专利名称：一种菌根食用菌菌种的分离培养方法
技术领域：
本发明涉及真菌的技术领域，具体地说是一种用于生产菌根食用菌子实体为目的 的菌种的分离和培养的方法。
背景技术：
目前菌根菌的大多数可食用子实体都是著名的食用菌，其价格极其昂贵。如松 □蘑(Tricholoma matsutake)、黑孢块菌(Tubermelanosporum Vitt.)、意大禾丨J 白块菌 (Tuber magnatum)、松乳 (Lactarius deliciosus)、红汁乳 (L. hatsudake)、美味牛 月干lif (Boletus edulis)lif (Amatanita caesarea) > φ^pi^M (Tuber sinense K. Tao et Liu)、印度块菌(Tuber indicum Cooke etMassee)、鸡油菌(Cantharellus cibarius Fr.) > zF Ei lif (The 1 ephoraganbajun Zang) > Χ 1 1 |if (Clavulinopsis miyabeana(Ito. )Ito.)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus (L. :Fr.) Gray)、厚环乳牛肝 菌(Suillus greviller(KL.) sing.)> 变绿红 (Russulavirescens(schaeff.)Fr.) > 澄盖鹅膏(Amanita caesarea (Scop :Fr. ) Pers. ex schw.)、玉蕈离裙伞(Lyophyllum shimeji (kawam.)Hongo)、烟色离裙伞(Lyophyllum fumosum(Pers. :Fr.) Orton)等，还有 灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea Hongo)、亚稀裙11 (Russula subnigricans Hongo)等 极具经济价值的毒菌。但是对其菌种的分离培养一直是一个难题，因其独具的特性，在现有的技术条件 下，不能象广泛栽培的腐生食用菌(如香菇、木耳等)那样进行分离培养，培养基在其中扮 演了十分重要的角色。目前在外生菌根菌分离和培养的过程中，主要使用的是MMN培养基， 此培养基在培养一些林业上常用的比较容易培养的菌根菌时，比较适用，但还是有很多经 济价值较高的菌根食用菌在这个培养基上较难以生长，或生长很慢；另外一个培养基就是 腐生菌及其它一些微生物培养中经常用到的PDA培养基，但大多数菌根菌在此培养基上难 以生长；后来人们又将这两种培养基按一定比例配制，用于菌根菌的培养，使许多菌根菌的 分离与培养的成活率和生长速度得到提高，但菌丝较在MMN上要老化快得多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于菌根食用菌菌种分离和培养的培养基及方法，它 可丰富现有外生菌根菌菌种分离培养的培养基和方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案是一种外生菌根菌菌种分离和培养方法， 其特征在于所述的菌根菌菌种的分离和培养方法包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子 实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体，培养室的温度为15-25°C，根据菌丝的生长速度培 养25-35天，直到菌丝体长满培养基表70-80%，放入1_15°C的冰箱中保存备用；b、将以上 培养好的菌丝体转入琼脂培养基中继续培养或将菌丝体接入液体培养基中培养，培养条件 为150 180r/min，温度为20_28°C，湿度65%，培养7_14天，直到培养基颜色透明，并略带 淡黄色时为止；c、将上述液体培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝球直径达到0. 2-1. 5cm为止；d、将以上培养好的菌丝体放在合适的培养 条件下培养出菇，其出菇培养条件为温度为20-28°C、光照100-600LUX的培养室内静置培养。我们对菌根菌生长条件的分析，在培养基中加入一些天然的物质，用于菌根菌的 培养，使其分离成活率及转管成活率得到大的提高，并成功培育出子实体。使用时，本发明 的方法经多种菌根食用菌菌种的分离和几个牛肝菌菌种的培养实验表明，是一种操作简单 有效，效率高的方法，很适宜于在外生菌根菌菌种的分离、生理生化及子实体出菇试验研 究过程中推广应用，具有较高的应用价值，其分离成活率由用现有技术的20-30%提高到 90% -100%以上，部分菌根菌还可形成子实体。
