专利名称：：一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法
技术领域：
：本发明涉及卵母细胞体外筛选技术，采用亮甲酚蓝(BCB)染色液对绵羊卵母细胞进行染色筛选，可提高卵母细胞体外受精率及胚胎体外发育率。
背景技术：
：卵母细胞体外筛选，通常采用直观评定法，即根据显微镜下观察的卵丘细胞_卵母细胞复合体形态和细胞质均匀度进行分类。A级三层以上致密卵丘细胞，细胞质均匀；B级一至三层较致密卵丘细胞，细胞质较均匀；C级局部有卵丘细胞，细胞质不均匀；D级裸卵；E级卵丘细胞扩散。通常将A、B级用于成熟培养，但这种方法主观性强，不同人员判断间有差异，培养后的成熟率也不一致。文献检索披露l.Theriogenology,68(2007)1299-1304作者B.M.Manjunatha等，发表的《成熟前用亮甲酚蓝选择有发育潜力的水牛卵母细胞》文章内容是，将卵母细胞置于BCB染色液90分钟，比较了不同浓度BCB对卵母细胞的选择率；比较了经过选择的阴阳性卵母细胞直径的差别；比较了不同实验组(对照组，空白组，阳性组，阴性组)成熟率，囊胚率，结果阳性组高于其他组。2.Theriogenology,63(2005)2194-2205，作者H.Alm等发表的《成熟前用可以检测G6PDH活性的亮甲酚蓝选择卵母细胞对牛体外囊胚发育率的影响》文章内容是，检测了经过BCB染色的阴、阳性卵母细胞在G6PDH活性上的差别，阴性组G6PDH活性高于阳性组和实验组。但阳性组体外成熟率、囊胚率高于其他组。3.Theriogenology,57(2002)1397-1409，作者E.Rodriguez-Gonzalez等发表的《用亮甲酚蓝选择羔山羊卵母细胞》文章内容是，研究了不同浓度BCB染色液对羔山羊卵母细胞的选择，比较经过选择后的卵母细胞的体外受精率和成熟率，发现26iiM浓度的染色液适合羔山羊卵母细胞的选择。经过选择后的阳性卵母细胞在细胞直径，体外发育率等方面都显著高于阴性卵母细胞。4.Theriogenology,61(2004)735-744，作者MarcPujol等发表的《通过亮甲酚蓝(BCB)选择具有发育潜力的小母牛卵母细胞》文章内容是，研究了BCB染色液在用于体外胚胎生产的小母牛卵母细胞上的选择作用。比较了阳性卵母细胞与对照组以及成年母牛之间发育潜力、卵母细胞直径差异，结果表明不同等级卵母细胞选择率不同，阳性卵母细胞直径大于阴性卵母细胞，阳性胚胎囊胚发育率高于阴性组和对照组，但低于成年母牛组。国内有关中国农业科学院北京畜牧兽医研究所乔利敏等8人发表的《亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟及体外受精的影响》也将亮甲酚蓝染色液用于牛卵母细胞的筛选等。上述已有技术很少见到，亮甲酚蓝染色液在绵羊卵母细胞上的应用，本发明以此为切入点，展开的方法学与应用学的研究，更具有实践意义。
发明内容本发明的目的在于提供绵羊卵母细胞体外筛选培养的方法，即采用亮甲酚蓝(BCB)染色液筛选方法，目的是提高体外受精率及胚胎发育率。本发明目的是这样实现的一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，分为亮3甲酚蓝染色筛选及培养的步骤；其一，摘取宰杀后半小时内的绵羊卵巢，置入温度30-4(TC，含lOOOIU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其清洗3-4次，在显微镜下捡出卵母细胞；添加浓度为25-30iiMol/L的亮甲酚蓝，置于35-39t:水浴中染色85-92分钟，待细胞质呈蓝色时，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴，放入前2小时平衡好的体积为55-78y1/滴的体外成熟培养液中，放入C02箱，在5%0)2、95%的空气条件下培养；其二，将体外成熟25-28小时的卵母细胞取出，用0.1%的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70iil的受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2小时平衡好的装有受精液的试管，放入C02箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液；将剩余的精子沉淀，按2-4X106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；其三，将受精12-18小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500y1/孔的四孔培养板内培养，即完成体外受精筛选及培养。所述的筛选培养方法，试剂的配制吸卵液TCM199-h印es十lmg/mlPVA十0.7mg/ml肝素钠；亮甲酚蓝染色液PBS+26iiMol/L亮甲酚蓝+5mg/mlBSA;成熟液TCM199-HC03十10%FBS十0.05IU/mlFSH十0.05IU/mlLH十1iig/mlestradiol+24.2iig/ml丙酮酸钠+0.ImM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml双抗；SOF:6.29mg/mlNaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2P04+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL22H20;受精液S0F+20X发情羊血清(自制)+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；培养液S0F+3mg/mlBSA。