专利名称：一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及木本植物组织培养技术领域
二背景技术：
马尾松原产我国，是秦岭以南各省重要的荒山绿化、造纸原料林和采脂林、自然风 景林的重要树种之一，是我国分布面积最广的树种。其生长迅速，生产力高，适应性强。力 学性质好等特点，也广泛被用于建筑、坑木、枕木、桥梁等工程，也可作为纤维板、刨花板、胶 合板工业的原料，具有重要的经济价值。目前马尾松良种主要以种子园和母树林的有性繁 殖为主。然而，有性繁殖存在着分化的问题，不能最大限度地提高遗传改良增益，而无性繁 殖却能克服有性繁殖的上述不足。但马尾松的传统无性繁殖技术(扦插和嫁接)目前仍难 满足造林的需求，制约了马尾松良种繁育的进程。 采用组织培养技术繁殖植物可以得到很高的繁殖效率，植物组织培养技术是利用 植物细胞全能性(即每个细胞具有该植物的全部遗传信息，在一定培养条件下离体细胞具 有发育成完整植株的潜在能力)，采取植物体上的细胞团、分生组织或营养器官的微小部 分，通过人工配制不同营养成分和激素调控，使这些组织细胞形成成千上万小植株并且保 存母体内全部优良遗传性状，此种方法可在短时间内获得大量试管苗，可在车间内进行，实 施工厂化生产，获得的幼苗存放在人工控制的培养室内，可一年四季进行生产。而且在极少 的面积内进行大规模生产，因而不占用土地。如果利用组织培养技术繁殖马尾松，不仅为扩 大繁殖马尾松良种提供了一个新的途径，也可为马尾松分子设计育种创造条件，意义重大。
然而马尾松组织培养较难，诱导产生的芽不易分化伸长，且小苗生根率极低。黄健 秋、卫志明等对马尾松成熟胚进行体细胞胚胎诱导并获得再生植株，共诱导产生27个子叶 胚，最终只产生2株完整小植株，其余均只能稍伸长或停止生长，体细胞胚转换成小植株的 频率仅为7. 4%;张宇对马尾松进行组织培养，有一定的芽诱导率，但生根率仅为70%，无法 满足生产的要求。为此，本发明旨在研制适于马尾松成熟胚作为外植体的高效繁殖技术。
三
发明内容
本发明提供了一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术，包括以下几个 步骤 1、不定芽诱导 将马尾松胚从成熟种子中剥离出来，水平接种到芽诱导培养基上，该培养基成份 为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤(6-BA) 0. 5_2. 0毫克/升，最佳浓度为0. 5_1. 0毫克/ 升、萘乙酸(NAA)O. 05-0. 15毫克/升或吲哚乙酸(IBA)O. 05-0. 15毫克/升，最佳浓度为萘 乙酸(NAA)0.05-0. 1毫克/升或喷哚乙酸(IBA)O. 1-0. 2毫克/升、蔗糖30克/升。培养 20天左右，待培养物诱导处芽原基后，即开始下一阶段。
2、芽的分化与伸长 将第1步所得的培养物转移到分化培养基上，分化培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤(6-BA) 0. 5毫克/升、吲哚乙酸(IBA) 0. 05毫克/升、蔗糖30克/升以及 琼脂5. 6-6. 0克/升。培养数30天，待分化出小芽后，即可进行芽的伸长，芽伸长培养基成 份为DCR常规基本培养基、萘乙酸(NAA)0.01-0. 1毫克/升或喷哚乙酸(IBA)0. 01-0. 1毫 克/升或活性炭0-2. 0克/升，最佳萘乙酸(NAA)浓度为0. 02毫克/升、最佳吲哚乙酸浓 度为0. 05毫克/升、最佳活性碳浓度为1. 0克/升，蔗糖30克/升。培养30-40天，待小 苗长到常规生根程序所需高度时，进入以下第3步。
3、生根 将第2步所得的小苗齐根取下，转至常规生根培养基中，生根培养基的成份为DCR 常规基本培养基、萘乙酸(NAA)O. 2-2.0毫克/升或吲哚乙酸(IBA)O. 2-2.0毫克/升，最佳 萘乙酸(NAA)浓度为0.5毫克/升、最佳吲哚乙酸(IBA)浓度为1.5毫克/升，蔗糖30克 /升，培养28-35天，小苗根部开始出现白色的短根，此时，培养基中添加适量活性炭有利于 根的伸长。之后培养30天左右，即可移栽长成正常的马尾松植株。 本发明采用了两种不同于其它针叶树种组织培养的培养基，即诱导培养基和分化 培养基，诱导培养基中激素含量较高，易诱导培养物启动分化出芽原基，芽原基诱导出后， 不宜在高浓度激素水平的培养基上长期培养，否则诱导出的芽宜愈伤化，如及时转入激素 浓度降低的培养基中，有利于芽的分化和伸长。生根阶段，本发明也采用了不同于其它针叶 树种生根的方法，首先，把伸长到适合常规生根高度的小苗，先转移到仅添加活性炭的DCR 基本培养基中培养30天，再转移到生根培养基中进行生根培养，此举可大大提高生根率。 待根长出后，添加lg/L活性炭，有利于根的伸长生长。因活性炭的添加可制造黑暗环境，使 根的生长环境更接近于自然，所以有利于根的伸长生长。 因此采用此发明的培养基有如下优点芽原基启动快、芽分化系数高、苗伸长快、 生长一致且健壮、生根率高、根长且壮、生长周期短、基本无畸形苗。
四
图1DCR+6-苄基嘌呤0. 5毫克/升+吲哚乙酸0. 05毫克/升+蔗糖30克/升培养基 中诱导产生的大量丛生芽。
图2DCR+活性炭1. 0克/升培养基中伸长的芽 图3DCR+NAA0. 5毫克/升培养基中诱导产生的根 图4DCR+活性炭1. 0克/升培养基中伸长生长的根
