专利名称：：一种适冷微生物及其在植物抗逆方面的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种南极适冷细菌Pseudoaltermonassp.S-5及其发酵产物在植物抗逆方面的应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：来源于南极的适冷细菌Pseudoaltermonassp.S_5，属于假交替单胞菌属。菌体呈杆状，生理生化鉴定结果表明，该菌革兰氏染色阴性，兼性厌氧，氧化酶、接触酶、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应呈阳性；硝酸盐还原反应、吲哚试验、明胶液化试验、H2R试验、MR试验、VP试验、0NPG试验、鸟氨酸脱梭酶反应均呈阴性。极地海冰和深海中的适冷微生物形成了复杂的生理和代谢机制，以适应海冰的低温、高盐和弱光环境。现已筛选出多种极地微生物代谢所产生的独有的适冷、抗盐活性物质，其中一大部分物质具有形成机械屏障、降低冰点等保护微生物在低温下不受伤害的作用。极地微生物冰活性物质的获得和应用，对于农作物抗冻具有重要的应用前景。极地微生物冰活性物质的研究表明，很多该类型物质为糖类或糖和蛋白质的复合物，其中糖类占主要成分。适冷细菌Pseudoaltermonassp.S-5的发酵液预处理能够减轻低温对绿豆幼苗的损伤，增加遭遇倒春寒大田果树仁用杏的结果率(发酵液稀释100倍，好果率达32.3%;对照仅有14.4%;以黄瓜幼苗为材料，进一步研究了南极微生物提高植物抗冻性的物质为胞外多糖或胞外糖蛋白，其分子量大于12000Da)。进一步研究开发以极地或深海微生物代谢产物为主要成分的作物抗冻剂，开拓极地及深海微生物活性物质在植物及农作物抗冷方面的应用。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种适冷微生物及其在植物抗逆方面的应用。一种适冷细菌S-5(Pseudoaltermonassp.S-5)，该微生物已于2009年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC3433。由上述南极适冷细菌S-5制备的抗冻活性物质，其特征在于，通过如下步骤制备1)将南极适冷细菌S-5活化后，接种于试管液体培养基中，8t:培养24小时，按lwt^量接种于Zobe112216E液体培养基扩大培养，得扩繁菌种；2)将步骤1)制得的扩繁菌种按8-12wt^的接种量，接种于液体发酵罐中的发酵培养基，7-9t:有氧搅拌培养50-60h，搅拌速度50-150r/min，得液体发酵液；3)将步骤2)制得的液体发酵液在12000r/min下离心15min，收集上清液，即得抗冻活性物质。所述的试管液体培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，海水余量，pH7.0。所述的Zobell2216E液体培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨0.5%，酵母粉O.1%，海水余量，pH7.0。所述步骤2)中搅拌过程中，向发酵培养基加入0.3wt^量的灭菌豆油。灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。所述的发酵培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，葡萄糖lwt^，海水余量，pH6-7。所述海水取自青岛海域。上述南极适冷细菌S-5的抗冻活性物质在植物抗逆环境改良方面的应用。优选的，通过将上述抗冻活性物质与水混合稀释20-200倍，然后喷施于豆类、蔬菜类及果树类作物表面。进一步优选的稀释倍数为100倍。本发明通过大量的实验证明，抗冻活性物质中含有大量的多糖和糖蛋白成分，这些成分是提高植物抗冻性的活性组分。以稀释的抗冻活性物质处理豆类、蔬菜类及果树类作物，都能够有效保护作物，显著减轻冻害对作物的损害。具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例1适冷微生物的扩大培养及抗冻物质的制备(1)菌种的培养适冷细菌S-5(Pseudoaltermonassp.S-5)，于2002-2003年第十九次中国南极科学考察采集的海冰中分离获得，该微生物已于2009年11月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC3433。