所述的筛选培养方法，在抽取卵母细胞前，先吸入1-1.5毫升吸卵液备用。所述的筛选培养方法，筛选卵母细胞，细胞质着蓝色为阳性组(BCB+)，不着蓝色的为阴性组(BCB-)。所述的筛选培养方法，采羊的静脉血，放置4t:冰箱内冷却24小时，将析出的血清，在56t:水浴锅内灭活30-33分钟，即得发情羊血清。所述的筛选培养方法，药品的原料选用，除发情羊血清外，均为市售产品。本发明的构思的卵母细胞的体外成熟，其关键性环节在于选择细胞核成熟、细胞质成熟趋于一致的卵母细胞，细胞核成熟以生发泡破裂(GVBD)为标志，而细胞质成熟不仅有细胞器超微结构的变化，而且还发生了诸多、渐变的细胞质内部的生理生化变化.缺乏直观标记，所以其成熟鉴定比较困难。以往的研究中，主要通过卵丘细胞与卵母细胞细胞质形态对其加以分级，从而筛选出细胞核与细胞质成熟较为一致的卵母细胞进行体外培养。通过形态学角度对卵母细胞加以分级，简便易行，虽然成熟培养之后体外受精率可达到70-80%左右，但在受精卵后期发育中，其囊胚率却显著降低，提示我们这一鉴定标准仅能判别细胞核成熟效果，而并不能十分有效鉴定卵母细胞细胞质成熟效果。近年来研究表明，葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)在生长中的卵母细胞中表现为活性状态；而处于生长期之后的卵母细胞中，其G6PDH显著下降。G6PDH在整个卵母细胞发生过程中，均存在于卵母细胞中，它是磷酸戊糖途径(PPP)代谢的起始酶，为核苷酸生成提供必须的磷酸核糖，以及提供还原型辅酶II(NADPH)，NADPH在诸如脂肪酸形成的还原反应过程中，以氢和电子供体的形式被利用。G6PDH的缺乏将直接影响NADPH的生物合成。目前研究证明，亮甲酚蓝染色(BCB)可用于测定G6PDH活性，根据G6PDH活性的不同，BCB染色呈现不同程度的着色。同时BCB染色技术，选择合适的浓度，并不会对卵母细胞染色后的后期发育效果，如卵裂率、囊胚率产生影响。本发明选用全部卵母细胞，避免形态分级的影响，扩大应用范围。本发明选用26iiMol/L的亮甲酚蓝浓度，浓度低，筛选效率低，仅为30X左右，浓度高，对胚胎的后期发育有影响。在避光恒温水浴内染色，避免光照和温度对卵母细胞发育的影响。本发明在卵母细胞体外受精48小时后统计卵裂率，7天后统计囊胚率，验证其结果的有效性；①BCB浓度对BCB+卵母细胞体外成熟率，受精率的影响，见表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注同列不同字a-b差异极显著(P<0.01)。上表结果表明用26iiM浓度的BCB染色液筛选卵母细胞，成熟率、受精率显著高于52iiM的浓度，说明26iiM浓度适合绵羊卵母细胞的体外筛选。②经26iiM浓度BCB选择后的卵母细胞GSH含量的测定，见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注同列不同字母差异极显著(P<0.01)上表结果表明GSH即谷光甘肽，反映卵母细胞核成熟的指标之一，BCB+组的GSH含量明显高于BCB-组，说明BCB+组的卵母细胞的成熟度明显高于BCB-组。③经26iiM浓度BCB选择后的阴阳性卵母细胞卵裂率和囊胚率的比较，见表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上表结果表明经亮甲酚蓝染色筛选后的阳性卵母细胞卵裂率和囊胚率都高于对照组和阴性组。本发明构思与实现的采用亮甲酚蓝(BCB)染色液对绵羊卵母细胞进行染色筛选，使卵母细胞体外受精率及胚胎体外发育率大幅度的上升，彰显技术进步。图1为经过26iiMBCB染色后的阳性卵母细胞放大100倍微片。图2为经过26iiMBCB染色后的阴性卵母细胞放大100倍微片。图3为阳性卵母细胞体外成熟培养24小时后颗粒细胞充分扩展放大100倍微片。图4为阴性卵母细胞体外成熟培养24小时颗粒细胞没有扩展放大100倍微片。具体实施例方式下面结合实施例说明本发明的实施方式。羊的处理摘取宰杀半小时内的绵羊卵巢，置入温度3(TC，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其清洗3次，在显微镜下捡出卵母细胞，添加浓度为25iiMol/L的亮甲酚蓝，置于35t:水浴中染色80分钟，细胞质呈蓝色备用。在抽取卵母细胞前，需先吸入1.5毫升吸卵液备用。筛选卵母细胞，细胞质着蓝色为阳性组(BCB+)，不着蓝色的为阴性组(BCB-)。药液的配制吸卵液TCM199-h印es十lmg/mlPVA十0.7mg/ml肝素钠；亮甲酚蓝染色液PBS+26iiMol/L亮甲酚蓝+5mg/mlBSA;成熟液TCM199-HC03十10%FBS十0.05IU/mlFSH十0.05IU/mlLH十1iig/mlestradiol+24.2iig/ml丙酮酸钠+0.ImM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml双抗；SOF:6.29mg/mlNaCL+O.534mg/mlKCL+O.162mg/mlKH2P04+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL22H20;受精液S0F+20X发情羊血清(自制)+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；培养液S0F+3mg/mlBSA。发情羊血清的制备；采静脉羊血(发情)，放置4t:冰箱内冷却24小时，将析出的血清取出，在56t:水浴锅内灭活30分钟，即得。