图1为分离培养的美味牛肝菌菌丝体效果2为本发明培育出的美味牛肝菌子实体效果图
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。本发明一种外生菌根菌菌种的分离和培养方法，其特征在于所述的外生菌根菌 菌种的分离和培养方法包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中 培养菌丝体，其中琼脂培养基组成如下=MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；KH2Po4,0. 4 0. 65g ； Cacl2,0. 03 0. 07g ；酒石酸铵，0. 51 1. Og ；维生素B1,80 200 μ g ；Fecl3 ·6Η20，0· 012 0. 036g ；葡萄糖，10 30g ；杉木根煮汁，300 380mL ；马铃薯煮汁，200 450mL ；琼脂 条，15 20g ；补蒸馏水至lOOOmL，pH5. 1 5. 8 ；b、将以上培养好的菌丝转入琼脂培养基 中培养或将菌丝体接入液体培养基中培养，其中液体培养基组成如下柠檬酸，0. 5 2g ； KH2PO4,0. 5 2g ；MgSO4 · 7Η20，0· 5 2g ；CaCl2, 30 80mg ；FeCl3 · 6H20, 30 80mg ；矿物 质混合液，5 15mL ；维生素混合液，5 15mL，蒸馏水，IOOOmL ；pH 5 6。其中矿物质混 合液组成ZnSO4 · 7H20, 300mg ；NiSO4 · 6H20, 200mg ；CuSO4 · 5H20, IOOmg ；MnS04 · 5H20, 50mg ； CoS04 WH2OJOmg ；蒸馏水，IOOOmL ；维生素混合液组成维生素Bl，300mg ；烟酸，5mg ；叶酸， 3mg ；生物素，5mg ；盐酸吡哆醇，0. 5mg ；硫酸腺嘌呤，3mg ；氯化胆碱，3mg ；蒸馏水IOOOmL ；C、 将上述培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝球 直径达到0. 2-1. 5cm为止；d、将以上培养好的菌丝体放在培养室培养出菇，a步骤中，将 菌根菌的孢子或子实体组织放在琼脂培养基上，放入培养室中培养，直到长出菌丝球直径 达到0. 2-1. 5cm的菌丝体，培养室的温度为15-25°C，菌丝的生长速度为25-35天，然后放 入1-15°C的冰箱中保存备用。b步骤中，具体为将配制好的琼脂培养基20 50mL、液体培 养基约IOOmL分别装入容量为250mL的三角瓶中，用一层透气性封瓶膜，外加2层报纸封 口，并用橡皮筋扎紧，1 X IO5Pa灭菌30min，将前述培养好的菌根菌菌丝体用手术刀切割成 5mmX 5mm的菌丝块，将2个接种块分别接入装有以上琼脂培养基的三角瓶中，接种好菌种 的琼脂培养基放入培养室中培养；每个液体培养基三角瓶中接入10个接种块，接种好菌种 的液体培养基放入到往返式摇床上培养，培养条件为150 180r/min，温度为20-28°C湿度 65%，培养7-14天。c步骤中，将菌丝体勻质并接入与b步骤中相同的液体培养基中培养，培养条件为为温度20-28°C、湿度65%，转速150-180转/分钟，培养7_21天，直到菌丝球 直径达到0. 2-1. 5cm左右为止。d步骤中，将培养好的菌丝球放在合适的培养条件下培养出 菇，其出菇培养条件为温度为20-28°C、光照100-600LUX的培养室内静置培养。本发明者在试验调查过程中发现，在松杉针阔混交林中，牛肝菌分布较多，固在牛 肝菌菌丝的分离与培养过程中，加入了杉木根系的煮液，设计了 PCA琼脂培养基，牛肝菌在 PCA琼脂培养基上获得了很高的分离成活率，而且能形成比其它培养基多得多的原基，并能 部分形成子实体。还针对菌根菌类不能分解纤维素等多糖，但是能利用淀粉的营养特点，设 计培养基时，加入一定量的马铃薯汁，取得较好的效果。我们根据这一发现发明设计了这样 一种菌种分离和培养的方法。实施例1美味牛肝菌的分离和培养方法具体操作步骤如下a、将美味牛肝菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养 菌丝体(见图1)，琼脂培养基组成如下=MgSo4 · 7Η20，0· 2g ；KH2Po4,0. 6g ；Cacl2,0. 05g ；酒 石酸铵，0. 8g ；维生素B1,150 μ g ；Fecl3 · 6H20，0. 