菌种以甘油法放入-S(TC保存。以Zobell2216E固体培养基活化后，接种于试管液体培养基中，8"C培养24小时，按lwt^量接种于含有50mlZobe112216E液体培养基的150ml的三角瓶中扩大培养，培养箱的转速为160r/min，得扩繁菌种。试管液体培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，海水余量，pH7.0。Zobell2216E液体培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨O.5%，酵母粉0.1%，海水余量，pH7.0。(2)菌株的发酵将(1)制得的扩繁菌种以10wt^的接种量，接种于IOOL发酵罐并搅拌均匀(培养基葡萄糖lwt^，海水余量，pH6)。发酵温度利用外接冰水混合物作为循环水冷却罐内温度，保持在7-9t:，通过空气压縮机向罐内通入压縮空气，以提供发酵过程中需要的氧气，不断搅拌，搅拌速度为100r/min，用灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。(3)抗冻物质的提取办法以发酵液中的多糖及糖蛋白为指标，发酵60h后，发酵液中的多糖含量达到最高，停止发酵，发酵液在12000r/min离心15min，收集上清液，即得抗冻活性物质，放入4"C下存放。实施例2抗冻活性物质对杏扁抗霜冻的影响因为杏扁的花期和幼果期在4月中下旬，而张家口坝下的晚霜在5月上中旬，因此，冻花冻果成了影响张家口杏扁产量的主要因素，往往一夜之间，遭到强冷空气侵袭，杏扁的损失达到上亿元。在河北蔚县以IOO倍稀释抗冻活性物质喷施的大杏扁树(品种龙王帽)，分别于4月8日及4月18日分别用100倍稀释抗冻活性物质喷施两次。于5月20日调查杏扁好果率，发现处理组的好果率为32.3%，而对照组的好果率仅为14.4%，显著提高了杏扁树的抗冻能力，增加了坐果能力。实施例3抗冻活性物质对绿豆抗冻性的影响以100倍抗冻活性物质处理2叶期绿豆幼苗24h后(对照喷施相同量的蒸馏水)，放入-3。C下冷冻处理，于处理12、14、16、18、20、22、24、36、38、40、42和44h后调查冻伤率。结果如表1所示，低温处理12h时，低温对植物造成了伤害，对照组有15%的植株叶片和茎呈现水渍状，随着低温处理时间的延长至2处时，对照组冻伤率达45%。抗冻活性物质处理显著保护了植物，提高了植物的抗冻性。低温处理18h时，对照组冻伤率高达28%，而处理组的冻伤率仅为7%，抗冻活性物质相对防护率高达75%。低温处理24h内，抗冻活性物质提高植物抗冻能力的效应极为显著，随着低温处理时间的延长，保护效果有所下降。表1抗冻活性物质对绿豆幼苗抗冻性的影响处理时间(h)-相对防效(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例4不同浓度抗冻活性物质对冷处理植物电导率的影响以0、50、100、200、500稀释倍数的抗冻活性物质预处理黄瓜幼苗24h后，将植物材料放入4t:下低温培养24h后测定电导率，(见表2)。50-200倍的稀释倍数的抗冻活性物质都能够显著提高黄瓜幼苗的抗冻性，其中100倍效果最好，其电导率与对照相比，降低了40%，而500倍抗冻活性物质没有抗冻保护作用。表2抗冻活性物质浓度梯度稀释实验电导率值样品相对电导率(％)08.05504.751002.572007.155008.84实施例5抗冻活性物质预处理对低温处理植物细胞膜透性的影响以上清菌液、沉淀菌体、热处理菌液、透析菌液100倍稀释液预处理黄瓜幼苗24h后，将植物材料转入4t:下冷冻36h测定电导率(见表3)。低温处理36h后，对照组的细胞膜透性显著增加，表明低温对植物造成了一定的伤害。除沉淀菌体外，菌液的各分离样品均能保护幼苗子叶中的细胞膜完整性，降低低温对细胞膜的伤害。热处理菌液与上清菌液的保护效果相似，其电导率与对照组相比降低了43%，透析菌液的保护效果略低，与对照组相比其细胞膜完整性高29%。表3菌液预处理对低温处理植物细胞膜透性的影响处理电导率(％)对照6.1热处理菌液3.55沉淀菌体5.4抗冻活性物质3.55透析菌液4.33实施例6抗冻活性物质预处理对低温下植物细胞过氧化程度影响将抗冻活性物质、热处理菌液、透析菌液稀释100倍预处理黄瓜幼苗24h，将幼苗转入4t:环境下培养36h，测定丙二醛(MDA)和游离脯氨酸含量(见表4)。菌液的三种预处理样品都能显著降低黄瓜幼苗子叶中的丙二醛含量，其中透析菌液效果最好，MDA含量与对照相比，下降了35.7%。