筛选培养操作将染色的卵母细胞，用体外成熟液洗涤3遍，按25枚/滴，放入前2小时平衡好的体积为70ii1/滴的体外成熟培养液中，放入C02箱，在5%0)2、95%的空气条件下培养；将体外成熟25小时的卵母细胞取出，用0.1X的透明质酸酶处理50s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤3遍，按25枚/滴的密度加入前2小时平衡好的70y1的受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2小时平衡好的装有受精液的试管，放人0)2箱，上游23分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4分钟弃去上清液；将剩余的精子沉淀，按3X106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；将受精15小时后的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤4遍，按60枚/孔的密度移入平衡好的5001/孔的四孔培养板内培养，即完成体外受精筛选及培养。权利要求一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，其特征在于分为亮甲酚蓝染色筛选及培养的步骤；其一，摘取宰杀后半小时内的绵羊卵巢，置入温度30-40℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其清洗3-4次，在显微镜下捡出卵母细胞；添加浓度为25-30μMol/L的亮甲酚蓝，置于35-39℃水浴中染色85-92分钟，待细胞质呈蓝色时，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴，放入前2小时平衡好的体积为55-78μl/滴的体外成熟培养液中，放入CO2箱，在5％CO2、95％的空气条件下培养；其二，将体外成熟25-28小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2小时平衡好的装有受精液的试管，放入CO2箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液；将剩余的精子沉淀，按2-4×106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；其三，将受精12-18小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养，即完成体外受精筛选及培养。2.按照权利要求1所述的筛选培养方法，其特征在于试剂的配制吸卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠；亮甲酚蓝染色液PBS+26iiMol/L亮甲酚蓝+5mg/mlBSA;成熟液TCM199_HC03+10%FBS+0.05IU/mlFSH+0.05IU/mlLH+1iig/mlestradiol+24.2iig/ml丙酮酸钠+0.ImM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml双抗；S0F:6.29mg/mlNaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2P04+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL22H20;受精液S0F+20X发情羊血清(自制)+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；培养液S0F+3mg/mlBSA。3.按照权利要求l所述的筛选培养方法，其特征在于在抽取卵母细胞前，先吸入l-1.5毫升吸卵液备用。4.按照权利要求l所述的筛选培养方法，其特征在于筛选卵母细胞，细胞质着蓝色为阳性组(BCB+)，不着蓝色的为阴性组(BCB-)。5.按照权利要求1所述的筛选培养方法，其特征在于采羊的静脉血，放置4t:冰箱内冷却24小时，将析出的血清，在56t:水浴锅内灭活30-33分钟，即得发情羊血清。6.按照权利要求1所述的筛选培养方法，其特征在于药品的原料选用，除发情羊血清外，均为市售产品。全文摘要本发明提供的一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，其一取宰杀半小时内的卵巢，置入温度30-40℃，含青霉素和链霉素的生理盐水中，3小时内清洗3-4次，捡出卵母细胞；用25-30μmol/L的亮甲酚蓝，置于35-39℃水浴中染色85-92分钟，细胞质呈蓝色，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴放入55-78μl/滴的体外成熟培养液中，在5％CO2、95％的条件下培养；其二将体外成熟25-28小时的卵母细胞脱去卵丘细胞；体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的入50-70μl的受精液滴内；解冻精液，移入受精液，离心4-5分钟弃去上清液，将沉淀的精子，按2-4×106个/ml的密度加入受精液滴，孵育；将受精12-18小时的卵取出，按上步方法处理移入四孔培养板内培养即可。其三所用试剂吸卵液、亮甲酚蓝成熟液、染色液SOF、受精液、培养液、羊血清的必备。文档编号A61D19/02GK101760444SQ20091011356公开日2010年6月30日申请日期2009年12月8日优先权日2009年12月8日发明者林嘉鹏,汪立芹,赵云程,陈童,黄俊成申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国—澳大利亚绵羊育种研究中心