五具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例 1、取材取马尾松成熟种子，浸泡过夜，并于流水下冲洗干净，用镊子剥去外种壳。
2、材料消毒方法去壳后在超净工作台内用75%乙醇消毒30s，0. 1%升汞灭菌 10-15min，无菌水冲洗3-5次。 3、接种在超净工作台内，用常规无菌操作的方法，用解剖刀和镊子把种胚剥离出 来，水平接种到培养基上，剥离种胚时要细致小心，尽量避免对种胚造成伤害。诱导培养基 组成为DCR+6-苄基嘌呤0. 5毫克/升+萘乙酸0. 05毫克/升+蔗糖30克/升
4
4、芽分化与伸长将离体胚接种到诱导培养基上，15天后就可看到膨大的子叶上 产生的大量芽(图l)，然后将其转移到芽分化培养基上。分化培养基组成为DCR+6-苄基 嘌呤0. 5毫克/升+吲哚乙酸0. 05毫克/升+蔗糖30克/升。 为使马尾松胚培养诱导产生的丛生芽进一步生长与伸长，在培养基中添加适量活 性炭。活性炭能吸附对芽伸长生长不利的次级代谢产物。但过量的活性炭对芽伸长生长受 到抑制，这可能是由于活性炭在吸附有害物质的同时也吸附了矿质元素。芽伸长生长的培 养基成分为DCR+活性炭1. 0克/升，此培养基促进了芽伸长生长(图2)。
5、生根当分化出的丛生芽长到常规生根所需高度时，用剪刀单个剪下，接种到生 根培养基中。生根培养基的为DCR+NAA0. 5毫克/升，此培养基有利于诱导生根(图3)。
为使诱导出的根能更好地伸长生长，将生根小苗转移到根伸长培养基中，根伸长 培养基的成份为DCR+活性炭1. 0克/升，在此培养基中根伸长生长明显(图4)。
培养温度及光照条件温度为25±rC ;光照为2000勒克斯，16小时/天。
6、移栽生根小苗生长35天左右后，根系比较发达，一般会长出4-5条主根，主根 上会有须根的产生，此时可进行移栽。 移栽的方法是先把封口膜打开，在培养室内炼苗1周左右，取出小苗，洗净小苗 根部的琼脂，移栽到蛭石和砻糠灰混合的基质里(基质使用前已高压灭菌)，浇足水后放到 培养室，覆盖塑料薄膜，24小时后打开薄膜，换气两次，以后每天延长打开时间，直到完全不 覆盖为止。选择生长旺盛，茎干较粗，外形好的小苗移栽，成活率可大大提高。
权利要求
一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术，其特征在于以下三个部分组成(1)不定芽诱导将马尾松成熟离体胚，接种到诱导培养基上，该培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤0.5-2毫克/升、萘乙酸0.05-0.15毫克/升或吲哚乙酸0.05-0.15毫克/升、蔗糖30克/升。培养20天左右，待培养物诱导处芽原基后，即开始下一阶段；(2)芽的分化与伸长将第1步所得的培养物转移到分化培养基上，分化培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤0.5毫克/升、吲哚乙酸0.05毫克/升、蔗糖30克/升以及琼脂5.6-6.0克/升。培养数天，待分化出小芽后，即可进行芽的伸长，芽伸长培养基的成份为DCR常规基本培养基、萘乙酸0.01-0.1毫克/升或吲哚乙酸0.01-0.1毫克/升或活性炭0-2.0克/升、蔗糖30克/升。培养30-40天，待小苗长到常规生根程序所需高度时，进入以下第3步；(3)生根将第2步所得的小苗齐根取下，转至常规生根培养基中，生根培养基的成份为DCR常规基本培养基、萘乙酸0.2-2.0毫克/升或吲哚乙酸0.2-2.0毫克/升、蔗糖30克/升，培养28-35天，小苗根部开始出现白色的短根，此时，培养基中添加适量活性炭有利于根的伸长。之后培养30天左右，即可移栽长成正常的马尾松植株。
2. 按权利要求1所述的马马尾松离体胚丛生芽诱导及植株再生，其特征在于所述的 诱导培养基中6-苄基嘌呤0. 5-2. 0毫克/升、萘乙酸0. 05-0. 15毫克/升或吲哚乙酸 0. 05-0. 15毫克/升、蔗糖30克/升。
3. 按权利要求1所述的马尾松离体胚丛生芽诱导及植株再生，其特征在于所述的伸长 培养基中萘乙酸0. 01-0. 1毫克/升或吲哚乙酸0. 01-0. 1毫克/升或活性炭0-2. 0克/升、 蔗糖30克/升。
4. 按权利要求1所述的马尾松离体胚丛生芽诱导及植株再生，其特征在于所述的生根 培养基中萘乙酸0. 2-2. 0毫克/升或吲哚乙酸0. 2-2毫克/升、蔗糖30克/升。
全文摘要
一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术，发明人季孔庶、王金玲以马尾松成熟胚为外植体建立起了一项包括丛生芽诱导、伸长和生根的植株再生技术。丛生芽诱导以DCR+6-BA1.0毫克/升+NAA 0.1毫克/升效果最佳，诱导率高达90.63％；DCR+AC1.0克/升的培养基能促进丛生芽伸长，且效果最佳；生根培养以DCR+NAA0.5毫克/升的诱导效果最佳，生根率达92.5％；培养基中添加1.0克/升活性炭有利于根的进一步伸长生长。
文档编号A01H4/00GK101785430SQ20091023425
公开日2010年7月28日 申请日期2009年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者季孔庶, 王金玲 申请人:南京林业大学