按照权利要求2所述的选育方法，其特征在于步骤(5)中是利用Excel、SPSS统计 软件分析杂交群体与自繁群体的差异。
全文摘要
一种文蛤快速生长品系的育种方法，主要应用不同地理群体文蛤杂交结合选择育种的制种策略。首先用文蛤山东群体雌贝与江苏群体雄贝进行杂交，获得有生长快杂交优势的杂交子一代群体；以杂交子一代中生长快的个体为基础群，进行表型连续多代的选择育种，培育出文蛤快速生长品系，本发明操作简便，适用于规模化生产，培育出的文蛤快速生长品系与普通生产用贝相比，生长速度提高20％以上，这为文蛤养殖产量的提高有重要意义。
文档编号A01K61/00GK101926293SQ200910100159
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者刘保忠, 张炯明, 林志华, 柴雪良, 肖国强, 董迎辉 申请人:浙江万里学院