02g ；葡萄糖，20g ；杉木根煮汁，300mL ；马 铃薯煮汁，300mL ；琼脂条，20g ；补蒸馏水至lOOOmL，pH5. 5 ；培养室的温度为23°C，培养35 天，菌丝体长满培养基表面80%时，放入5°C的冰箱中保存备用；b、将以上培养好的菌丝 体转入液体培养基中培养，液体培养基组成如下柠檬酸，Ig ；KH2PO4, Ig ；MgSO4 · 7H20, Ig ； CaCl2, 50mg ；FeCl3 · 6H20, 50mg ；矿物质混合液，IOmL ；维生素混合液，10mL，蒸馏水，IOOOmL ； PH 5.5 ;c、将上述液体培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入上述液体培养基中培养，直 到菌丝体的菌丝球直径达到0. 8cm左右为止；d、将以上培养好的菌丝体放在合适的培养条 件下培养出菇，其合适的出菇培养条件为温度为25°C、光照400LUX的培养室内静置培养。结果1 :7天后在接种块上有大量的原基发生，15天-30天间在一个三角瓶内有子 实体形成(见图幻，子实体周围分泌有大量的褐色色素，其中一个子实体有12mm高，后经过 继续培养，25天时在此三角瓶中又有一个子实体形成，长入培养基中，发育成畸形。子实体 发育首先粘胶状，软质，细针管状，透明，后转成乳白色原基，周围有白色水珠，进而分泌褐 色素，条件不满足时则停止发育，转成黄色，并硬化，条件合适时发育成子实体，子实体菌盖 灰白色，菌柄黄白色，基部膨大，基部周围色素较浓。结果2 液体培养基培养静置培养7天时，在培养基的表面有白色菌丝长出，15 天后，发现有原基形成，顶部膨大状。母株YNB200现保藏于中国农业微生物菌种保藏中心上海食用菌保藏分中心。
权利要求
1.一种菌根食用菌菌种的分离培养方法，其特征在于所述的菌根食用菌菌种的分离 培养方法包括如下步骤a、将目的菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝 体；b、将以上培养好的菌丝转入培养基中培养或将琼脂菌丝体接入液体培养基中培养；C、 将上述液体培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝 球直径达到0. 2-1. 5cm为止；d、将以上培养好的菌丝体放在合适的培养条件下培养出菇。
2.根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌种的分离培养方法，其特征在于所述 步骤a中的琼脂培养基组成如下=MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；KH2Po4,0. 4 0. 65g ；Cacl2, 0. 03 0. 07g ；酒石酸铵，0. 1 1. Og ；维生素 B1,80 200 μ g ；Fecl3 · 6Η20，0· 012 0. 036g ；葡萄糖，10 30g ；杉木根煮汁，300 380mL ；马铃薯汁，200 450mL ；琼脂条， 15 20g ；补蒸溜水至 IOOOmL, ρΗ5· 1 5. 8。
3.根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌种的分离培养方法，其特征在于b步骤和 d步骤中，将培养好的琼脂培养基上的菌丝体和菌丝球放在合适的培养条件下培养出菇，其 出菇培养条件为温度为20-28°C、光照100-600LUX。
4.根据权利要求2所述的一种菌根食用菌菌种的分离培养方法，其特征在于所述的 杉木根煮汁为17克鲜根加水IOOOmL煮沸1小时。
全文摘要
本发明涉及一种菌根食用菌菌种的分离与培养方法，其特征为所述的菌根食用菌菌种的分离培养方法包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将以上培养好的菌丝转入琼脂培养基中培养或将琼脂菌丝体接入液体培养基中培养；c、将上述液体培养的菌丝体经匀质器匀质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝球直径达到0.2-1.5cm为止；d、将以上培养好的菌丝体放在合适的培养条件下培养出菇。本发明的方法经多种菌根食用菌菌种的分离培养实验表明，是一种操作简单有效，效率高的方法，是一个很好的培养基，很适宜于在大量外生菌根菌菌种的分离培养中推广应用，具有显著的经济效益。
文档编号A01G1/04GK102106234SQ200910247490
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者付绍春, 尚晓冬, 张美彦, 谭琦 申请人:上海市农业科学院