而经加热菌液处理后，叶片细胞丙二醛含量比抗冻活性物质及透析液处理组有所增高，表明热处理菌液对的黄瓜幼苗叶片细胞膜的保护程度略低。以上结果表明经高温热处理后微生物中抗冷活性物质活性有所降低，且降低程度明显。在三个处理样品中只有抗冻活性物质能使黄瓜幼苗子叶游离脯氨酸含量增加，与对照相比，提高了35%。而热处理菌液及透析菌液处理过的黄瓜叶片中游离脯氨酸含量较低，含量较对照值降低32%，结果表明经抗冻活性物质处理过的幼苗抗冻性显著提高，而加热与透析样品中效果不明显。说明在加热与透析中一些小分子量的耐热性不佳的抗冻活性物质失去活性或丢失。表4菌液预处理对低温下植物细胞过氧化程度和游离脯氨酸的影响6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例7抗冻活性物质预处理对低温处理黄瓜过氧化物酶和多酚氧化酶酶活性的影响将抗冻活性物质、热处理菌液、透析菌液稀释100倍预处理黄瓜幼苗24h，将幼苗转入4t:环境下培养36h，测定过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶酶(PPO)活性的影响(见表5)。在低温胁迫中，SOD和PPO活性的上升是植物对低温伤害开始的防御反应，由此减缓伤害的速度，活性越高植物对逆境的抵抗能力越强。抗冻活性物质对POD活性影响最为显著，为对照组的115.6X;而对PP0来说，热处理菌液的影响最为明显，为对照组的128.7%。透析菌液对两种酶活性的影响较小，两种酶活性都略低于对照。表明，抗冻活性物质及热处理菌液对低温处理植物都有一定的保护作用。表5过菌液预处理对低温处理黄瓜过氧化物酶和多酚氧化酶酶活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种适冷细菌S-5(Pseudoaltermonassp.S-5)，该微生物已于2009年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC3433。2.由上述适冷细菌S-5制备的抗冻活性物质，其特征在于，通过如下步骤制备1)将上述适冷细菌S-5活化后，接种于试管液体培养基中，8t:培养24小时，按lwt%量接种于Zobell2216E液体培养基扩大培养，得扩繁菌种；2)将步骤l)制得的扩繁菌种按8-12wt^的接种量，接种于液体发酵罐中的发酵培养基，7-9t:有氧搅拌培养50-60h，搅拌速度50-150r/min，得液体发酵液；3)将步骤2)制得的液体发酵液在12000转下离心15min，收集上清液，即得抗冻活性物质。3.如权利要求2所述的抗冻活性物质，其特征在于，所述步骤1)中的试管液体培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，海水余量，pH7.0。4.如权利要求2所述的抗冻活性物质，其特征在于，所述步骤1)中的Zobell2216E液体培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，海水余量，pH7.0。5.如权利要求2所述的抗冻活性物质，其特征在于，所述步骤2)中搅拌过程中，向发酵培养基加入O.3wt^的灭菌豆油。6.如权利要求2所述的抗冻活性物质，其特征在于，所述步骤2)中的发酵培养基的配方如下，均为重量百分数蛋白胨O.5%，酵母粉0.1%，葡萄糖lwt^，海水余量，pH6-7。7.上述适冷细菌S-5的抗冻活性物质在植物抗逆环境改良方面的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，通过将上述抗冻活性物质与水混合稀释20-200倍，然后喷施于豆类、蔬菜类及果树类作物表面。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，稀释倍数为100倍。全文摘要本发明涉及一种适冷细菌S-5(Pseudoaltermonassp.S-5)及其发酵产物在植物抗逆方面的应用，属于微生物
技术领域：
。该微生物在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC3433。该微生物发酵产物经稀释后喷施于豆类、蔬菜类及果树类作物表面，能够有效保护作物，显著减轻冻害对作物的损害。文档编号A01P21/00GK101775361SQ20091025603公开日2010年7月14日申请日期2009年12月21日优先权日2009年12月21日发明者丰贵花,张鹏英,李梦南,柳春燕,白云贵,郭默然,陈学文申请人:山东大学